一种子宫内膜炎症的类器官体外模型及其建立方法和应用与流程

1.本发明涉及类器官培养技术领域，具体涉及一种子宫内膜炎症的类器官体外模型及其建立方法和应用。


背景技术：

2.类器官(organoids)是一种利用成体干细胞体外培养出的具有3d结构的细胞培养物，与对应的人类器官拥有高度相似的组织学特征，并能重现该器官的生理功能。肿瘤类器官(tumoroids)则是利用患者肿瘤组织体外培养的，与患者肿瘤的结构、生理等高度一致的“微肿瘤”。类器官可作为多种疾病的体外模型，在干细胞与发育、再生医学、疾病研究、药物开发和精准医疗等多个方面拥有广泛的应用前景。类器官模型可以复制肿瘤的组织复杂性与遗传异质性，与诸多临床前模型如2d细胞系、pdx模型等相比，类器官在成功率、维护难度、筛选难度上均表现出了良好的潜力，为从基因或蛋白水平研究类器官致癌或癌症相关机制的研究提供宝贵的模型。
3.子宫内膜炎是指发生于子宫内膜的炎症，常分为急性和慢性两种，临床常见为急性子宫内膜炎，炎症使病原体较易入侵宫腔内，引发感染等造成严重的后果，研究炎症机制将有助于炎症疾病的治疗。目前，子宫内膜炎症模型建立方法已有报道，而在3d子宫内膜类器官炎症模型尚未报道，子宫内膜炎症类器官模型拥有多种细胞类型，可以用于研究细胞间相互作用等基础研究。


