一种实现抗生物膜粘附与杀菌功能的表面处理方法

1.本发明涉及一种实现抗生物膜粘附与杀菌功能的表面处理方法，属于新型多功能表面制备以及生物医用材料表面抗菌技术领域。


背景技术：

2.医疗器械表面的细菌粘附与生物膜形成会导致严重的感染疾病从而对人类健康造成严重威胁。在应对细菌感染问题方面，抗生素的滥用导致了医疗成本和经济负担的增加。在自然或人为环境中，细菌在大多数表面都可以形成成熟的生物膜，生物膜一旦形成，它对常规杀菌剂的抵抗力就会显著增强，在严重情况下，甚至需要移除并重新植入，大大增加了病人的经济负担和痛苦。然而，目前的某些医疗器械如医用植入物和导管等都缺乏抗生物膜特性。因此，赋予材料有效的抗生物膜性质来抵抗医疗器械严重的相关感染是迫切需要解决的问题。
3.目前，许多策略被提出用以减少生物膜的形成，包括通过化学和结构表面修饰来抵抗最初的细菌粘附，引入杀菌物质来杀死粘附的细菌，或者将以上两种策略结合。尽管在初期能够有效防止材料表面细菌黏附和增殖，然而后期随着细菌对抗生素耐药性的不断增加，材料便会因为缺乏长效抗菌性而不能应对加速产生的耐药菌。润滑液体灌注的多孔表面(slippery liquid-infused porous surface(s)，slips)作为一种新型表面抗污材料可以呈现出光滑且稳定的界面，对于各种液体均具有超强的排斥力。通过将润滑液体覆盖在粗糙的多孔基质表面中，slips表现出了极低的粘附界面，可以抵抗细菌等生物污染物的入侵，从而防止生物膜在材料表面的形成。此外，当slips用以修饰介入/植入类医疗器械时，可以极大地减少机体与植入物体之间的摩擦来显著地缓解治疗期间的不适。然而，一旦润滑剂表层受到机械损伤，细菌可能因为表面缺乏内在的杀菌性能而在表面发生初始粘附，因此，这种单一表面无法阻止细菌的进一步增殖。此外，还有一种润滑液内被添加进抗菌剂或群体感应抑制剂等化学物质的方法可以赋予表面抑菌或灭菌的能力。然而，这种方法除了有产生耐药性的风险外，还会因为外加小分子物质在润滑层中能否均匀分散以及相容性等问题限制材料的应用范围，可能会影响slips表面抗污性能的稳定性与持久性。因此，在不加入抗菌物质的情况下，如何使slips本身具有抗污和杀菌能力是解决这一困境的可行之策。
4.近年来，经研究发现，大自然中有些物质或生物的表面本身特有的纳米阵列结构，可以通过撕裂细胞膜的方式来杀死各种附着在表面的细菌。这些表面因为其出色的杀菌能力以及对环境无害的特点，不会引发潜在的耐药性问题，因此成为目前仿生研究的热点。值得高兴的是，这些仿生表面不仅可以通过其独特的纹理结构进行物理杀菌，还可以用作天然的构造滑移表面的平台。cn112813392a公开了一种基于毛细作用的固液复配耐磨抗菌材料、制备方法与应用，借助纳米管和/或多孔结构的毛细管作用储存润滑剂，起到降低磨损，提高抗菌的效果，但该方法采用气相沉积或电化学沉积方法制备，操作复杂，且对基体要求高，适用面窄。尽管我们已经对这种具有抗菌粘附或杀菌性质的slips进行了大量的研究，
但是据我们研究发现，目前还没有一种策略能够实现单纯通过物理作用使其表面具有内在的抗细菌粘附与杀菌的效果。因此，构建双功能的slips用以实现抗污和物理杀菌性能巧妙、系统的结合尚待解决。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种实现抗生物膜粘附与杀菌功能的表面处理方法，该方法可以实现温和条件下制备所需的润滑液体灌注多孔表面，适用于多种不同基底材料。本方法不仅解决了传统滑移表面材料缺乏抗生物膜特性、内在杀菌性能且外加小分子物质在润滑液中分布不均匀和不相容的问题，而且所制备的骨架膜能够在实现抗污的同时巧妙结合物理杀菌性能，可以保持高效和长效的抗菌性能。
6.为了实现上述目的，本发明所述的实现抗生物膜粘附与杀菌功能的表面处理方法具体为：
7.(1)将六水合硝酸锌水溶液与2-甲基咪唑水溶液室温下混合，搅拌30min得到种子液；
8.(2)将步骤(1)所得种子液涂覆在基底材料表面，水洗后在80℃下干燥，得到晶种覆盖的基底；
