一种从发酵液中直接分离提纯聚羟基烷酸酯的方法与流程

1.本发明涉及生物工程下游后处理技术领域，具体涉及一种从发酵液中直接分离提纯聚羟基烷酸酯的方法。


背景技术：

2.聚-β-羟基烷酸酯(poly-β-hydroxyalkanoates，简称pha)是一类由微生物在不平衡的生长条件下在胞内积累的生物聚酯，其典型代表是聚羟基丁酸酯(phb)及其共聚物(如phbv、phbh等)，其物理性质类似于聚丙烯。由于它具有生物降解性、生物相容性、可食用性、压电性、非线性光学活性等普通石油化工树脂所不具备的特性，使其在工业、农业、医疗、卫生、食品、电子等领域具有广阔的应用前景。但时至今日，pha的应用尚未大规模普及，其主要原因是成本仍然明显高于石油化工树脂。pha的生产成本主要包括原料成本和分离提纯成本。原料成本的高低取决于菌种的生产效率及所采用的发酵工艺，而分离提纯成本则主要取决于采用的工艺。
3.目前的提取工艺是首先采用高速离心机将细胞从发酵液中分离出来，再对分离后的湿菌体中的pha进行提纯，一般采用的方法是有机溶剂萃取法、化学试剂法、表面活性剂+酶法等。这些方法或是成本高、或是污染严重，难以实现工业化生产。
4.公开号cn1800235a的发明专利申请公开了一种从湿菌体中提取高纯度phas(聚羟基烷酸酯)的方法，首先需要浓缩发酵液收集菌体，并采用有机溶剂溶解高分子，分离去残渣，再浓缩有机相分离得到pha。该方法有机溶剂使用量大，设备的安全性要求较高，溶剂回收困难，存在有机溶剂泄漏风险，只适合实验室提取试验，不适合工业化生产。
5.公开号cn1070534c的发明专利公开了一种从细菌菌体内分离提取pha的方法，包括如下步骤：1)用含有表面活性剂的碱性溶液处理菌体；2)固液分离，分离出去大部分非pha成分；3)用碱性蛋白酶处理pha；4)分离提取pha颗粒；5)干燥得到pha产品。该方法反应条件温和，成本较低，但是耗碱量大，表面活性剂添加量大，而且需要加碱性蛋白酶，额外地增加了成本，且只是实验室工艺，未考虑工业化放大。
6.公开号cn109504715a的发明专利公开了一种制备聚羟基脂肪酸酯(pha)的方法，该方法包括以下步骤：(1)制备嗜盐菌发酵液并通过固液分离得到浓缩菌液；(2)对步骤(1)得到的浓缩菌液进行洗涤；(3)对步骤(2)得到的洗涤后的菌液进行细胞壁破壁裂解以得到破壁液；(4)去除步骤(3)得到的破壁液中的非pha物质，收集pha；(5)纯化pha；(6)干燥pha。该方法浓缩菌液、破壁、去除非pha物质、洗涤等步骤均需要用到2000-20000rpm高速离心、反复离心，设备投资成本高，只适合实验室研究，不适合工业化生产；破壁过程需要在高温、碱性、表面活性剂条件下高速离心，不仅会产生大量泡沫，处理过程容易失控，而且高温碱性环境下，因为碱的剪切作用，pha发生降解，其分子量锐减，所分离得到的pha产品的应用领域将大为受限。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种工艺简单、生产效率高、产品品质稳定、成本低，能够实现大规模工业化生产的分离提纯聚羟基烷酸酯的工艺。
8.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.一种从发酵液中直接分离提纯聚羟基烷酸酯的方法，包括以下步骤：
10.(1)取聚羟基烷酸酯生产菌的发酵液，进行细胞破壁处理得到破壁液；
11.(2)利用碱液调节破壁液ph值至碱性；
12.(3)往碱性破壁液中加入钠盐和阴离子表面活性剂，进行搅拌反应，其中加入钠盐和加入阴离子表面活性剂的顺序可以互换；
13.(4)固液分离收集沉淀，并用水洗至中性，再脱水、干燥，获得所述聚羟基烷酸酯。
