恒温环型核酸扩增法引物组及以其扩增核酸的方法与流程

primer)为例，环引物的加入大大提升了检测灵敏度，且与没有环引物的原始lamp相比，具有环引物的改良lamp的检测时间减少了一半。在这个改良版lamp中，环引物通过靶向原始lamp方法生成的扩增子的环状结构来启动额外的扩增。另外，将茎引物(stem primer)及群引物(swarm primer)进一步添加到lamp反应中，也为lamp的目标检测提供了额外的灵敏度。茎引物会粘合至改良lamp方法生成的扩增子的茎结构，而与区域f1c及b1c完全或实质上重叠的群引物则有助于在其延伸过程中为内部引物生成单链模板。
7.图2显示设计用于改善原始lamp的额外引物示意图。顺向环(loop forward，lf)引物及逆向环(loop backward，lb)引物分别位于区域f2c和f1c之间以及区域b1c和b2c之间，它们有特定的方向且其扩增方向如黑色箭头所示。茎引物位于区域f1和b1之间，且根据研究，可使用多个茎引物于lamp中，其效果比单一茎引物更佳。茎引物的方向是双向皆可，因此其扩增方向也是双向皆可。群引物与区域f1c和b1c显著或完全重叠，以分别扩增区域f1和b1，且其扩增方向如黑色箭头所示。
8.上述方法通过靶向f3-b3边界内区域的额外引物来专门提高检测灵敏度，而引入这些额外引物的可行性取决于原始lamp引物设计。通常只有在区域f2c和f1c之间、区域b2c和b1c之间、以及区域f1和b1之间有引物设计的空间时，环引物及茎引物才可能可行。然而，通常情况是没有空间可设计这些额外引物。在这种情况下，实有需要提供一种不受空间限制的新方法来设计及使用额外引物，以专门提升lamp的检测灵敏度。


技术实现要素：

9.本案实施例的目的在于提供一种具有额外自主引物的lamp引物组，以提升lamp的检测灵敏度。
10.本案实施例的另一目的在于提供一种利用具有额外自主引物的lamp引物组来进行核酸扩增的方法，以提升lamp的检测灵敏度。
11.为达上述目的，本案实施例提供一种lamp引物组，包括fip、bip、f3、与b3之原始lamp引物，以及至少一自主引物。原始lamp引物靶向核酸上的区域f3、f2、f1c、b1c、b2、及b3，且区域f3、f2、f1、b1c、b2c、及b3c在核酸之一顺向链的5’端往3’端依序排列。引物fip包括靶向区域f1c及f2的寡核苷酸，且引物bip包括靶向区域b1c及b2的寡核苷酸。至少一自主引物靶向的一区域位在从f3到b3的区域之外。
12.为达上述目的，本案实施例更提供一种扩增核酸的方法，包括步骤：提供包括fip、bip、f3、与b3之原始lamp引物，其中原始lamp引物靶向核酸上的区域f3、f2、f1c、b1c、b2、及b3，且区域f3、f2、f1、b1c、b2c、及b3c在核酸之一顺向链的5’端往3’端依序排列，其中引物fip包括靶向区域f1c及f2的寡核苷酸，且引物bip包括靶向区域b1c及b2的寡核苷酸；提供至少一自主引物，其中至少一自主引物靶向的一区域位在从f3到b3的区域之外；以及利用等原始lamp引物及至少一自主引物扩增一样本中的核酸。
13.在一实施例中，核酸为dna、rna、或其组合。
14.在一实施例中，至少一自主引物靶向的区域位在区域f3的上游或区域b3的上游。
15.在一实施例中，至少一自主引物包括至少一对自主引物，分别靶向区域f4及区域b4，区域f4位在区域f3的上游，且区域b4位在区域b3的上游。
16.在一实施例中，至少一自主引物包括两对自主引物，分别靶向区域f4、b4、f5、及
b5，区域f5位在区域f4的上游，区域f4位在区域f3的上游，区域b5位在区域b4的上游，且区域b4位在区域b3的上游。