9.(3)将步骤(2)所得的基底浸入步骤(1)所得的种子液中，反应30～180min后取出，水洗后在80℃下干燥，并重复进行浸泡-干燥步骤1～4次，随后放入润滑油中浸泡24小时，取出后去除表面多余的润滑油，即可得到金属有机框架基润滑液体灌注(zls)的基底材料。
10.进一步地，步骤(1)所述六水合硝酸锌水溶液的浓度为0.01～0.05mol/l，2-甲基咪唑水溶液的浓度为0.1～0.5mol/l，六水合硝酸锌水溶液与2-甲基咪唑水溶液的体积比为1:1。
11.进一步地，步骤(2)所述基底材料选自硅片、医用聚氨酯膜、医用硅胶膜，涂覆方法为旋涂。
12.进一步地，步骤(2)所述基底材料选自医用聚氨酯管、医用硅胶管，涂覆方法为浸涂。
13.进一步地，步骤(3)所述润滑油为疏水润滑油。所述润滑油为硅油或氟油。
14.上述方法中，所述的具有典型匕首状微纳结构的zif-l膜本身为多孔材料且表面具有疏水性且存在晶间间隙，因此润滑剂更多通过毛细作用渗透至其结构内部，进而形成稳定的滑移表面。并且所制备的zls具有光滑的润滑层且具有排斥水的能力。
15.适用于本技术的基底材料包括但不限于硅片、医用聚氨酯膜、医用硅胶与医用导管。
16.杀菌性能表征方法如下：选用铜绿假单胞菌作为典型试验细菌。细菌菌株在37℃的条件下在液体培养基中生长12h。然后通过离心(3000rpm，6min)收集细菌，并用磷酸缓冲盐溶液洗涤三次。将得到的细菌重新分散在磷酸缓冲盐溶液中，并通过酶标仪调节细菌浓度，得到用于抗菌效果测试的细菌溶液，菌液浓度约为106cfu/ml-1
。在测试之前，将所有样品(目标样品与对照样品)灭菌。将样品(1.5x1.5cm2)置于6孔培养板中，随后菌液(106cfu/ml-1
，铜绿假单胞菌，100μl)直接滴加至样品表面，37℃培养箱中共培养30min后，用pbs缓冲溶液轻轻洗涤样品表面。使用4％多聚甲醛固定表面细菌，处理15min后，用无菌水洗涤3次，
去除表面多余的多聚甲醛固定液。最后，置于冷冻干燥箱中干燥过夜，得到的样品利用sem观察细菌在结构表面的形貌变化。此外，利用活/死双色荧光法对样品表面的细菌进行染色，并通过clsm观察细菌的存活状况。抑菌圈测试为：将100μl菌液(106cfu/ml-1
，铜绿假单胞菌，100μl)均匀涂于预先准备的固体培养基上，并将样品(1x1cm2)倒扣在上述的培养基中心。随后，将带有样品的固体培养基置于37℃烘箱中培养18小时，用相机记录样品周围细菌生长情况。
17.通过上述方法制备得到的金属有机框架基润滑液体灌注多孔表面具有依靠物理结构进行“抗”细菌粘附和“杀”死细菌的特性，对铜绿假单胞菌具有突出的抗菌效果。
18.本发明与现有技术相比具有以下优点:
19.(1)本发明中，zif-l本身就具有多孔性和疏水性的特点，能够在灌入润滑液体时起到关键作用。相较于构建滑移表面的传统拓扑结构，该mofs膜具有显著优势。传统拓扑结构通常为微米、纳米或微纳结构，固定表面润滑油仅依靠结构之间的空隙，因此往往存在润滑油固定不牢的情况，导致滑移表面的抗污效果与耐久性大打折扣。相较之下，zif-l本身的多孔性和疏水性，则更加利于润滑油在结构内部的固定。此外，zif-l具有的类似匕首的微纳结构能够使其具备天然的物理杀菌能力。
20.(2)由于表面固定的润滑层，本发明所制备的zls对于细菌的初始粘附具有优异的防御能力。此外，在实际应用中如果滑移表面润滑层发生了不可避免的损伤，细菌便会易于粘附至此“缺陷”处，此时，暴露出的zif-l表面尖锐的微纳结构也能够通过物理撕裂的方式将细菌杀死，这便是本发明为防止表面生物膜形成的“双重保护”。
21.(3)本发明方法对基底要求低，对平面、立体复杂结构的基底材料均能实现良好的表面改性，实现物理抗菌的效果，具有普适性。
22.(4)本发明方法操作简单，所用试剂均为广泛商品化产品，方便易得，并且过程安全环保无污染，符合低碳生产要求。同时对基体要求低，在常规医用材料中可广泛推广，并且适用于复杂结构的材料处理，在医用植入材料等领域具有显著的应用潜力。
附图说明
