ARG1在制备脓毒症诊断、严重程度判断或预后评估试剂或试剂盒中的应用

calafat et al.arginase i is constitutively expressed in human granulocytes and participates in fungicidal activity.blood.2005 mar 15；105(6):2549-56.)，这提示了arg1可能与脓毒症相关。人arg1基因的ensembl id为ensg00000118520，其蛋白的三种亚型的氨基酸序列见np_001231367.1、np_000036.2和np_001355949.1。
6.目前国内外尚无有关arg1作为脓毒症生物标志物方面的文献报道。


技术实现要素：

7.本发明依托上述研究进行，目的在于提供脓毒症的诊断及预后标志物，本发明的目的也在于提供arg1的新用途，即在制备脓毒症诊断、严重程度判断或预后评估试剂盒中的应用。
8.为了寻找脓毒症患者外周血中特征性的基因作为生物标志物。本发明通过下载并分析脓毒症患者和健康对照的数据集，进行差异表达基因的筛选，然后对差异表达基因分别使用ppi网络分析以及wgcna分析，将两种分析结果取交集，得到了arg1。然后分析arg1在脓毒症精确诊断、严重程度判断以及预后预测等方面的价值，从而发现arg1适合做脓毒症诊断和治疗的生物标志物。
9.具体地，本发明提供了如下技术方案：
10.本发明的第一方面，提供了一种寻找生物标志物的方法，具体包括以下步骤：
11.(1)从gene expression omnibus数据库(在线地址为：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载脓毒症患者和健康对照的基因表达谱数据。
12.(2)将这些表达数据使用limmar包进行基因的差异表达分析。
13.(3)根据每个差异表达基因的表达谱，使用基因加权共表达网络分析(weighted correlation network analysis,wgcna)算法，鉴定出显著性程度较高(即：与临床特征相关性较为密切)的基因。
14.(4)构建蛋白-蛋白相互作用网络(protein-protein interaction network)模型，在差异表达基因所对应的蛋白中，筛选出与其他蛋白存在较多相互作用的蛋白，其基因被称为关键基因。
15.(5)将步骤(4)中ppi网络筛选出的基因，与步骤(3)中wgcna的鉴定出的显著性较高的基因取交集，得到关键的生物标志物。
16.本发明的第二方面，提供了一种考察脓毒症外周血生物标志物性能的方案，具体包括以下步骤：
17.(1)考察该生物标志物在脓毒症患者外周血中的表达水平是否要显著高于健康对照组。
18.(2)考察该生物标志物在严重脓毒症或致死性脓毒症患者外周血中的表达水平要是否显著高于普通的脓毒症患者。
19.(3)考察该生物标志物在脓毒性休克患者外周血中的表达水平要显著高于其他类型休克的患者。
20.(4)考察该生物标志物在在对后续支持性治疗无响应的脓毒症患者外周血中的表达水平是否要显著高于有相应患者。
21.(5)考察该生物标志物在脓毒症造模小鼠外周血中的表达是否要显著高于假手术
组小鼠。
22.本发明的第三方面，提供了arg1作为脓毒症标志物的应用，具体是在精确诊断、严重程度判断以及预后评估等方面作为生物标志物的应用，更具体是在制备脓毒症诊断、严重程度判断或预后评估试剂或试剂盒中的应用。
23.在本发明中，所述的arg1指的是一个基因及其对应的蛋白。该基因位于人第6号染色体上，具体位置为6q23.2，外显子数为8，ensembl id为ensg00000118520。其对应的蛋白三种亚型的氨基酸序列见np_001231367.1、np_000036.2和np_001355949.1。
24.在本发明中，所述的脓毒症是由于宿主对感染的反应失调而导致的危及生命的多器官功能障碍疾病。所述的生物标志物是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标。
25.优选的，上述严重程度判断试剂或试剂盒为判断是否为严重或致死的脓毒症的试剂或试剂盒，或者为进一步判断是否为脓毒性休克的试剂或试剂盒。