17.在一实施例中，至少一自主引物包括三对自主引物，分别靶向区域f4、b4、f5、b5、f6、及b6，区域f6依序位在区域f5、区域f4、及区域f3的上游，且区域b6依序位在区域b5、区域b4、及区域b3的上游。
18.在一实施例中，至少一自主引物的一工作浓度范围为0.1μm至2μm。
19.在一实施例中，从f3到b3的区域至少有200个核苷酸长。
20.在一实施例中，核酸系通过具有链置换活性的一聚合酶来进行扩增。
21.当用语「一」在权利要求及/或说明书中与用语「包括/包含」结合使用时，可能表示「一」，但也与「一或更多」、「至少一」、及「一或大于一」的含义一致。
22.在权利要求中的用语「或」意指「及/或」，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是互斥的，即使揭露内容支持仅指替代方案与「及/或」的定义。
23.通过以下详细说明，本发明的其他目的、特征及优点将变得显而易见。然应理解的是，尽管详细说明及特定范例指出本发明的特定实施例，但这些特定实施仅为说明例示之用，因为通过此详细说明，在本发明的精神和范围内的各种变化及修饰对于熟悉本技艺人士而言是显而易见的。
【附图说明】
24.图1显示lamp设计的原始引物示意图。图2显示设计用于改善原始lamp的额外引物示意图。图3显示三对自主引物的示意图。图4显示设计及使用自主引物以提升lamp检测灵敏度的流程图。图5a及图5b显示自主引物的工作机制。图6a及图6b显示针对流感病毒b(flub)设计的自主引物的实例。图7a显示用于流感病毒b(flub)检测的自主引物的有益效果。图7b显示用于呼吸道融合病毒(rsvb)检测的自主引物的有益效果。图7c显示用于绿脓杆菌(pa)检测的自主引物的有益效果。图7d显示用于绿脓杆菌(pa)检测的自主引物的有益效果。图7e显示用于金黄色葡萄球菌(sa)检测的自主引物的有益效果。图8a至图8c显示自主引物在高模板输入下提升(rt-)lamp对flub、pa、及sa检测的有益效果。图9a至图9c显示自主引物于flub检测的特异性测定。图10a至图10c显示自主引物于靶向基因1的rsvb检测的特异性测定。图11a至图11c显示自主引物于靶向基因2的rsvb检测的特异性测定。图12显示用于pa检测的自主引物的有益效果。图13a及图13b显示用于flub检测的自主引物的有益效果。
【具体实施方式】
25.体现本案特征与优点的一些实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的是本案
能够在不同的态样上具有各种的变化，其皆不脱离本案的范围，且其中的说明及附图在本质上为说明之用，而非用以限制本案。
26.本案实施例提供一种设计及使用额外引物以提升检测灵敏度的新方法，以期在以恒温环型核酸扩增法(loop-mediated isothermal amplification，lamp)对dna及rna两种模板进行扩增时，能达成更早检测、更一致的扩增曲线、及/或更高检出率。这些额外引物被命名为自主引物(autonomy primers)，因为与其他前述的习知额外引物相比，自主引物的设计及使用享有前所未有的自由度，不像习知额外引物的可行性及数量皆受到原始lamp引物设计的限制。由于引入自主引物的目的是要提升lamp的检测灵敏度，故先决条件是要有一个可运作lamp引物组(working lamp primer set)，此引物组能够与正确的模板反应，但灵敏度待提升，且在无模板对照(no template control，ntc)中没有发生扩增。