23.图1：一种实现抗生物膜粘附与杀菌功能的表面处理方法示意图。
24.图2：zif-l在不同基底表面生长的sem图：(a)硅片，(b)聚氨酯膜，(c)平面硅胶膜，(d)原始医用硅胶管，(e)聚氨酯导管。
25.图3：铜绿假单胞菌在硅片(a)和硅片/zif-l表面(b)的代表性sem图。
26.图4：zif-l金属有机框架膜对铜绿假单胞菌抑菌圈实验。
27.图5：三种平面基底及其对应zls的前进角、后退角以及滞后角。
28.图6：模拟体液与细菌繁殖环境中滞后角随时间变化图。
29.图7：兔全血在原始硅胶导管(sc)和zls处理硅胶导管中的滑动示意图；
30.图8：不同培养时间内铜绿假单胞菌在硅片(左)、硅片/润滑剂(中)和zls(右)表面粘附的代表性激光扫描共聚焦显微镜图。
31.图9：不同培养时间内铜绿假单胞菌在硅片(左)、硅片/润滑剂(中)和zls(右)表面粘附对应的细菌覆盖率统计直方图。
具体实施方式
32.为更进一步阐述本发明为实现预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。
33.实施例1
34.(1)将0.01mol/l六水合硝酸锌水溶液与0.1mol/l 2-甲基咪唑水溶液按体积比1:1在室温下混合，搅拌30min得到种子液；
35.(2)将步骤(1)所得种子液对清洁的硅片进行表面旋涂处理(转速3000rpm，20s，20次)，水洗后在80℃下干燥，得到晶种覆盖的硅片；
36.(3)将步骤(2)所得的硅片浸入步骤(1)所得的种子液中，反应30min后取出，水洗后在80℃下干燥，并重复进行浸泡-干燥步骤4次，随后放入全氟聚醚油中浸泡24小时，取出后去除表面多余的润滑油，即可得到金属有机框架基润滑液体灌注(zls)的硅片。
37.所得材料的微观结构如图2a所示，具体为长度为微米级，宽度在纳米级的匕首状多孔结构，整体均匀且致密。对该材料进行铜绿假单胞菌的抗菌试验后，发现空白样品表面上的细菌细胞形态完整，呈光滑的杆状形貌，而在zif-l表面形貌发生变形，原因在于zif-l匕首状的结构破坏了整个细菌细胞，展现出典型的物理杀菌表面性质(图3)。图4为抑菌圈测试结果，可以发现没有明显的抑菌圈，证明其抗菌活性来自于其纳微结构而非化学成分。通过滞后角(cah)的变化可以判断材料表面的润湿性行为，如图5所示，样品具有极低的滞后角，证明本发明所制备的zls具有光滑的润滑层并且具有排液能力。将所制备zls样品在模拟人体体液(ph＝7)与细菌繁殖微环境(ph＝5.5)的溶液中浸泡24小时，测试样品滞后角。如图6所示，zls样品仍具有较低的滞后角，由此可见所构建的zls具有良好的滑移稳定性。
38.如图8所示，实施例1所制备的zls表面具有优异的抗细菌粘附能力。进一步利用image j软件定量分析不同培养时间后不同样品表面细菌的数目，如图9所示。空白硅片和单纯灌注润滑油的硅片样品表面，经过超纯水冲洗后，仍然附着大量细菌。仅6小培养，空白硅片表面细菌覆盖率约为7％，而简单灌注了润滑油后的硅片，细菌覆盖率仍为6％，相比之下，zls表面覆盖率低于0.1％。培养时间延长至12小时，空白硅片表面细菌覆盖率升高至15.5％，此时zls表面细菌覆盖率仍低于0.3％。培养24小时后，zls表面细菌覆盖率仅约1％，仅为空白硅片的细菌覆盖率(27％)的3.7％，说明zls经过长时间细菌环境培养仍能有效抵抗细菌粘附，具有优异的防污性能，能够防止细菌在表面形成生物膜。此外，即使表面覆盖了润滑油，硅片样品依然无法抵抗细菌生物膜的生长(细菌覆盖率为14.9％)，也证实了若基底不存在拓扑结构，单独的润滑油覆盖无法发挥滑移效果，因此不存在抗细菌、污染物粘附的效果。
39.实施例2
40.(1)将0.05mol/l六水合硝酸锌水溶液与0.5mol/l 2-甲基咪唑水溶液按体积比1:1在室温下混合，搅拌30min得到种子液；
41.(2)将步骤(1)所得种子液对清洁的医用聚氨酯膜进行表面旋涂处理(转速3000rpm，20s，20次)，水洗后在80℃下干燥，得到晶种覆盖的医用聚氨酯膜；