技术实现要素：

4.有鉴于此，有必要针对上述问题，提供一种子宫内膜炎症的类器官体外模型及其建立方法和应用。
5.为了解决现有技术存在的问题，本发明采用的技术方案为：
6.第一个方面，本发明提供一种子宫内膜炎症的类器官体外模型的建立方法，包括：
7.①
进行正常组织的子宫内膜类器官培养，获得正常组织的子宫内膜类器官；
8.②
将获得的正常组织的子宫内膜类器官传代培养3天；
9.③
向步骤
②
所述的类器官腔体中注射细菌；
10.④
向步骤
③
获得的培养体系中加入中性白细胞；
11.⑤
向步骤
④
获得的培养体系中加入10-1,000ng/ml的lps作为诱导试剂进行炎症诱导。
12.进一步的，还包括急性炎症模型鉴定：利用qpcr方法鉴定tnf-a、inf-r、il-1b的表达。
13.优选的，所述步骤
③
中注射3-8ul细菌。
14.优选的，所述细菌为大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。
15.优选的，所述步骤
④
中加入10
4-106中性白细胞。
16.进一步的，步骤
①
所述正常组织的子宫内膜类器官培养包括以下步骤：将获得的
子宫内膜标本经过预处理得到细胞数量为30个细胞左右的细胞团；将细胞团与matrigel基质胶混匀后铺板，待凝固后倒置固定20-30min；加入子宫内膜类器官培养基，于37℃、5％co2条件下培养4-7天，期间每隔2-3天更换一次培养基。
17.进一步的，步骤
④
所述中性白细胞是通过血液中性白细胞分离提取获得的，包括以下步骤：
18.将全血使用pbs1:1混匀后，加入2倍体积的葡聚糖dextran t-500并混匀，置于4℃静置40min后取上清按照质量比为1:1的比例加入pbs+tris+hepes缓冲液中，于4℃，500g离心25min后弃上清；使用pbs+tris+hepes缓冲液对沉淀进行清洗，后加入裂红试剂，沉淀与裂红试剂的质量比为1:2，使用hbss清洗2次，并重悬于dmem中备用。
19.进一步的，步骤
③
所述细菌是通过细菌培养扩增获得的，包括以下步骤：从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上；向管中加入1ml lb液体培养基(不含amp)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态；将上述菌液摇匀后取100μl涂布于平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时；从lb平板上挑取新活化的单个菌落，接种于3-5ml lb液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。
20.第二个方面，本发明提供一种子宫内膜炎症的类器官体外模型，该模型是采用上述方法建立的。
21.第三个方面，本发明提供一种采用上述方法建立的子宫内膜炎症的类器官体外模型在研究细胞间相互作用上的用途。
22.本发明所具有的优点和有益效果是：
23.本发明方法通过在培养体系中添加使类器官产生炎症的成分，耗时少，效率高，适用范围广，可广泛用于炎症模型的构建。
附图说明
24.图1为实施例1诱导形成的子宫内膜类器官炎症模型光镜图；
25.图2为实施例2诱导形成的子宫内膜类器官炎症模型光镜图；
26.图3为实施例3诱导形成的子宫内膜类器官炎症模型光镜图；
27.图4为实施例1和对比例1诱导形成的子宫内膜类器官中tnf-a、inf-r、il-1b的表达量检测结果；
28.图5为实施例2诱导形成的子宫内膜类器官中tnf-a、inf-r、il-1b的表达量检测扩增曲线；
29.图6为实施例3诱导形成的子宫内膜类器官中tnf-a、inf-r、il-1b的表达量检测扩增曲线；
30.图7为对比例2诱导形成的子宫内膜类器官炎症模型光镜图；
31.图8为对比例3和实施例1诱导形成的子宫内膜类器官中tnf-a、inf-r、il-1b的表达量检测结果。
具体实施方式
32.本发明实施例采用的葡聚糖dextran t-500，购自北京索莱宝科技有限公司；
33.本发明实施例采用的pbs+tris+hepes，购自赛默飞；
34.本发明实施例采用的hbss，购自赛默飞；
35.本发明实施例采用的dmem，购自赛默飞；
36.本发明实施例采用的lb液体培养基(不含amp)，购自上海生工，
37.本发明实施例采用的eppendorf显微注射器，购自德国艾本德；
38.本发明实施例采用的lps作为诱导试剂，购自北京索莱宝科技有限公司；
39.本发明实施例采用的matrigel基质胶，购自康宁。
40.此外，在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
41.下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
42.实施例1
43.本实施例提供一种子宫内膜炎症的类器官体外模型的建立方法，包括：
44.①
进行正常组织的子宫内膜类器官培养：将获得的子宫内膜标本经过预处理得到细胞数量为30个细胞左右的细胞团；将细胞团与matrigel基质胶混匀后铺板，待凝固后倒置固定25min；加入专利申请号为202111036036.1的中国发明专利申请所述的子宫内膜类器官培养基，于37℃、5％co2条件下培养5天，期间每隔2天更换一次培养基，获得正常组织的子宫内膜类器官。
45.②
将获得的正常组织的子宫内膜类器官传代培养3天。
46.③
使用eppendorf显微注射器向类器官腔体中注射5ul大肠杆菌。
47.④
向步骤
③
获得的培养体系中加入106中性白细胞。
48.⑤
向步骤
④
获得的培养体系中加入1000ng/ml的lps作为诱导试剂进行炎症诱导，得到子宫内膜炎症的类器官体外模型。如图1所示，子宫内膜炎症的类器官周围分布着白细胞，且类器官呈现实心化结构。
49.本实施例中所述的大肠杆菌是通过大肠杆菌培养扩增方法获得的，大肠杆菌培养扩增包括以下步骤：从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上；向管中加入1ml lb液体培养基(不含amp)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态；将上述菌液摇匀后取100μl涂布于平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养20小时；从lb平板上挑取新活化的单个菌落，接种于4ml lb液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。
50.本实施例中所述中性白细胞是通过血液中性白细胞分离提取获得的。血液中性白细胞分离提取包括以下步骤：
