一种链霉菌及其在防治甘蔗凤梨病中的应用

一种链霉菌及其在防治甘蔗凤梨病中的应用
1.技术领域
2.本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种链霉菌及其在防治甘蔗凤梨中的应用。


背景技术：

3.甘蔗凤梨病是由子囊菌亚门真菌奇异长喙壳[ceratocystis paradoxa (dode) more au]引起的一种甘蔗真菌病害，抑制蔗种的萌发，普遍发生在广西、广东、海南、云南等主要产蔗区，在排水性较差的田地上分布较多，可使种子萌发减少高达47%。蔗种染病后，切口的两端开始变成红色，并散发出一种类似于成熟凤梨的气味，因此得名凤梨病。凤梨气味是由病原体代谢活动形成的乙酸乙酯引起的，感染组织中的乙酸乙酯含量可能高达1%，足以抑制芽的萌发，可使甘蔗减产31-35%，该病原菌主要由土壤传播。目前，甘蔗凤梨病主要以化学杀菌剂是最常用的处理方法，如使用多菌灵可湿性粉剂或甲基硫菌灵悬浮剂进行防治，该类化学药剂由于长时间使用，病原菌产生了耐药性，使用效果差强人意，并且过度使用化学药剂不可避免的药物超标、药物残留等问题，给环境带来了极大污染，对食品安全存在巨大隐患。
[0004]
链霉菌属（streptomyces）在分类上属于细菌，是放线菌门（actinobacteria）中最大的属，形态类似于真菌，形成分支菌丝、无性孢子和菌丝体，具有真菌和细菌共有的特征。以链霉菌为代表的放线菌处于细菌和真菌之间的过渡时期，广泛分布在土壤中，与植物形成互惠关系，促进植物生长并保护植物免受病原体侵害。大多数链霉菌是有效的根际定居者，也可以定殖在宿主植物组织中成为内生菌。已知三分之二的抗生素是由链霉菌产生，链霉菌是开发为农业生物防治肥料的理想候选菌株。
[0005]
目前，在甘蔗凤梨病的防治中，有关于利用枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌等微生物制剂其防治的报道，如中国专利文献：一种预防或者治疗甘蔗凤梨病的制剂及其制备方法，公布号为cn106047965a，公开日为20161026；一株铜绿假单胞菌及其应用，公布号为cn109439561a，公开日为20190308；卡特拉链霉菌nb20及其培养方法和应用，公布号为cn102433281a，公开号为20120502。未见有灰锈赤链霉菌在甘蔗凤梨病防治方面的报道。