42.(3)将步骤(2)所得的用聚氨酯膜浸入步骤(1)所得的种子液中，反应60min后取出，水洗后在80℃下干燥，并重复进行浸泡-干燥步骤3次，随后放入全氟聚醚油中浸泡24小
时，取出后去除表面多余的润滑油，即可得到金属有机框架基润滑液体灌注(zls)的医用聚氨酯膜。
43.所得材料的微观结构如图2b所示，具体为长度为微米级，宽度在纳米级的匕首状多孔结构，整体均匀，相比实施例1结构疏松，并有一定交错生长结构。通过滞后角(cah)的变化可以判断材料表面的润湿性行为，如图5所示，样品的滞后角显著低于空白聚氨酯膜，证明本发明所制备的zls具有光滑的润滑层并且具有排液能力。杀菌试验表明经24小时后zls处理的聚氨酯膜表面细菌覆盖率为空白聚氨酯膜的5％以下，呈现出优异的抵抗细菌粘附和杀菌性能。
44.实施例3
45.(1)将0.03mol/l六水合硝酸锌水溶液与0.5mol/l 2-甲基咪唑水溶液按体积比1:1在室温下混合，搅拌30min得到种子液；
46.(2)将步骤(1)所得种子液对清洁的医用硅胶膜进行表面旋涂处理(转速3000rpm，20s，10次)，水洗后在80℃下干燥，得到晶种覆盖的医用硅胶膜；
47.(3)将步骤(2)所得的医用硅胶膜浸入步骤(1)所得的种子液中，反应180min后取出，水洗后在80℃下干燥，并重复进行浸泡-干燥步骤1次，随后放入全氟聚醚油中浸泡24小时，取出后去除表面多余的润滑油，即可得到金属有机框架基润滑液体灌注(zls)的医用硅胶膜。
48.所得材料的微观结构如图2c所示，具体为长度为微米级，宽度在纳米级的匕首状多孔结构，整体均匀，相比实施例1致密度接近，并有一定交错生长结构。通过滞后角(cah)的变化可以判断材料表面的润湿性行为，如图5所示，样品的滞后角显著低于空白聚氨酯膜，证明本发明所制备的zls具有光滑的润滑层并且具有排液能力。杀菌试验表明经24小时后zls处理的医用硅胶膜表面细菌覆盖率为空白医用硅胶膜的3％以下，呈现出优异的抵抗细菌粘附和杀菌性能。
49.实施例4
50.(1)将0.01mol/l六水合硝酸锌水溶液与0.3mol/l 2-甲基咪唑水溶液按体积比1:1在室温下混合，搅拌30min得到种子液；
51.(2)将步骤(1)所得种子液对清洁的医用硅胶导管进行浸涂处理(30min)，水洗后在80℃下干燥，得到晶种覆盖的医用硅胶导管；
52.(3)将步骤(2)所得的医用硅胶导管浸入步骤(1)所得的种子液中，反应180min后取出，水洗后在80℃下干燥，并重复进行浸泡-干燥步骤2次，随后放入硅油中浸泡24小时，取出后去除表面多余的硅油，即可得到金属有机框架基润滑液体灌注(zls)的医用硅胶导管。
53.所得材料的微观结构如图2d所示，具体为长度为微米级，宽度在纳米级的匕首状多孔结构，整体均匀覆盖在管材表面。选用无菌兔血为模型血液测试耐血污性能，对于所制备zls导管样品，将血液沿导管内壁注入，拍照对比血液在不同样品表面的黏附效果。如图7所示，血液可在zls导管内部顺畅流动，无粘附现象，表明金属有机框架基润滑液体灌注多孔表面可有效抗血液污染。杀菌试验表明经24小时后zls处理的医用硅胶导管表面细菌覆盖率为空白医用硅胶导管的5％以下，呈现出优异的抵抗细菌粘附和杀菌性能。
54.对比例1
55.(1)将0.01mol/l六水合硝酸锌水溶液与0.1mol/l 2-甲基咪唑水溶液按体积比1:1在室温下混合，搅拌30min得到种子液；
56.(2)将表面洁净的硅片浸入步骤(1)所得的种子液中，反应30min后取出，水洗后在80℃下干燥，并重复进行浸泡-干燥步骤4次，随后放入全氟聚醚油中浸泡24小时，取出后去除表面多余的润滑油，即可得到金属有机框架基润滑液体灌注(zls)的硅片。
57.与实施例1相比，对比例1没有经过晶种覆盖的处理，直接进行生长，结果发现形成了叶片状zif的层层堆积，不能构建多孔结构，从而无法固定润滑油，同时其本身的物理杀菌能力显著下降，从而既无法实现物理抗菌，也不能避免细菌粘附。
58.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。