一种响应缺铁胁迫的诱导型启动子GmbHLH47启动子及其应用

一种响应缺铁胁迫的诱导型启动子gmbhlh47启动子及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种响应缺铁胁迫的诱导型启动子gmbhlh47启动子及其应用。


背景技术：

2.大豆(glycine max l)是世界五大粮食作物之一，是一年生草本双子叶植物，大豆籽粒营养丰富。铁是植物生长发育必须的微量元素之一，其在植物体的光合作用、呼吸作用、氮的固定、蛋白质和核酸合成等生理代谢过程中发挥着重要作用。虽然铁在大多数土壤中含量都是丰富的，但铁在不溶性氧化铁的形式中不能被生物所利用。在缺铁条件下，大豆地下部分根系发育较差，生长不良，根短而细少，根瘤数量较少，进而导致减产，严重时会导致植株早期枯萎甚至死亡。
3.植物启动子是一段能与rna聚合酶及其转录因子特异结合、决定基因转录起始的dna序列。诱导型启动子可以接受诱导信号快速有效的诱导基因的表达，也可以随时解除胁迫停止表达。如在非生物胁迫下与逆境胁迫相关的转录因子(调节蛋白)与基因上游启动子中关键顺式元件特异结合，增强启动子活性，提高目的基因表达量，提高植株抗逆性。


技术实现要素：

4.为了提高植物的抗铁胁迫能力，本发明提供了在缺铁胁迫下启动外源基因的转录的诱导型启动子gmbhlh47启动子，gmbhlh47启动子能在缺铁条件下驱动基因的表达，所述gmbhlh47启动子的核苷酸序列如seq id no.1所示。
5.本发明还提供了上述gmbhlh47启动子在提高植物抗铁胁迫能力中的应用。
6.进一步地限定，所述植物为拟南芥或大豆。
7.本发明还提供了含有上述gmbhlh47启动子的重组载体。
8.本发明还提供了上述重组载体在提高植物抗铁胁迫能力中的应用。
9.本发明还提供了含有上述gmbhlh47启动子的转基因细胞系或重组菌。
10.本发明还提供了上述转基因细胞系或重组菌在提高植物抗铁胁迫能力中的应用。
11.本发明还提供了一种提高植物抗铁胁迫能力的方法，所述方法包括如下步骤：
12.(1)构建含有gmbhlh47启动子的重组载体，所述gmbhlh47启动子的核苷酸序列如seq id no.1所示；
13.(2)制备携带gmbhlh47启动子的农杆菌：将步骤(1)得到的重组载体转入到农杆菌感受态中培养，得到携带gmbhlh47启动子的农杆菌；
14.(3)制备携带gmbhlh47启动子的转基因植物：利用将步骤(2)得到的农杆菌侵染植物，得到携带gmbhlh47启动子的植物。
15.进一步地限定，步骤(1)所述重组载体的构建方法具体如下：利用限制性内切酶分别酶切载体pmd18t-gmbhlh47启动子和pbi121-gus质粒，得到gmbhlh47启动子的序列片段与pbi121-gus质粒的酶切产物，然后将gmbhlh47启动子的序列片段与pbi121-gus质粒的酶
切产物进行连接，获得pbi121-gmbhlh47pro::gus。
16.进一步地限定，上述连接反应的体系是：5μl的pbi121-gus质粒酶切产物、3μl的gmbhlh47启动子的序列片段、1μl的10
×
t4 dna连接缓冲液和1μl的t4 dna连接酶，反应温度为16℃，反应时间为12h。
17.进一步的限定，所述限制性内切酶为hindⅲ和bamh1。
18.进一步地限定，所述植物为拟南芥或大豆。
19.进一步地限定，所述植物为拟南芥时，步骤(3)所述侵染的时机为拟南芥达到开花期；所述植物为大豆时，步骤(3)所述侵染的时机为大豆长出子叶节时。
20.进一步的限定，上述步骤(3)中农杆菌侵染拟南芥的步骤如下：
21.(1)在超净工作台中取保存的pbi121-gmbhlh47pro::gus农杆菌菌液50μl，接种于25ml含有km、str、rif的yeb液体培养中，28℃，200rpm摇床培养17h左右，取上述活化后的菌液500μl置于50ml含有km、str、rif的yeb液体培养中，28℃，200rpm摇床培养15h左右，od
600
至1.2-1.5停止。
22.(2)将活化的农杆菌放于离心机中5000rpm离心10min，弃掉上清，收集离心管中的菌体，加5％蔗糖(现用现配)20ml吸打重悬浮，取2ml重悬浮菌液，于600nm测其od值，使其od值达到0.9便可用于转化，在转化前向转化液中加入0.04％比例的silwet l-77。