技术实现要素：

[0006]
本发明针对现有技术的不足，提供一种链霉菌及其在防治甘蔗凤梨病中的应用。本发明通过使用微生物菌剂对甘蔗生态系统的防治，减少有毒化学药物对环境，尤其是甘蔗生态系统的不利影响。为实现本发明目的所使用的技术方案为：一种链霉菌，所述链霉菌为灰锈赤链霉菌（streptomyces griseorubiginosus）ys21，已于2022年1月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为cctcc no. m 2022062。
[0007]
进一步地，所述灰锈赤链霉菌ys21的16s rdna序列如seq id no：1所示。灰锈赤链霉菌ys21的16s rdna序列与ncbi数据库中进行比对，发现其16s rdna测序结果与灰锈赤链霉菌（streptomyces griseorubiginosus）16s rdna序列具有高同源性（登录号为：mh482889 ab706352 mn826180），序列相似性达到99%以上。
[0008]
进一步地，所述灰锈赤链霉菌ys21的适宜生长温度为20-35℃，ph为6-9。
[0009]
进一步地，所述灰锈赤链霉菌ys21在高氏一号培养基35℃条件下培养7d后，气生菌丝体为蚌肉白色，基质菌丝体为酪黄色，产生可溶性色素；在察氏琼脂培养基35℃条件下培养7d后，气生菌丝体为白色，基质菌丝体为白色，不产生可溶性色素；在淀粉铵琼脂培养基35℃条件下培养7d后，气生菌丝体为酪黄色，基质菌丝体为酪黄色，不产生可溶性色素；在贝奈特培养基35℃条件下培养7d后，气生菌丝体为白色，基质菌丝体为酪黄色，产生可溶性色素；在葡萄糖酵母膏琼脂培养基35℃条件下培养7d后，气生菌丝体为白色，基质菌丝体为棕色，产生可溶性色素。
[0010]
本发明还提供一种微生物菌剂，含有以上所述链霉菌和/或以上所述链霉菌的发酵液。
[0011]
包括含有灰锈赤链霉菌ys21或者其生长代谢获得的产物，可以是纯的微生物菌剂，还包括含有微生物菌剂的培养基、代谢物或者培养过程中产生的其他成分。
[0012]
进一步地，所述微生物菌剂含有具有活性菌株数量不低于108cfu/ml。微生物菌剂中活性菌株要保持10
8-109cfu/ml之间。
[0013]
进一步地，所述的微生物菌剂制备方法包括以下步骤：（1）将灰锈赤链霉菌ys21接种到lb液体培养基，在温度为32-35℃，转速160-190rpm条件下培养3天，得到培养液；（2）将培养液于转速8000-10000rpm条件下离心后，用无菌水清洗2-3次，使用无菌水调节菌液浓度为10
8-109cfu/ml，得到微生物菌剂。
[0014]
进一步地，所述lb液体培养基配方成分(g/l)：胰蛋白胨10.0、酵母浸粉5.0、氯化钠10.0，ph 7.0-7.2，可通过商业途径获得。
[0015]
所述微生物菌剂添加以延长菌株活性时间为目的的辅料，或菌剂可接受的其他辅料之后，所得到的微生物菌剂产品，辅料可以为扩散剂、吸附剂等。
[0016]
本发明还提供一种微生物菌剂在防治甘蔗凤梨病中的应用。
[0017]
所述微生物菌剂防治甘蔗凤梨病的技术方案为：将蔗种完全浸没于所述微生物菌剂中10min后用于播种；或将所述微生物菌剂浇灌在蔗种种植穴内，每穴50-100ml。
[0018]
本发明还提供一种灰锈赤链霉菌ys21在生物防治菌剂中的应用。
[0019]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明灰锈赤链霉菌ys21是一种具有广谱抗菌活性的菌株，该菌株尤其对甘蔗凤梨病病原菌有明显的抑制作用，具有抑菌光谱、抑菌效果明显，低毒环保，甘蔗农药残留量极少，并且避免病原菌产生耐药性的优点。
[0020]
含有该菌的微生物菌剂制备所需的条件简单易得，方法简单易行，可以减少化学杀菌剂的使用，具有良好的理论价值和实际应用开发前景。
附图说明
[0021]
图1是灰锈赤链霉菌ys21在高氏一号培养基上的菌落形态。
[0022]
图2是灰锈赤链霉菌ys21及其近缘菌株所构成的系统发育进化树。
[0023]
图3是灰锈赤链霉菌ys21对甘蔗凤梨病病原菌的抑制效果。
具体实施方式