27.基本的原始lamp引物组包括靶向核酸链上六个区域的四个引物，这六个区域命名为f3、f2、f1c、b1c、b2、及b3(区域f1c与区域f1互补，依此类推)。而六个区域f3、f2、f1、b1c、b2c、及b3c在双链dna中从顺向链的5’端往3’端依序排列，亦即区域f3位于区域f2的上游，而区域f2又位于区域f1的上游，依此类堆。因此，区域f3及b3位在最外侧，而区域f1及b1c则位在最内侧。靶向区域f1c及f2的寡核苷酸在有或没有额外核苷酸的情况下尾对头连接，以形成一个名为fip的引物。靶向b1c及b2区域的寡核苷酸在有或没有额外核苷酸的情况下尾对头连接，以形成一种名为bip的引物。对于某些模板而言，引入名为lf及lb的环引物且分别靶向f2c和f1c之间区域以及b1c和b2c之间区域的额外引物，可以加快反应速度。在这种情况下，共有六个lamp引物靶向八个核酸链区域。引物与其靶向区域实质上互补，以在所提供的条件下稳定退火及延伸。而在功能上，引物f3及b3为置换引物，可以置换及释放引物fip及bip所延伸产生的下游多核苷酸。
28.可运作lamp引物组是自主引物的锚点(anchor point)，而此可运作lamp引物组包括原始的四个引物(即f3、b3、fip、与bip)，且可带有或不带有两个后续设计的环引物(即lf及lb)。自主引物系被设计用来靶向位于原始lamp引物设计的f3到b3区域外侧的序列，因此不受空间限制且保证了可行性。理论上，可以设计不限数量的自主引物，因为它们靶向的序列是位在从f3到b3的区域之外。
29.在一些实施例中，区域f3、f2、f1c、b1c、b2及b3中的每一个可包括10到30个核苷酸，因此，从f3到b3的区域可以是至少200个核苷酸长，但不以此为限。
30.自主引物是引入来提升lamp目标检测的额外引物，且其靶向区域是区域f3及b3c外侧的区域。在具有一对自主引物(即引物f4与b4)的情况下，双链dna中从顺向链5’端往3’端的所有靶向区域依序包括f4、f3、f2、f1、b1c、b2c、b3c、及b4c。在具有两对自主引物(即f4与b4、以及f5与b5)的情况下，双链dna中从顺向链5’端往3’端的所有靶向区域依序包括f5、f4、f3、f2、f1、b1c、b2c、b3c、b4c、及b5c。在具有三对自主引物(即f4与b4、f5与b5、以及f6与b6)的情况下，双链dna中从顺向链5’端往3’端的所有靶向区域依序包括f6、f5、f4、f3、f2、f1、b1c、b2c、b3c、b4c、b5c、及b6c。
31.为了阐释及简化描述，自主引物的命名规则如下：与引物f3相同方向的引物带有f表示其为顺向引物，而与引物b3相同方向的引物带有b表示其为逆向引物；f及b后接着一个数字，表明其与引物f3及b3的相对位置，其中数字较小的自主引物比数字较大的自主引物更靠近引物f3及b3。图3显示三对自主引物的示意图，三对自主引物分别为f4与b4、f5与b5、
以及f6与b6，从图3即可理解它们相对于lamp引物的位置及其命名规则。自主引物位于引物f3及b3的上游，并与引物f3及b3具有相同的方向，且它们与引物f3及b3一样是作用为置换引物。自主引物设计的靶向位置在从f3到b3的区域之外，故理论上可以设计不限位置及不限数量的自主引物。自主引物的方向及其扩增方向如相关黑色箭头所示。根据命名规则，引物f4与b4比引物f5与b5更接近引物f3及b3，而引物f5与b5又比引物f6与b6更接近引物f3及b3。
32.图4显示设计及使用自主引物以提升lamp检测灵敏度的流程图。自主引物的设计发生在取得可运作lamp引物组之后。引入自主引物是为了提升原始可运作lamp引物组的检测灵敏度。有很多方法可以获得可运作lamp引物组，例如通过设计及筛选，或是从公开文献中提取。一旦取得可运作lamp引物组，包括f3、b3、fip、及bip，且可带有或不带有环引物，则可开始自主引物的设计。由于自主引物的作用类似于引物f3与b3，故引物f3与b3的设计参数可用于设计自主引物。例如，自主引物具有与引物f3与b3相似的tm值。此外，也要检查引物的相互作用，以防止这些额外引物对lamp反应产生潜在的不利影响。