26.实验结果显示，相较于健康人群，arg1在脓毒症患者外周血中显著高表达；在严重或致死的脓毒症患者外周血中转录丰度显著高于普通脓毒症患者，通过arg1基因的表达量有助于判断脓毒症病情的严重程度；在脓毒性休克(一种严重的脓毒症)中的表达水平显著高于非脓毒性休克。鉴于脓毒性休克与非脓毒性休克具有相似的症状，在临床实践中，arg1作为生物标志物对这两类病情的区分具有重要价值。
27.优选的，诊断或预后评估试剂为检测生物样品中arg1表达量的试剂；所述试剂盒包含了检测生物样品中arg1含量的试剂。
28.进一步，所述的检测生物样品中arg1含量的试剂选自：对arg1基因具有检测特异性的pcr引物，或者与arg1蛋白特异性结合的抗体。其中，对arg1基因具有检测特异性的pcr引物如seq id no.1～4所示。
29.arg1-f引物：tcacctgagctttgatgtcga(seq id no.1)；
30.arg1-r引物：tgaaaggagccctgtcttgta(seq id no.2)；
31.gapdh-f引物：tcaccatcttccaggagcgagac；(seq id no.3)；
32.gapdh-r引物：agacaccagtagactccacgacatac(seq id no.4)。
33.进一步，所述的生物样品获自对象的外周血。
34.本发明的第四方面，提供了一种脓毒症诊断、严重程度判断或预后评估试剂盒，该试剂盒包含了检测生物样品中arg1含量的试剂。
35.优选的，该试剂盒是由逆转录系统、引物系统和扩增系统组成，所述的引物系统包括如seq id no.1～4所示的pcr引物。
36.本发明的第五方面，提供了一种利用上述试剂盒进行脓毒症诊断、严重程度判断或预后评估的方法，如下：
37.a.将待检血液样本常温离心，获取血浆，提取血浆中的总rna并测定血浆纯度；
38.b.对步骤a中的总rna进行逆转录，得到cdna；
39.c.采用实时荧光定量pcr对arg1的拷贝数进行定量检测，检测过程中所用引物如seq id no.1～4所示。
40.数据均采用spss16.0处理，采用平均值
±
标准差的方式表示。
41.相比于现有技术，本发明的有益效果如下：
42.首先，就方法而言，本发明提供了一种生物标志物的鉴定方法，能够利用公开、免费的数据集，通过生物信息学分析，快速寻找到生物标志物。同时，本发明提供了一种考察脓毒症外周血生物标志物性能的方案，能够利用生物信息学数据集和实验小鼠，较为快速地考察和验证一个生物标志物在脓毒症精确诊断、严重程度判断以及预后预测等方面的性能。此外，本发明发现arg1可以作为脓毒症的一个“多功能”生物标志物，这有利于脓毒症患者病情的精确诊断以及预后的快速预测，从而有利于脓毒症患者的快速分层和及时治疗。
43.其次，就技术而言，arg1的检测本质上是一种血液基因组的定量pcr检测，具有操作简便、检测灵敏、特异性好、重复性高等特点，现今已越来越多地被应用于临床检验技术中。本发明所采用基本检测方法是定量pcr，这一技术在现代实验诊断学中已被证实是高灵敏度、高准确度的检测方法，试验技术已经十分成熟，并且我们采用的是这一技术中的标准曲线定量法，可以准确地对各种样品中核酸分子做精确定量。
44.第三，就效果而言，本发明所涉及的指标arg1在脓毒症患者外周血中显著高表达，在严重或致死的脓毒症患者外周血中转录丰度显著高于普通脓毒症患者，在脓毒性休克中的表达水平显著高于非脓毒性休克，且差异具有统计学意义(p《0.05)，其临床参考价值和可信度较高。不仅可以通过arg1基因的表达量有助于判断脓毒症病情的严重程度，而且对于症状相似的脓毒性休克与非脓毒性休克的区分具有重要价值。
45.第四，就检测方式而言，只需要采集检测者的血液即可获得检测结果，操作简单、无创，患者的接受程度高。
附图说明
46.图1是使用wgcna算法，根据基因的表达模式，将脓毒症患者外周血中的差异表达基因划分为4个模块(基因群)，分别以纹理以及表示，灰色是没能划分进任何模块的散在基因。
47.图2是每个基因模块与临床诊断(脓毒症或对照)的相关系数，其中，相关系数在方格中展示，相关系数的绝对值越大，则模块颜色越深。除了模块1(module 1)是负相关外，其余都是正相关。
48.图3是脓毒症差异表达基因所对应的蛋白构成的蛋白-蛋白相互作用网络，其中深灰色代表上调基因，浅灰色代表下调基因。
49.图4是寻找ppi网络筛选与wgcna分析结果中的共有基因。结果显示，arg1是两个结果中唯一的共有基因。