14.步骤(1)中，本发明无需分离菌体，直接对含有聚羟基烷酸酯生产菌的发酵液进行细胞破壁处理，释放出菌体胞内物质。
15.本发明方法中，细胞破壁可以采用机械破壁法，也可以采用化学破壁法。优选的，所述机械破壁法采用超声波法或高压均质法。
16.优选的，所述超声处理条件为：功率200～1000w，时间10～30min。
17.优选的，所述高压均质条件为：压力50～100mpa，更为优选，压力60～80mpa，破壁2次。
18.步骤(2)中，将破壁液ph值调节至8～12，可以增溶菌体蛋白、水解部分磷脂分子，协同促进表面活性剂结合非pha物质的反应。
19.所述碱液的碱性物质为naoh、na2co3、nahco3或氨水。优选的，将破壁液ph值调节至9～11。
20.步骤(3)中，往碱性破壁液中添加钠盐进行反应析出，并添加阴离子表面活性剂作为洗涤剂进行搅拌以溶解破壁液中细胞碎片等非pha物质。在此过程中，本发明添加钠盐进行反应析出，阻止碱液对聚羟基烷酸酯的水解作用；另一方面，高盐环境改变细胞表面电荷，降低细胞膜稳定性，有利于阴离子表面活性剂插入细胞膜，包裹细胞膜的磷脂双分子层结构，使得聚羟基烷酸酯从细胞碎片中分离出来，释放至反应液中。
21.所述钠盐可选用氯化钠、硫酸钠或碳酸钠。优选的，所述钠盐为氯化钠。
22.以每升发酵液计，钠离子浓度为0.3～1mol/l。钠盐的用量是发酵液的1％～10％(w/v)。研究表明，随着钠盐用量增加，可促进反应析出，反应析出时间缩短，反应物结团效果好。钠离子浓度超过1mol/l(发酵液)，增效不明显。优选的，以nacl为例，用量为2～6g/100ml发酵液。
23.优选的，所述阴离子表面活性剂采用十二烷基硫酸钠。
24.优选的，按照每100ml发酵液添加1～5g的阴离子表面活性剂。
25.研究表明，不同的钠盐、阴离子表面活性剂用量、反应温度、搅拌转速等因素都会造成反应析出时间的差异。因此，一个原则是以加入提取反应原料后，第一时间混匀为佳，当混匀后，搅拌转速要适当降低，有利于产品析出。反应时间以产物完全析出为准，搅拌转速根据具体情况调整。
26.优选的，加入钠盐后反应时间为1～15min。加入阴离子表面活性剂后反应时间为1～5min。
27.为保证充分反应，先将钠盐和阴离子表面活性剂分别溶于水中制备成溶液，再加入到反应体系中。
28.步骤(3)中，控制反应温度不低于10℃。研究表明，高浓度sds在低温条件下会出现凝固，不利于反应。若温度过高，产物析出太快，固形物结团松散，颗粒细软，不利于固液分离，作为优选，反应温度为10℃～50℃。以nacl为例，反应温度为10～35℃。更优选的，反应温度为15～25℃。
29.步骤(4)中，将反应液进行固液分离，收集沉淀，重复多次水洗步骤进行pha的纯化。
30.优选的，固液分离的方法可以是真空抽滤、离心、压滤。所述真空抽滤的条件为：滤布目数100～200目，真空表压＜-0.05mpa；所述离心的条件为：分离因数≥600。
31.pha纯化的方法为：向固液分离后的沉淀中加入水，充分搅拌洗涤，然后去除洗涤液，重复此过程若干次，直至洗涤之后溶液ph值至中性。
32.所述脱水的方法同上述固液分离方法，即真空抽滤、离心或压滤。
33.所述干燥的方法为加热通风干燥、真空冷冻干燥。
34.本发明适用处理对象广泛，可应用于各种含聚羟基烷酸酯的细菌以及变异株或基因工程菌等发酵液的分离提纯。所适用的细菌种属包括但不限于：产碱杆菌属(alcaligenes)、假单胞菌属(pseudomonas)、固氮菌属(azotobacter)、红螺菌属(rhodospirllum)、甲基营养菌属(methylotrophs)和芽孢杆菌属(bacillus)。