33.尽管待设计的自主引物的相对位置及数量在理论上是不受限制的，只要它们靶向的序列位于从f3到b3的区域之外即可，然而为特定目标设计及使用的每个自主引物的实际位置和待设计的自主引物的数量由许多因素决定，例如序列比对结果、这些引物的浓度、以及lamp反应设定所允许自主引物的充分延伸及lamp扩增子的最大生成的能力。
34.虽然靶向dna任一链的自主引物被推测有益于检测灵敏度，但针对dna目标之双链、rna、及其所得cdna且为成对形式的这些引物亦当涵盖于本揭露内容。换言之，自主引物靶向的核酸可指dna或rna，或是两者的杂交体，其为不同长度的寡核苷酸或多核苷酸。核酸可为单链或双链，代表有义链(sense strand)或反义链(antisense strand)，且它们可以是天然存在的或人工合成的。
35.图5a及图5b显示自主引物的工作机制。为简化说明，仅将两对自主引物(f4、b4、f5、及b5)额外添加到原始lamp引物组中，此原始lamp引物组包括引物f3、b3、fip、与bip，且无环引物。自主引物依序命名以表明它们与引物f3及b3的相对位置，然而，这些引物的结合及延伸可以在引物f3及b3之前、之后及同时发生。机制一如图5a所示，自主引物作用如同置换引物f3及b3，用以置换引物fip产生的扩增子(图5a中的步骤4-5)，并产生引物bip的模板(图5a中的步骤5-6)。机制二如图5b所示，由位置更靠近引物f3的自主引物(即引物f4)产生的扩增子将被位于其上游的自主引物(即引物f5)置换(图5b中的步骤4-5)，其为引物bip提供了单链模板(步骤5-6，于图5b中以星号标示)。
36.换言之，这些自主引物的延伸与原始lamp引物设计的引物f3及b3的作用类似，有助于置换及分离由引物fip及bip从原始核酸模板延伸产生且具有典型茎环结构(stem-loop structure)的扩增子(如图5a所示)。又，自主引物的延伸有助于扩增lamp引物(即f3、b3、lf、lb、fip、及bip)的模板。此外，由自主引物产生及置换的模板理论上为单链而非双链形式，这为lamp引物提供了更好的可及性(如图5b所示)。反观原始lamp反应，因为60-65℃的反应温度通常不足以使目标变性，尤其是那些具有高gc含量及/或强二级结构的目标，使得模板主要为双链形式，因此可及性较差。
37.图6a及图6b显示针对流感病毒b(influenza virus b，genbank：mt637911.1)设计的自主引物的实例。在这个实例中设计了两对自主引物，即f4、b4、f5、及b5。如上所述，自主
引物的设计发生在取得可运作lamp引物组之后。因此，首先使用lamp引物设计软件(例如primerexplorer)并用预设参数设计了流感病毒b的原始lamp引物组，并确认此引物组可运作。然后再手动设计两对自主引物，其中引物f4及f5位于引物f3的上游，引物b4及b5位于引物b3的上游，如图6a所示。由于自主引物与引物f3及b3作为置换引物的作用相似，因此它们都具有相似的tm值，如图6b所示。根据定义，具有较小数字的自主引物比具有较大数字的自主引物更靠近引物f3及b3。自主引物可与四个lamp引物(f3、b3、fip、与bip)一起使用，或者与其他额外引物一起使用，其中额外引物包括但不限于环引物及茎引物，只要观察到协同效应即可。
38.类似地，用于不同目标基因的其他自主引物也根据本揭露内容的构想而设计。在以下实施例中，将以用于检测流感病毒b(influenza virus b(flub)，为rna模板)、呼吸道融合病毒(respiratory syncytial virus b(rsvb)，为rna模板)、绿脓杆菌(pseudomonas aeruginosa(pa)，为dna模板)、以及金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus(sa)，为dna模板)的自主引物为例说明，验证它们相较于原始lamp引物(f3、b3、fip、与bip)提高检测灵敏度的效果。