50.图5显示了arg1在脓毒症患者外周血中高表达：分别使用了gse95233、gse134347、gse154918、gse13015、gse60424、gse131761这六个成人数据集以及gse8121、gse26378、gse26440、gse145227这四个儿童数据集来说明arg1在脓毒症患者外周血中的高表达。每个数据集对应的箱式图显示无论是成人患者还是儿童患者，arg1在外周血中都出现了显著的高表达。每个箱式图下方都有roc曲线，roc曲线的曲线下面积也等于或接近于1，证明arg1具有较为良好的灵敏度和特异性，有作为生物标志物的潜力。***表示脓毒症组和对照组相比较，有统计学差异(p《0.001)。
51.图6显示了arg1在脓毒性休克中的表达水平要显著高于非脓毒性休克：分别使用
gse131411和gse131761两个数据集通过绘制箱式图证实了arg1在脓毒性休克(一种严重的脓毒症)中的表达水平要显著高于非脓毒性休克。鉴于脓毒性休克与非脓毒性休克具有相似的症状，在临床实践中，arg1作为生物标志物对这两类病情的区分具有重要价值。***表示脓毒性休克组和非脓毒性休克组相比较，有统计学差异(p《0.001)；*表示脓毒性休克组和非脓毒性休克组相比较，有统计学差异(p《0.05)。
52.图7显示了arg1基因在严重或致死的脓毒症患者外周血中转录丰度要显著高于普通脓毒症患者：分别使用了gse63042和gse154918两个数据集通过绘制箱式图证实了arg1基因在严重或致死的脓毒症患者外周血中转录丰度要显著高于普通脓毒症患者。这说明，arg1基因的表达量有助于判断脓毒症病情的严重程度。***表示普通脓毒症组和脓毒性休克组相比较，有统计学差异(p《0.001)；*表示普通脓毒症和严重或致死性脓毒症组相比较，有统计学差异(p《0.05)。
53.图8显示了arg1在对后续治疗无响应的脓毒症患者外周血中显著高于有响应的患者：使用gse110487这个数据集，通过绘制箱式图证实了arg1在对后续治疗无响应的脓毒症患者外周血中显著高于有响应的患者，说明arg1的表达水平有助于预测脓毒症患者对后续的支持性治疗是否会有响应，体现出其作为生物标志物的良好性能。**表示对后续治疗无响应的脓毒症患者和对后续治疗有响应的脓毒症患者相比较，有统计学差异(p《0.01)。
54.图9是使用实时荧光定量pcr的方法，从实验层面确证了arg1在脓毒症小鼠外周血中的表达水平要显著高于假手术组小鼠。***表示对脓毒症小鼠和假手术组小鼠相比较，有统计学差异(p《0.01)。
具体实施方式
55.现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
56.本发明所用c57bl/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。
57.本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的分析方法和实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
58.实施例1：脓毒症患者外周血差异表达基因的筛选
59.本发明在geo数据库(在线地址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中，找到了四个基因表达谱数据集，编号分别是gse28750、gse57065、gse65682、gse69528，每个数据集内都包含脓毒症患者外周血样本(实验组)以及健康人外周血样本(对照组)。下载每个数据集的基因表达谱。
60.在microsoft windows 1064位操作系统上，从r语言主页(在线地址为：www.r-project.org)下载r 4.1.2版本后，按照提示进行默认安装。在集成开发环境rstudio主页(在线地址为：www.rstudio.com/)下载rstudio 1.3.1073版本后，按照默认提示进行安装。使用biocmanager::install(“limma”)命令安装limmar模块。然后使用该模块分别对上述四个基因表达谱数据集进行差异表达分析，以log fold change(fc)》1或《-1且adjusted pvalue《0.05为筛选标准，获得每个数据集的上调和下调的差异表达基因。