23.(3)选取长势健壮植株，当拟南芥的花蕾将要打开的时候，转化的效果最好，做转化时，用移液器吸取200μl新配置的转化液，向拟南芥的花蕾滴加2-3滴，并重复操作2-3次。
24.(4)蘸花完毕后，将植株移到黑暗处保湿24h，之后将植株移到光照培养室(温度22℃、光照16h/黑暗8h)正常培养，3d后再次配制转化液进行二次转化。
25.(5)将t0拟南芥种子置于含有km抗性的1/2ms培养基中筛选。
26.进一步的限定，步骤(3)中农杆菌侵染大豆的步骤如下：
27.(1)挑选黑农53大豆种子，在超净工作台中用无菌28％次氯酸钠消毒5min后用无菌水冲洗数遍，种脐向下放入ms培养基中，暗培养6天。
28.(2)在超净工作台中将pbi121-gmbhlh47pro::gus k599农杆菌重悬后得到od
600
为0.5-0.7菌液，用于侵染大豆子叶节。
29.(3)取暗培养的无菌大豆，用刀在距离子叶0.3-0.5cm处切下，并将子叶从子叶节处切开，切掉顶芽。用组培刀在子叶和子叶节表面划几刀，称为外植体。
30.(4)把外植体放在菌液里浸泡30min，不定期晃动菌液。侵染后的子叶节用滤纸吸干后将其放在ms1固体培养基上，封膜，暗培养5天。
31.(5)暗培养后用含有cef和km抗性ms3液体培养基冲洗子叶节，先冲洗两遍，为了将菌彻底洗净再泡半小时，洗净后将子叶节吸干，将下胚轴切至0.5cm，将子叶下胚轴朝下，倾斜着插入ms3固体培养基，25℃，16h光照培养。
32.本发明的有益效果：
33.gmbhlh47启动子从大豆gmbhlh47基因启动子区域克隆得到。通过对该启动子区的分析发现其中含有多种可能参与多重逆境胁迫的顺式作用元件。当用缺铁培养基对转基因植株进行处理后，发现gmbhlh47启动子可以增加外源基因gus的表达，致使转基因植物的染色加深，证明gmbhlh47启动子受缺铁胁迫诱导。作为一个受缺铁胁迫诱导的启动子，其启动子区域和上游调控序列在基因工程和提高植物抵抗缺铁方面起着重要作用。
buffer到mini column中，最大速度离心1min，弃滤液。
56.(12)重复步骤(11)。
57.(13)将mini column套入到2ml收集管中，最大速度空柱离心2min。
58.(14)将mini column套入到新的1.5ml离心管中，加入50-100μl 65℃预热的elution buffer，室温放置3-5min，最大速度离心1min。
59.(15)重复步骤(14)。
60.2、获得gmbhlh47启动子的方法：
61.从大豆基因组数据库中找到progmbhlh47序列，设计了1510bp长度的核苷酸序列，利用progmbhlh47-s和progmbhlh47-a进行pcr扩增，progmbhlh47-s的核苷酸序列为：3
’‑
aatggaagatgaggaggat5’(如seq id no.2所示)，progmbhlh47-a的核苷酸序列为：3
’‑
gtgattaaagccagttatatg-5’(如seq id no.3所示)。
62.反应体系为7.2μl的distilled sterile water、1μl的10
×
pcr buffer、0.5μl的大豆基因组dna、0.8μl的dntp mix(2.5mmol/l)、0.2μl的progmbhlh47-s(10μmol/l)、0.2μl的progmbhlh47-a(10μmol/l)和0.1μl的rtaq dnapolymerase(5u/μl)。反应程序为94℃5min、94℃30s、58.3℃30s、72℃2min、72℃10min、4℃1h，30cycles。
63.gmbhlh47启动子的核苷酸序列如seq id no.1所示：