39.图7a显示用于流感病毒b(flub)检测的自主引物的有益效果。rt-lamp反应是在低模板输入下进行的，例如核酸提取物的40000倍稀释，且每个自主引物的浓度为0.6μm。图中显示了比较的条件、重复次数、以及用分数表示的每个目标的检出率。当使用原始lamp引物进行rt-lamp反应时，检出率为0/8。当使用原始lamp引物及两对自主引物进行rt-lamp反应时，检出率为3/8。当使用原始lamp引物及三对自主引物进行rt-lamp反应时，检出率为5/8。当使用原始lamp引物及四对自主引物进行rt-lamp反应时，检出率为6/8。因此，当引入更多对自主引物时，与没有自主引物的原始设置相比，可以获得更高的检出率及/或更早的检测。
40.图7b显示用于呼吸道融合病毒(rsvb)检测的自主引物的有益效果。rt-lamp反应是在低模板输入下进行的，例如75个拷贝数的基因组rna，且每个自主引物的浓度为0.6μm。当使用原始lamp引物进行rt-lamp反应时，检出率为5/7。当使用原始lamp引物及三对自主引物进行rt-lamp反应时，检出率为7/7。因此，自主引物的添加同样提升了rsvb的检出率。
41.图7c显示用于绿脓杆菌(pa)检测的自主引物的有益效果。lamp反应是在低模板输入下进行的，例如7个拷贝数的基因组dna，且每个自主引物的浓度为0.2μm。当使用原始lamp引物进行lamp反应时，检出率为1/2。当使用原始lamp引物及一对浓度为0.2μm的自主引物进行lamp反应时，检出率为2/2。当使用原始lamp引物及两对浓度为0.2μm的自主引物进行lamp反应时，检出率为2/2。当使用原始lamp引物及三对浓度为0.2μm的自主引物进行lamp反应时，检出率为2/2。因此，当引入至少一对自主引物时，自主引物的添加同样提升了pa的检出率。
42.图7d显示用于绿脓杆菌(pa)检测的自主引物的有益效果。lamp反应是在低模板输入下进行的，例如7个拷贝数的基因组dna，且每个自主引物的浓度为0.2μm或0.6μm。当使用原始lamp引物进行lamp反应时，检出率为1/3。当使用原始lamp引物及三对浓度为0.2μm的自主引物进行lamp反应时，检出率为3/3。当使用原始lamp引物及三对浓度为0.6μm的自主引物进行lamp反应时，检出率为3/3。因此，与没有自主引物的原始设置相比，两种浓度的自主引物皆显示较高的pa检出率。
43.图7e显示用于金黄色葡萄球菌(sa)检测的自主引物的有益效果。lamp反应是在低模板输入下进行的，例如核酸提取物的1000倍稀释，且每个自主引物的浓度为0.2μm或0.6μm。当使用原始lamp引物进行lamp反应时，检出率为1/3。当使用原始lamp引物及三对浓度为0.2μm的自主引物进行lamp反应时，检出率为3/3。当使用原始lamp引物及三对浓度为0.6μm的自主引物进行lamp反应时，检出率为3/3。因此，与没有自主引物的原始设置相比，两种浓度的自主引物皆显示较高的sa检出率。
44.图7a至图7e的实验结果显示出，当引入至少一对自主引物于flub、rsvb、pa、及sa检测时，在低模板输入下即可获致更高的检出率及/或更早的检测，且采用更多对自主引物也显示出附加有益效果。
