一种特异性结合人CD318的VHH抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物免疫治疗，具体而言，涉及一种特异性结合cd318的抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用。

背景技术：

1、cd318，也称为cdcp1(含cub结构域的蛋白1)，该基因编码一种高度糖基化的，单通道i型跨膜蛋白，在间充质干细胞、神经干细胞、成纤维细胞和造血祖细胞中表达。cdcp1由一个大的细胞外结构域(ecd)组成，其中包含三个cub(分别为：补体c1r/c1s，uegf和bmp1)结构域和一个短的细胞内部分，该蛋白在酪氨酸磷酸化依赖性调节中起作用。

2、cd318在多种恶性肿瘤中表达均异常升高，包括结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、肾癌、肝癌等。在造血细胞中，cd318已被鉴定为良性和恶性祖细胞的干细胞标志物。在aml患者涉及白血病干细胞富集的cd34cd133白血病细胞亚群中可观察到明显的cd318表达。因此，cd318是一个非常有前景的肿瘤免疫治疗靶标。

3、嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t cell，car t)疗法是一种针对肿瘤细胞表面特异性抗原的新型免疫治疗方法。vhh抗体又称纳米抗体，是羊驼外周血液中存在的一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(vhh)和两个常规的ch2与ch3区。与传统的人工改造的scfv相比具有分子量小，易于表达，特异性强，亲和力高，对人的免疫原性弱，开发周期短等优势。结合免疫疗法和vhh抗体的优势，能够开发出高效的car-t疗法。

4、目前尚未见如本技术所记载的抗cd318vhh抗体以及含该抗cd318vhh抗体的免疫效应细胞的报道。

技术实现思路

1、本发明提供一种cd318结合分子，包含抗cd318纳米抗体或其抗原结合片段，所述抗cd318纳米抗体的互补决定区cdr包含cdr1、cdr2和cdr3，其中cdr1包括seq idno:1、4、7、10、13和16中任一所示的序列、cdr2包括seq id no:2、5、8、11、14和17中任一所示的序列、和cdr3包括seq id no:3、6、9、12、15和18中任一所示的序列。

2、在一个或多个实施方案中，所述cdr选自以下任一项：

3、(1)序列如seq id no:1所示的cdr1、序列如seq id no:2所示的cdr2、序列如seqid no:3所示的cdr3，

4、(2)序列如seq id no:4所示的cdr1、序列如seq id no:5所示的cdr2、序列如seqid no:6所示的cdr3，

5、(3)序列如seq id no:7所示的cdr1、序列如seq id no:8所示的cdr2、序列如seqid no:9所示的cdr3，

6、(4)序列如seq id no:10所示的cdr1、序列如seq id no:11所示的cdr2、序列如seq id no:12所示的cdr3，

7、(5)序列如seq id no:13所示的cdr1、序列如seq id no:14所示的cdr2、序列如seq id no:15所示的cdr3，

8、(6)序列如seq id no:16所示的cdr1、序列如seq id no:17所示的cdr2、序列如seq id no:18所示的cdr3。

9、在一个或多个实施方案中，所述抗cd318纳米抗体的重链可变区序列如seq idno:19-24中任一所示。

10、在一个或多个实施方案中，所述抗cd318纳米抗体的fr1可选自seq id no:19-24中任一所示的vhh的fr1，fr2可选自seq id no:19-24中任一所示的vhh的fr2，fr3可选自seq id no:19-24中任一所示的vhh的fr3，fr4可选自seq id no:19-24中任一所示的vhh的fr4。

11、在一个或多个实施方案中，所述cd318结合分子是包含一条、两条或多条抗cd318纳米抗体或其抗原结合片段的单价或多价纳米抗体或单域抗体、或多特异性纳米抗体或单域抗体。

12、在一个或多个实施方案中，所述多价结合分子或多特异性结合分子通过连接子连接多个抗cd318纳米抗体或其抗原结合片段。所述连接子由选自g和s的1-15个氨基酸组成。