64.atgaagaacaataattctaagagaagtggtgtaagaaaataccacaaatcaaaacaaatggaagatgaggaggatgataaattataaaatttgcattatttcaatgctgagatggattataaaagttgagttgctatttgatagaaaggactacataaccaagacgagtgattagctagtaatcaaattaaaataatacgaattcacaaaaaaagtaataattaaataatacgtggacgagcatgatgatggctgcgagcaagtaaagcaattttagtatccgaacgtttttgcctttttggtttgcttagactcaaaattaaaataaaaattactttaatttttcgttctacacatttaataattctatattaagaacttttaataaagaatataaataatatttataaaaaacataaatatttttaaaaatataaattttacgtgaatgatgtgatgatatatacaaaaggaaaagagaaaaatatgtaaacaaacgagaaaaataaaaaagggaatcatgaaaatgtacaaaaagaaattaatagaaaaaatgactcaaatgagtaacaataaatactgtattcaaatggataaaaagataattgtaaaaacgagtaaaaaagttagtacaaaaatatataaacgggcaaaaaaattgtagaaaaaaattaataagctgccaaaaaacaatacaaatggggaggaaaaaaatattcaaataagtagaaaagtagaaaatgtgtacatgaaggagaaatggatcaacaaattatgcaaatggataaaaaatgggctgaaaaaatacagatagatagaacagaaataatgaaaatggattgaaaattgtcatttaaattgagagaaaacatgtataaccaaaaataaaatattcataataaaaaattatattattattattacaaaaagacctaaaaaagaaaaggatcacgtggggaactcattggtggttgttgattgaagcgaaggagcatgacctcgccacgcgccttcgcgtgacagatgccctcccgccacactccatcaccacaaccccaatcttcttttctctctcctctgccctaattcccattttcccaacttcaatttcattctcaaatattcctattccaattccaatcctattcctttcgattcctcttcccccagtttggtaagcaaaaaaccactttccctctttctgcacacaatttatcttccctcttttttctattcggtcgttttctgtttgatccttggaatttctcgatgctctgttttggctgctatgaagtgtggaaattaaaattgggaacttggtttgttgtttttttttacccctttctctgattggattgcgataaagggaattgatttaatcaggaaacatggattttactttttcattgaccgtaaaaagaaatttccatttcttggggtgttcgaattacttctcctttcgttgtaagaataaaaagtacattattgaagtagttttgtttttctactttaggaaattttgttgctggaagaattgcttaagggcatataactggctttaatcac
65.使用plantcare在线软件对gmbhlh47基因启动子片段序列进行转录调控元件分析，发现gmbhlh47基因启动子共有26个顺式作用元件，主要有核心元件、激素应答元件、光
响应元件、myb响应元件、其他元件和三个未命名元件。
66.实施例2：含有gmbhlh47启动子的重组载体的构建
67.1、构建载体pmd18t-progmbhlh47
68.(1)反应体系：1μl的pmd18 t vector、3μl的目标基因片段溶液、1μl的ddh2o、5μl的solution i。反应温度16℃，反应时间12h以上(过夜)。
69.(2)连接progmbhlh47质粒片段到克隆载体pmd18t上，连接产物利用热激法转入到大肠杆菌感受态中，其具体内容为：