45.图8a至图8c显示自主引物在高模板输入下提升(rt-)lamp对flub、pa、及sa检测的有益效果。举例来说，flub的模板输入包括核酸提取物的200倍稀释，pa的模板输入包括1500个拷贝数的基因组dna，sa的模板输入包括核酸提取物的100倍稀释。比较的条件是有和没有三对自主引物的反应设置。在全部三个目标检测中，与没有自主引物的原始设置相比，当引入三对自主引物时，可观察到更早的检测。从图8a至图8c可看出，当模板输入高时，检出率没有差异，皆为100％。在这种条件下，与没有自主引物的原始配方相比，使用自主引物对flub、pa、及sa的检测所呈现的有益效果为更早的检测。
46.此外，三对自主引物对于rt-lamp检测flub及rsvb的反应特异性的效果也被验证。在实验中测试了三组lamp引物，其中一组是针对flub基因，另外两组是针对rsvb基因的基因1及基因2，且在有和没有三对自主引物下进行测试。图9a至图9c显示自主引物于flub检测的特异性测定。图10a至图10c显示自主引物于靶向基因1的rsvb检测的特异性测定。图11a至图11c显示自主引物于靶向基因2的rsvb检测的特异性测定。这些引物分别以其正确的模板进行测试(图9a、图10a、图11a)，以高浓度的相同病毒的不同基因型进行测试(图9b、图10b、图11b)，以及在无模板下进行测试(ntc对照；图9c、图10c、图11c)。从实验结果可观察到，只有正确的模板被扩增。因此，加入自主引物测试的全部三组lamp引物的反应特异性都没有改变，也没有观察到ntc扩增。也就是说，自主引物不但具有提升目标检测灵敏度的能力，而且也不会损害对flub及rsvb的检测特异性。
47.从实验结果来看，当使用更多数量的自主引物时，自主引物的有益效果更加明显。在一些实施例中，自主引物的有效及适宜浓度范围为0.1μm至2μm，且优选范围为0.2μm至1.2μm。太低的浓度不足以为lamp引物产生足够的模板，而太高的浓度可能会消耗太多要用来产生最大量lamp扩增子的反应成分。对于特定模板及lamp反应设置，应通过实验决定具有自主引物的引物配方以获得最佳效能。
48.再者，当使用自主引物时，核酸扩增热方案(thermal protocol)可以是等温或是具有温度变化。图12显示用于pa检测的自主引物的有益效果，其中所采用的热方案为每个循环都具有温度变化，例如热方案包括31个循环，每个循环为70℃20秒及65℃40秒。当使用原始lamp引物进行lamp反应时，检出率为0/7。当使用原始lamp引物及三对浓度为0.6μm的自主引物进行lamp反应时，检出率提高到6/7。因此，自主引物的添加也有益于采用具温度变化的热方案所进行的核酸扩增。
49.此外，自主引物可以单独、成对、或组合引入。图13a及图13b显示用于flub检测的自主引物的有益效果，其中图13a为使用单个自主引物f4，图13b为使用单个自主引物f4与
一对自主引物f5及b5的组合。热方案包括31个循环，每个循环为65℃1分钟。如图13a及图13b所示，自主引物的单独使用及其与另一对自主引物的组合均提高了flub检测的检出率。
50.综上所述，自主引物的使用是提高lamp核酸扩增的检测灵敏度的有效方式。本揭露内容所提供的方法在设计上比其他在原始lamp引物(f3、b3、fip、与bip)中引入额外引物(即环引物、茎引物、及群引物)的习知方法具有明显且突出的优势。这些习知方法是靶向与原始lamp扩增子相同的区域，因受长度约束，故限制了额外引物的位置及数量。相反地，本揭露内容所提供的新方法享有引物设计上前所未有的自由度，因为自主引物位于lamp扩增子之外，且在从f3到b3的区域之外。lamp反应设置可设计尽可能多的自主引物，并确保更好的效能，因为自主引物的工作机制是置换由可运作lamp引物组产生的扩增子，可运作lamp引物组有或没有环引物皆可，且扩增出的模板为单链形式，对可运作lamp引物具有更好的可及性。
51.纵使本发明已由上述实施例详细叙述而可由熟悉本技艺人士任施匠思而为诸般修饰，然皆不脱如附权利要求所欲保护者。