35.本发明具备的有益效果：
36.(1)本发明提供的分离提纯工艺是直接从发酵液中分离提纯聚羟基烷酸酯，无需事先分离菌体，避免使用高速离心机等繁琐、耗能过程，节约投资，降低成本投入。
37.(2)本发明采用钠盐加表面活性剂的工艺手段，在温和条件下进行产品分离提纯，分子剪切小，所得产品具有纯度高，分子量高，产品品质稳定的特点。本发明在破壁液ph值调至碱性后添加钠盐，盐析作用下保护产物pha免受碱液的降解作用，避免分子量锐减；同时钠盐协同表面活性剂作用有助于提升产物pha与非pha物质的分离效率。
38.(3)本发明的pha提取工艺对菌体的pha含量要求不高，工艺简单、生产效率高、产品品质稳定、成本低，能够实现大规模工业化生产。
附图说明
39.图1为实施例1中破壁液中添加钠盐和表面活性剂后的反应过程以及抽滤清洗过程的实物图，其中(a)为反应初期-加料完毕，(b)为反应中期-初步析出，(c)为反应末期-完全析出，(d)为完全析出去母液，(e)为浆料后处理-经4次过滤清洗，(f)收集固形物。
具体实施方式
40.下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
41.下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
42.实施例中采用的alcaligenes eutrophus菌、罗氏真养杆菌(ralstonia eutropha)为常规的聚羟基烷酸酯生产菌，可从商业途径得到。采用本领域常规发酵培养条件进行发酵培养。
43.实施例1
44.取alcaligenes eutrophus菌的发酵液100ml，细胞干重145g/l(其中phb含量70.5％)，超声波破壁(300w，超10s/停10s，30分钟)，降温至35℃，用30％naoh溶液调节ph至11，加入10g nacl(先用约40ml水溶解)搅拌1分钟，加入2.4g十二烷基硫酸钠(先用约25ml水溶解)继续搅拌2分钟，抽滤瓶真空抽滤(真空表≤-0.05mpa)，并用水清洗沉淀至ph中性，抽滤脱水，置于90℃烘箱内烘至恒重。反应、抽滤过程见图1。
45.产品检测方法参照国家标准《gb/t 30293-2013生物制造聚羟基烷酸酯》，本实施例所得产品纯度99.1％，粘均分子量5.5
×
105da，提取得率89％。
46.比较例1
47.本比较例探索了工艺参数条件优化，取实施例1相同的处理对象，即alcaligenes eutrophus菌发酵液的破壁液，固定其它制备条件不变，只改变单个因素，比较不同条件下提纯产物性能。
48.1、不同钠盐试验，反应参数及结果如表1所示。
49.表1
[0050][0051][0052]
备注：反应时间跟ph、温度和表面活性剂用量相关。分子量与发酵液中产品初始分子量有关，提取产品一般比初始分子量低5-10万左右。
[0053]
由表1可以看出，钠离子强度相同情况下，以氯化钠的析出效果最佳，硫酸钠、碳酸钠稍差一些。
[0054]
2、不同反应ph试验
[0055]
将破壁液ph分别调至6、7、8、9、10、11、12、13、14，结果表明：
[0056]
当ph＜8时，加入反应试剂后，析出量少，颗粒细小，松散，不利于后续分离，提取得率低；
[0057]
当8≤ph≤12时，反应析出量多，沉淀物能结团，颗粒较粗，有利于分离和清洗，提取得率较高；
[0058]
当ph＞12时，反应析出量较多，沉淀物能结团，颗粒较粗，但后续清洗过程要求较高，需要快速脱除母液，否则聚羟基烷酸酯分子容易被强碱性剪切，容易造成分子量相对偏低。
[0059]
3、不同钠盐用量
[0060]