70.大肠杆菌感受态从80℃冰箱中取出后迅速放到冰上，待其溶化后加入10μl的连接产物，冰浴30min；取出后快速放于42℃水浴热激1min 15s后，迅速插入冰中，冰浴2min。加入800μl lb液体培养基，置于200rpm摇床，37℃，振荡1h；取出离心管，4000rpm离心5min，取出上清800μl，重悬剩余菌体，将剩余约200μl的菌液以体积比为3:1的比例涂于含有氨苄抗性的两个lb固体培养基上；37℃培养箱中倒置培养，过夜；挑取培养基上的单菌落进行鉴定，挑取阳性菌落进行扩增培养，利用质粒提取试剂盒提取pmd18t-progmbhlh47质粒。
71.2、构建重组载体pbi121-gmbhlh47pro::gus
72.(1)对pmd18t-progmbhlh47和pbi121的质粒进行酶切：
73.采用限制性内切酶分别酶切pmd18t-progmbhlh47质粒和pbi121-gus质粒，得到gmbhlh47启动子的序列片段与pbi121-gus质粒的酶切产物。然后将gmbhlh47启动子的序列片段与pbi121-gus质粒的酶切产物进行连接反应，获得pbi121-gmbhlh47pro::gus，该重组载体的结构见图2。
74.双酶切的反应体系为：70μl的pmd18t-progmbhlh47/pbi121-gus质粒、10μl的takara10
×
kbuffer、4μl的hind iii、4μl的bamhι和12μl的ddh2o。
75.连接反应的体系是：5μl的pbi121-gus质粒酶切产物、3μl的gmbhlh47启动子的序列片段、1μl的10
×
t4 dna连接缓冲液和1μl的t4 dna连接酶，反应温度为16℃，反应时间为12h。
76.重组质粒的鉴定：
77.双酶切鉴定，提取pbi121-progmbhlh47::gus阳性质粒，并利用hind iii和bamhι进行双酶切鉴定，反应体系为：32μl pbi121-progmbhlh47::gus重组质粒、5μltakara10
×
kbuffer、2μl的hind iii、2μl的bamhι和9μl的ddh2o得到约1510bp左右的目的条带(见图1)。
78.实施例3：携带progmbhlh47的gv3101农杆菌制备方法
79.冻融法转化重组质粒pbi121-progmbhlh47::gus，方法如下：
80.(1)取-80℃保存的感受态细胞置于冰中融化。
81.(2)将10μlpbi121-gmbhlh47pro::gus重组质粒加入到100μl农杆菌感受态细胞gv3101中，用手拨打管底混匀。
82.(3)依次置于冰上静置5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min。
83.(4)加入700μl无抗生素的yeb液体培养基，于28℃振荡培养2-3h。
84.(5)6000rmp离心1min收菌，留取100μl上清重悬菌块，将菌液涂布于含有卡那霉素(50mg/ml)+链霉素(50mg/ml)+利福平(50mg/ml)的yeb固体培养基上，倒置放于28℃培养箱中暗培养2-3d。鉴定转化后的农杆菌；其鉴定方式为：挑取生长较为均匀的单菌落，用基因
特异性引物进行菌落pcr扩增；鉴定的反应体系为：template dna菌落、1μl的10
×
buffer、0.8μl的dntp mix、0.2μl的progmbhlh47-hindiii、0.2μl的progmbhlh47-bamhι、0.1μl的rtaq和7.μl的ddh2o；反应条件为：
①
94℃、min；
②
94℃、3s；
③
58.3℃、3s；
④
72℃、1min 30s；
⑤
72℃、10min；
⑥
4℃、1h；
①
～
⑥
循环30次。
85.实施例4：携带progmbhlh47的k599农杆菌制备方法
86.冻融法转化重组质粒pbi121-progmbhlh47::gus，方法如下：
87.(1)取-80℃保存的感受态细胞置于冰中融化。
88.(2)将1μl pbi121-gmbhlh47pro::gus重组质粒加入到100μl农杆菌感受态细胞k599中，用手拨打管底混匀。
89.(3)依次置于冰上静置5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min。
90.(4)加入700μl无抗生素的ty液体培养基，于28℃振荡培养2-3h。