61.使用在线工具venny 2.1.0(在线地址：https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.ht ml)生成韦恩图，以查找四个数据集中共有的上调和下调差异表达基因，差异表达基因的详细列表如表1所示：
62.表1 脓毒症上调和下调差异表达基因列表
63.64.[0065][0066]
实施例2：脓毒症患者差异表达基因的基因加权共表达网络分析
[0067]
在rstudio集成开发环境中，使用biocmanager::install("wgcna")命令安装wgcna的r包。对于每个数据集，使用goodsamplesgenesms函数移除样本数量缺失较多的基因以及基因数量确实较多的样本。接着，使用hclust函数对样本进行聚类分析，并移除过于离群的脓毒症或健康对照样本。下一步，使用picksoftthreshold函数和softconnectivity函数调整软阈值，使后续网络中基因与基因之间的连接近似服从无尺度分布，从而使网络更具有生物学意义。然后生成基因表达相关性矩阵，再转化为邻接矩阵，再进一步转化为拓扑重叠矩阵而得到共表达网络。然后进行基因的层次聚类分析，使用动态切割树算法，将表达模式相近的基因划分到同一个模块，计算每个模块与临床诊断(脓毒症或健康对照)之间的皮尔逊相关系数(pearson correlation coefficient)。最后，计算在最相关的模块中，每个基因的表达模式与临床诊断之间的皮尔逊相关系数作为基因的显著性程度(gene significance，gs)。
[0068]
基因的模块划分如图1所示，每个模块与临床特征的皮尔逊相关系数如图2所示。显著性程度较高的基因如表2所示。
[0069]
表2 使用wgcna分析所得到的与临床特征关系最密切(显著性程度最高)的15个基因
[0070][0071][0072]
实施例3：脓毒症患者差异表达基因的蛋白-蛋白相互作用网络的构建
[0073]
打开string数据库(在线地址：https://string-db.org/)，将上述筛选出的脓毒症患者的差异表达基因列表导入至该数据库中，构建蛋白-蛋白相互作用网络(protein-protein interaction network，ppi network)。使用cytoscape软件(版本：3.8.2)将该网络可视化。然后使用cytoscape中的mcode插件识别与其他蛋白存在较多相互作用的蛋白。这些蛋白更有可能处在脓毒症致病过程中的核心位置，因而其对应的基因更加关键。
[0074]
蛋白-蛋白相互作用网络如图3所示，与其他蛋白存在较多相互作用的蛋白其对应的基因名称列表如表3所示。
[0075]
表3 ppi网络模型鉴定出来的相互作用较多的蛋白汇总
[0076][0077]
实施例4：ppi网络筛选与wgcna分析结果中共有基因的寻找
[0078]
使用在线工具venny 2.1.0(在线地址：https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.ht ml)生成韦恩图，以查找在ppi网络筛选所得蛋白其对应的基因，与wgcna分析所得的基因中，是否存在交集。
[0079]
结果如图4所示，表明arg1基因是两种生物信息学方法所得结果中的共有基因。
[0080]
实施例5：arg1在区分脓毒症与健康对照方面的性能考察
[0081]
使用biocmanager::install("ggplot2")命令安装ggplot2的r包。使用该r包来生成数据集中的基因相对表达量的柱状图。
[0082]
使用biocmanager::install("proc")命令安装proc的r包。使用该r包来生成每个数据集中受试者工作(receiver operating characteristic,roc)曲线图，并计算曲线下面积(area under curve)。
[0083]
上述所使用的数据集包括了成人数据集gse95233、gse134347、gse154918、gse13015、gse60424、gse131761以及儿童数据集gse8121、gse26378、gse26440、gse145227。
每个数据集中都包含了脓毒症患者以及健康人对照或对照组病人。
[0084]
结果如图5所示，显示arg1基因在脓毒症患者的外周血中转录丰度都显著高于对照组，其roc曲线的曲线下面积也等于或接近于1，证明arg1具有较为良好的灵敏度和特异性，有作为生物标志物的潜力。