不同钠盐用量，反应效果存在差异，以nacl为例，当钠离子浓度达到1mol/l(发酵液)时，反应析出时间明显缩短，反应也基本完全，再增加钠盐用量，反应效果没有明显变化；但减少钠盐的用量，会使反应时间延长，且析出沉淀变得更松散，不利于后续分离清洗，当钠离子浓度低于0.3mol/l(发酵液)时，析出量少，反应不完全，提取得率不高。
[0061]
4、反应温度
[0062]
将破壁液温度控制在10、15、20、25、30、35、40、45、50℃，结果表明，随着反应温度的提升，产品析出时间缩短，表观结团完整，但颗粒细软，不利于后续分离，清洗损失较大，得率不高；温度适当降低，反应析出的沉淀物结团适当，颗粒较粗，有利于分离清洗。从nacl的试验情况看，10-35℃情况下反应均可，但最优反应温度介于15-25℃之间。
[0063]
实施例2
[0064]
取实施例1相同的处理对象，即alcaligenes eutrophus菌的发酵液，细胞干重145g/l(其中phb含量70.5％)，降温至20℃，80mpa高压破壁，破壁液在带冷却盘管的储罐中搅拌降温至20℃，再重复破壁一次。取破壁液100ml，用30％naoh溶液调节ph至11，加入6g nacl(先用约25m水溶解)搅拌1分钟，再加入2.4g十二烷基硫酸钠(先用约25ml水溶解)继续搅拌2分钟，抽滤瓶真空抽滤(真空表≤-0.05mpa)，并用水清洗沉淀至ph中性，抽滤脱水，置于90℃烘箱内烘至恒重。
[0065]
所得产品纯度98.9％，粘均分子量5.3
×
105da，提取得率88％。
[0066]
实施例3
[0067]
取alcaligenes eutrophus菌的发酵液，细胞干重189g/l(其中phbv含量81％)，降温至20℃，80mpa高压破壁，破壁液在带冷却盘管的储罐中搅拌降温至20℃，再重复破壁一次。取破壁液100l，用30％naoh溶液调节ph至9，加入3.5kg nacl搅拌2分钟，加入2.0kg十二烷基硫酸钠继续搅拌3分钟，用三足式离心机离心(分离因数600)，并用水冲洗滤饼至滤液ph中性，脱水，置于70℃烘箱内烘至恒重。
[0068]
所得产品纯度99.3％，粘均分子量5.8
×
105da，提取得率91％。
[0069]
实施例4
[0070]
罗氏真养杆菌(ralstonia eutropha)的发酵液细胞干重195g/l(其中phbv含量82％)，降温至20℃，80mpa高压破壁，破壁液在带冷却盘管的储罐中搅拌，降温至20℃，重复破壁一次。取破壁液100l，用30％naoh溶液调节ph至11，加入5kg十二烷基硫酸钠搅拌1分钟，加入2.5kg nacl继续搅拌5分钟，用三足式离心机离心，并用水冲洗滤饼至滤液ph中性，脱水，置于70℃烘箱内烘至恒重。
[0071]
所得产品纯度99.3％，粘均分子量5.9
×
105da，提取得率92％。
[0072]
对比例1
[0073]
取实施例1相同的处理对象，即alcaligenes eutrophus菌的发酵液，细胞干重145g/l(其中phb含量70.5％)，降温至20℃，80mpa高压破壁，破壁液在带冷却盘管的储罐中搅拌降温至20℃，再重复破壁一次。取破壁液100ml，用30％naoh溶液调节ph至11，加入0.5g
十二烷基硫酸钠和5g聚丙烯酸钠，调节反应温度至70℃，搅拌反应30分钟。然后抽滤瓶真空抽滤(真空表≤-0.05mpa)，并用水冲洗滤饼至滤液ph中性，脱水，置于90℃烘箱内烘至恒重。
[0074]
所得产品纯度93.5％，粘均分子量4.5
×
105da，提取得率82％。
[0075]
由以上试验数据显示，本发明通过加入钠盐，整个提取反应时间明显缩短，产品的纯度和分子量明显高于对比例，提取得率也得到了较大的提高。