13、在一个或多个实施方案中，所述纳米抗体是骆驼重链抗体或软骨鱼重链抗体。

14、在一个或多个实施方案中，所述纳米抗体还包含重链恒定区。

15、在一个或多个实施方案中，所述重链恒定区是骆驼重链抗体的恒定区，包含ch2和ch3。

16、在一个或多个实施方案中，所述ch2和ch3是人igg fc的ch2和ch3，例如igg1的ch2和ch3。

17、在一个或多个实施方案中，所述重链恒定区是软骨鱼重链抗体的恒定区，包含ch1、ch2、ch3、ch4和ch5。

18、在一个或多个实施方案中，本发明任一实施方案所述的cd318结合分子为嵌合抗体或完全人抗体；优选为完全人抗体。

19、本发明另一方面提供一种嵌合抗原受体，包含任选的信号肽序列、本文任一实施方案所述的cd318结合分子、铰链区、跨膜区和胞内区。

20、在一个或多个实施方案中，胞内区包括胞内共刺激域和/或胞内信号域。

21、在一个或多个实施方案中，从n端到c端，该嵌合抗原受体依次含有信号肽、本文任一实施方案所述的cd318结合分子、铰链区、跨膜区、胞内共刺激域和胞内信号域。

22、本发明还提供核酸分子，其具有选自以下任一项的序列：

23、(1)本文任一实施方案所述cd318结合分子或嵌合抗原受体的编码序列；

24、(2)(1)的互补序列；

25、(3)(1)或(2)中任一序列的5-50bp的片段。

26、在一个或多个实施方案中，所述片段是引物。

27、本发明还提供一种核酸构建物，包含本文所述的核酸分子。

28、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是克隆载体、表达载体或整合载体。

29、本发明还提供一种宿主细胞，选自：

30、(1)表达和/或分泌本文任一实施方案所述cd318结合分子或嵌合抗原受体；

31、(2)包含本文所述的核酸分子；和/或

32、(3)包含本文所述的核酸构建物。

33、在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞是免疫效应细胞，优选t细胞。

34、本发明还提供一种产生本文任一实施方案cd318结合分子的方法，包括：在适合产生cd318结合分子(例如纳米抗体或其抗原结合片段，单价或多价纳米抗体或单域抗体、或多特异性纳米抗体或单域抗体)的条件下培养本文所述的宿主细胞，和任选的从培养物中纯化所述cd318结合分子。

35、本发明还提供一种药物组合物，包含本文任一实施方案所述cd318结合分子、核酸分子、核酸构建物或宿主细胞，和药学上可接受的辅料。

36、在一个或多个实施方案中，所述药物组合物用于治疗cd318表达相关的疾病或病况。

37、本发明还提供本文任一实施方案所述cd318结合分子、嵌合抗原受体、核酸分子、核酸构建物或宿主细胞在制备活化的免疫细胞(例如t细胞)中的用途。

38、本发明还提供本文任一实施方案所述cd318结合分子、嵌合抗原受体、核酸分子、核酸构建物或宿主细胞在制备用于预防或治疗cd318表达相关的疾病或病况的药物中的用途。

39、在一个或多个实施方案中，所述疾病或病况选自以下的一种或多种：乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、肾癌和结直肠癌。

40、本发明还提供一种治疗或预防cd318表达相关的疾病或病况的方法，所述方法包括给予需要的患者治疗有效量的本发明任一实施方案所述的cd318结合分子或宿主细胞，或本发明任一实施方案所述的药物组合物。

41、本发明还提供一种检测cd318的试剂盒，用于例如评估药物治疗效果或诊断癌症，所述的试剂盒包含本文任一实施方案所述cd318结合分子、核酸分子、核酸构建物或宿主细胞。

42、在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括用于检测cd318与所述cd318结合分子的结合的试剂。例如通过酶联免疫反应法检测所述结合的试剂。

43、在一个或多个实施方案中，所述检测结合的试剂是能与cd318结合分子连接的可检测标记物，例如生物素。所述的可检测标记物被连接于所述cd318结合分子或分离地存在于试剂盒中。

44、本发明还提供一种检测样品中cd318存在情况的非诊断性方法，所述方法包括：以本文任一实施方案所述cd318结合分子与样品孵育，和检测cd318与所述cd318结合分子的结合，从而确定样品中cd318存在情况。所述检测是酶联免疫反应法检测。

45、本发明还提供本文任一实施方案所述cd318结合分子在制备用于检测样品中cd318、评估药物治疗效果或诊断癌症的试剂盒中的用途。

46、本发明具有以下有益效果：

47、本发明提供了一种新的特异性识别cd318的纳米抗体以及含有该抗体的car修饰细胞，该抗体和细胞具有良好的靶向cd318的治疗效果，为与cd318表达相关的疾病提供了新的治疗或改善途径。