91.(5)6000rmp离心1min收菌，留取100μl上清重悬菌块，将菌液涂布于含有卡那霉素(50mg/ml)+链霉素(50mg/ml)+利福平(50mg/ml)的ty固体培养基上，倒置放于28℃培养箱中暗培养2-3d。鉴定转化后的农杆菌；其鉴定方式为：挑取生长较为均匀的单菌落，用基因特异性引物进行菌落pcr扩增；鉴定的反应体系为：template dna菌落、1μl的10
×
buffer、0.8μl的dntp mix、0.2μl的progmbhlh47-hindiii、0.2μl的progmbhlh47-bamhι、0.1μl的rtaq和7.7μl的ddh2o；反应条件为：
①
94℃、5min；
②
94℃、30s；
③
58.3℃、30s；
④
72℃、1min 30s；
⑤
72℃、10min；
⑥
4℃、1h；
①
～
⑥
循环30次。
92.实施例5：提高大豆毛状根抗铁胁迫能力的方法
93.①
挑选黑农53大豆种子，在超净工作台中用无菌28％次氯酸钠消毒5min后用无菌水冲洗数遍，种脐向下放入ms培养基中，暗培养6天。
94.②
在超净工作台中将实施例4获得的pbi121-gmbhlh47 k599农杆菌重悬后得到od
600
为0.5-0.7菌液，用于侵染大豆子叶节。
95.③
取暗培养的无菌大豆，用刀在距离子叶0.3-0.5cm处切下，并将子叶从子叶节处切开，切掉顶芽。用组培刀在子叶和子叶节表面划几刀，称为外植体。
96.④
把外植体放在菌液里浸泡30min，不定期晃动菌液。侵染后的子叶节用滤纸吸干后将其放在ms1固体培养基上，封膜，暗培养5天。
97.⑤
暗培养后用含有cef和km抗性ms3液体培养基冲洗子叶节，先冲洗两遍，为了将菌彻底洗净再泡半小时，洗净后将子叶节吸干，将下胚轴切至0.5cm，将子叶下胚轴朝下，倾斜着插入ms3固体培养基，25℃，16h光照培养。
98.获得的转progmbhlh47基因阳性大豆毛状根见图6。
99.实施例6：提高拟南芥抗铁胁迫能力的方法
100.(1)活化农杆菌
101.在超净工作台中取实施例3获得的pbi121-gmbhlh47pro::gus农杆菌菌液50μl，接种于25ml含有km、str、rif的yeb液体培养中，28℃，200rpm摇床培养17h左右。取上述活化后的菌液500μl置于50ml含有km、str、rif的yeb液体培养中，28℃，200rpm摇床培养15h左右，od
600
约为1.2-1.5之间停止。
102.(2)将活化的农杆菌放于离心机中5000rpm离心10min，弃掉上清，收集离心管中的菌体，加5％蔗糖(现用现配)20ml吸打重悬浮，取2ml重悬浮菌液，于600nm测其od值，使od值
达到0.9便可用于转化，在转化前向转化液中加入0.04％比例的silwet l-77。
103.(3)选取长势健壮植株，当拟南芥的花蕾将要打开的时候，转化的效果最好，做转化时，用移液器吸取200μl新配置的转化液，向拟南芥的花蕾滴加2-3滴，并重复操作2-3次。
104.(4)蘸花完毕后，将植株移到黑暗处保湿24h，之后将植株移到光照培养室(温度22℃、光照16h/黑暗8h)正常培养，3d后再次配制转化液进行二次转化。
105.获得的转progmbhlh47基因阳性拟南芥见图5。
106.转pbi121-progmbhlh47::gus植株gus染色的方法
107.将转pbi121-progmbhlh47::gus拟南芥放入含有km的正常和缺铁的1/2ms培养基中进行筛选得到阳性植株并进行染色。侵染pbi121-progmbhlh47::gus k599发根农杆菌的大豆子叶节放入正常ms3培养基中培养约一周左右生出少量毛状根后，换入缺铁的ms3培养基中直至长出大量毛状根进行染色。
108.正常培养和缺铁处理的阳性毛状根切片，将横切面、纵切面和根尖进行gus染色，染色结果见图3，通过对大豆毛状根横切面和纵切面的观察，发现在缺铁条件下，毛状根的木质部和韧皮部有明显的蓝色信号，皮层有微弱的蓝色信号。大豆毛状根的根尖出现了蓝色信号，在正常条件下，仅在毛状根的维管束韧皮部中检测到gus活性，说明progmbhlh47具有启动子活性且受缺铁调控。
109.对转pbi121-progmbhlh47::gus拟南芥及野生型拟南芥进行gus染色，结果见图4，转pbi121-progmbhlh47::gus拟南芥植株中检测到蓝色信号，对照未检测到gus活性。