[0085]
实施例6：arg1在区分脓毒症和症状类似疾病方面的性能考察
[0086]
gse131411和gse131761两个数据集都包含脓毒性休克以及非脓毒性休克患者的外周血样本。本发明继续使用limma r包来生成这两个数据集中的arg1相对表达量的柱状图。
[0087]
结果如图6所示，显示arg1基因在脓毒性休克患者外周血中转录丰度显著大于非脓毒性休克。由于脓毒性休克是脓毒症的一种严重形式，并且与非脓毒性休克具有相似的症状，在临床实践中，arg1作为生物标志物对这两类病情的区分具有重要价值。
[0088]
实施例7：arg1在区分脓毒症严重程度方面的性能考察
[0089]
gse63042和gse154918两个数据集都包含普通脓毒症患者以及严重或致死性脓毒症患者的外周血样本。本发明继续使用limmar包来生成这两个数据集中的arg1相对表达量的柱状图。
[0090]
结果如图7所示，显示arg1基因在严重或致死的脓毒症患者外周血中转录丰度显著大于普通脓毒症患者。这说明，外周血中arg1的水平有助于判断脓毒症病情的严重程度，从而方便筛选出严重脓毒症的患者给予更具针对性的治疗。
[0091]
实施例8：arg1在预测对脓毒症支持性治疗是否有相应方面的性能考察
[0092]
gse110487是唯一能找到的分析对脓毒症支持性治疗是否有相应的数据集。在这个数据集采样时，首先患者在进入重症监护室时接受了血检，同时将其血液样本送去测序。然后接下来的几天记录了每位脓毒症患者对后续支持性治疗是否存在响应。响应者和非响应者在进入icu接受治疗时，在感染类型、炎症循环标志物或白细胞和淋巴细胞计数等血检结果方面并不存在显著差异(barcella m,bollen p b,braga d,et al.identification of a transcriptome profile associated with improvement of organ function in septic shock patients after early supportive therapy[j].crit care,2018,22(1):312.)。而如图8所示，与有响应的脓毒症患者相比，对后续治疗无响应的脓毒症患者全血中arg1的水平显著较高。这说明脓毒症患者外周血中arg1的水平有助于预测脓毒症患者对后续的支持性治疗是否会有响应，体现出其作为生物标志物的良好潜质。
[0093]
实施例9：动物实验确证arg1在脓毒症外周血中高表达
[0094]
使用c57bl/6小鼠，实验组通过盲肠结扎穿刺(cecum ligation and puncture,clp)实验构建脓毒症模型，以假手术(sham)为对照组。在手术进行24小时后，取小鼠外周血，使用rnafast200试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司)抽提rna后，使用逆转录酶混合物(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)按说明书进行逆转录，然后使用qpcr sybr green master mix(no rox)(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)以gapdh为内参基因进行实时荧光定量pcr实验。引物序列为：
[0095]
arg1-f引物：tcacctgagctttgatgtcga(seq id no.1)
[0096]
arg1-r引物：tgaaaggagccctgtcttgta(seq id no.2)
[0097]
gapdh-f引物：tcaccatcttccaggagcgagac(seq id no.3)
[0098]
gapdh-r引物：agacaccagtagactccacgacatac(seq id no.4)。
[0099]
扩增条件参见表4：
[0100]
表4 扩增条件汇总
[0101][0102][0103]
结果如图9所示，显示arg1在通过clp造模的脓毒症小鼠的外周血中基因表达量要显著高于假手术组(sham组)小鼠。这从实验层面证实了arg1作为脓毒症生物标志物的性能。
[0104]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。
[0105]