51.将全血使用pbs1:1混匀后，加入2倍体积的葡聚糖dextran t-500并混匀，置于4℃静置40min后取上清按照质量比为1:1的比例加入pbs+tris+hepes缓冲液中，于4℃，500g离心25min后弃上清；使用pbs+tris+hepes缓冲液对沉淀进行清洗，后加入裂红试剂，沉淀与裂红试剂的质量比为1:2，使用hbss清洗2次，并重悬于dmem中备用。
52.实施例2
53.本实施例提供一种子宫内膜炎症的类器官体外模型的建立方法，包括：
54.①
进行正常组织的子宫内膜类器官培养：将获得的子宫内膜标本经过预处理得到细胞数量为30个细胞左右的细胞团；将细胞团与matrigel基质胶混匀后铺板，待凝固后倒置固定20min；加入子宫内膜类器官培养基，于37℃、5％co2条件下培养7天，期间每隔3天更换一次培养基，获得正常组织的子宫内膜类器官。
55.②
将获得的正常组织的子宫内膜类器官传代培养3天。
56.③
使用eppendorf显微注射器向类器官腔体中注射8ul金黄色葡萄球菌。
57.④
向步骤
③
获得的培养体系中加入105中性白细胞。
58.⑤
向步骤
④
获得的培养体系中加入500ng/ml的lps作为诱导试剂进行炎症诱导。得到子宫内膜炎症的类器官体外模型。如图2所示，子宫内膜炎症的类器官周围分布着白细胞。
59.本实施例中所述的金黄色葡萄球菌是通过金黄色葡萄球菌培养扩增方法获得的，金黄色葡萄球菌培养扩增包括以下步骤：从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上；向管中加入1ml lb液体培养基(不含amp)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态；将上述菌液摇匀后取100μl涂布于平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养24小时；从lb平板上挑取新活化的单个菌落，接种于5ml lb液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。
60.本实施例中所述中性白细胞是通过血液中性白细胞分离提取获得的，该提取方法与实施例1提取方法相同。
61.实施例3
62.本实施例提供一种子宫内膜炎症的类器官体外模型的建立方法，包括：
63.①
正常组织的子宫内膜类器官培养：将获得的子宫内膜标本经过预处理得到细胞数量为30个细胞左右的细胞团；将细胞团与matrigel基质胶混匀后铺板，待凝固后倒置固定30min；加入子宫内膜类器官培养基，于37℃、5％co2条件下培养4天，期间每隔2天更换一次培养基，获得正常组织的子宫内膜类器官。
64.②
将获得的正常组织的子宫内膜类器官传代培养3天。
65.③
使用eppendorf显微注射器向类器官腔体中注射3ul大肠杆菌。
66.④
向步骤
③
获得的培养体系中加入104中性白细胞。
67.⑤
向步骤
④
获得的培养体系中加入10ng/ml的lps作为诱导试剂进行炎症诱导。得到子宫内膜炎症的类器官体外模型，如图3所示，子宫内膜炎症的类器官周围分布着白细胞，且类器官呈现实心化结构。
68.本实施例中所述的大肠杆菌是通过大肠杆菌培养扩增方法获得的，大肠杆菌培养扩增包括以下步骤：从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上；向管中加入1ml lb液体培养基(不含amp)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态；将上述菌液摇匀后取100μl涂布于平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16小时；从lb平板上挑取新活化的单个菌落，接种于3ml lb液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。
69.本实施例中所述中性白细胞是通过血液中性白细胞分离提取获得的。该提取方法与实施例1提取方法相同。
70.实施例4
71.对实施例1得到的子宫内膜炎症的类器官体外模型进行急性炎症模型鉴定：按照天根(北京)荧光定量检测试剂盒说明书方法,利用qpcr方法检测tnf-a、inf-r、il-1b基因的表达量如图4所示。实施例1得到的类器官模型(诱导后)表达量远高于水平对比例1诱导前表达水平和对比例3的表达水平。
72.实施例5
73.对实施例2得到的子宫内膜炎症的类器官体外模型进行急性炎症模型鉴定：按照天根(北京)荧光定量检测试剂盒说明书方法,利用qpcr方法检测tnf-a、inf-r、il-1b基因的表达量qpcr扩增曲线如图5所示，实施例2得到的子宫内膜炎症的类器官均表达炎症相关因子tnf-a、inf-r、il-1b。
74.实施例6
75.对实施例3得到的子宫内膜炎症的类器官体外模型进行急性炎症模型鉴定：按照天根(北京)荧光定量检测试剂盒说明书方法,利用qpcr方法检测tnf-a、inf-r、il-1b基因的表达量如图6所示，实施例3得到的子宫内膜炎症的类器官均表达炎症相关因子tnf-a、inf-r、il-1b。
76.对比例1
77.本对比例提供一种子宫内膜炎症的类器官体外模型的建立方法，本对比例与实施例1的区别仅在于没有向步骤
④
获得的培养体系中加入lps作为诱导试剂进行炎症诱导。本对比例得到的类器官模型检测tnf-a、inf-r、il-1b基因的表达量如图4所示，实施例1得到的类器官模型(诱导后)表达量远高于水平对比例1诱导前表达水平，说明lps诱导对炎症模型构建至关重要。
78.对比例2
79.本对比例提供一种子宫内膜炎症的类器官体外模型的建立方法，本对比例与实施例1的区别仅仅在于步骤
④
向培养体系中加入107中性白细胞；其余同实施例1。本对比例得到子宫内膜炎症的类器官体外模型如图7所示，显微镜下观察类器官数量少，白细胞为主要细胞。说明白细胞数量过多会影响类器官生长。
80.对比例3
81.本对比例提供一种子宫内膜炎症的类器官体外模型的建立方法，本对比例与实施例1的区别仅仅在于步骤
⑤
中向培养体系中加入1000ng/ml的葡萄糖作为诱导试剂进行炎症诱导，得到子宫内膜炎症的类器官体外模型，其余同实施例1。本对比例得到子宫内膜炎症的类器官体外模型后，利用qpcr方法鉴定tnf-a、inf-r、il-1b的表达。结果如下图8所示：对比例3的类器官模型tnf-a、inf-r、il-1b的表达量远低于实施例1，说明lps对炎症模型诱导是非常重要的。
82.对比例4
83.本对比例提供一种子宫内膜炎症的类器官体外模型的建立方法，本对比例与实施例1的区别仅仅在于步骤
③
中向类器官腔体中注射20ul大肠杆菌，其余同实施例1。结果类器官在注射大肠杆菌培养3天后基本凋亡，剩下大肠杆菌生长。说明大肠杆菌的用量对模型构建成功非常重要。
84.综上所述，本发明一种子宫内膜炎症的类器官体外模型及其建立方法，能够在体
外快速稳定地构建子宫内膜炎症模型，可用于炎症机制和疾病治疗等研究。
85.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。