[0024]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明方案做进一步详细说明。如无特别说明，本发明的实验方法均采用本领域的通用的实验方法，本发明的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过市购获得的常规试剂。应当理解，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
[0025]
本发明实施例中的培养基均可通过商业途径获得，配方如下：高氏一号培养基成分(g/l)：可溶性淀粉20.0、磷酸氢二钾0.5、硝酸钾1.0、硫酸镁0.5、硫酸亚铁0.01、氯化钠0.5、琼脂15.0，ph 7.0-7.5。
[0026]
lb液体培养基成分(g/l)：胰蛋白胨10.0、酵母浸粉5.0、氯化钠10.0，ph 7.0-7.2。
[0027]
察氏琼脂培养基成分(g/l)：nano
3 3.0、k2hpo
4 1.0、mgso
4 0.5、kcl 0.5、feso
4 0.01、蔗糖30.0、琼脂20.0。
[0028]
淀粉铵琼脂培养基成分(g/l)：(nh4)2so
4 2.0、caco
3 3.0、k2hpo
4 1.0、可溶性淀粉10.0、mgso
4 1.0、nacl 1.0、琼脂20.0。
[0029]
贝奈特培养基成分(g/l)：葡萄糖10.0、牛肉膏1.0、酵母膏1.0、水解酪素2.0、琼脂15.0。
[0030]
葡萄糖酵母膏琼脂培养基成分(g/l)：葡萄糖10.0、酵母膏10.0、琼脂20g，ph 7.2。
[0031]
实施例1：菌株的分离取样地为广西大学农学院甘蔗试验田，选取健康甘蔗植株根际土壤，梯度稀释法分离根际土壤中的链霉菌，即取1g土壤用无菌水分别稀释10倍、100倍、1000倍后，涂布于加入放线菌酮（50 μg/ml）和萘啶酮酸（15 μg/ml）的高氏一号培养基上，在35℃条件下培养3-5天，长出链霉菌后放入4℃环境下备用，获得灰锈赤链霉菌ys21（图1）。
[0032]
实施例2：菌株的生长特征挑取灰锈赤链霉菌ys21于高氏一号培养基、察氏琼脂培养基、淀粉铵琼脂培养基、贝奈特培养基、葡萄糖酵母膏琼脂培养基上，35℃条件下培养7d后观察菌落形态，归纳培养特征（表1）。
[0033]
表1灰锈赤链霉菌ys21的形态及培养特征
培养基气生菌丝体基质菌丝体可溶性色素丰茂度菌落正反颜色高氏一号培养基蚌肉白酪黄色有+++不一致察氏琼脂培养基白色白色无+一致淀粉铵琼脂培养基酪黄色酪黄色无+++一致贝奈特培养基白色酪黄色有++一致葡萄糖酵母膏琼脂培养基白色棕色有++不一致
注
“‑”
：不生长；“+”：生长；“++”：生长良好；“+++”：旺盛生长。
[0034]
实施例3：16s rrna序列特征分析
使用细菌16s rrna通用引物27f：agagtttgatcctggctcag和1492r：tacggytaccttgttacgactt对灰锈赤链霉菌ys21基因组进行pcr扩增，将扩增后产物进行序列测定。测序得到16s rrna基因片段序列如（seq id no：1）序列表所示，长度为1416bp。将所得序列在ncbi数据库中比对并下载相似度最高的同源序列，使用mega软件建立系统发育进化树 (图2)。
[0035]
实施例4：平板对峙法测定灰锈赤链霉菌ys21的抗真菌效果供试菌株为甘蔗凤梨病病原菌奇异长喙壳菌[ceratocystis paradoxa (de seynes) moreau]。用于测定抗真菌效果的平板培养基为高氏一号培养基。将灰锈赤链霉菌ys21和甘蔗凤梨病病原菌同时接种于同一平板上，3个重复，7d后观察抑菌带宽为2.45
±
0.06cm（图3）。
[0036]
实施例5：微生物菌剂制备方法（1）将灰锈赤链霉菌ys21接种到lb液体培养基，在温度为32-35℃，转速160-190rpm条件下培养3天，得到培养液；（2）将培养液于转速8000-10000rpm条件下离心后，用无菌水清洗2-3次，使用无菌水调节菌液浓度为10
8-109cfu/ml，得到微生物菌剂。
[0037]
实施例6：微生物菌剂在防治甘蔗凤梨病上的应用将100个甘蔗蔗种浸染甘蔗凤梨病病原菌后分为5行，每行20个蔗种于温室种植，此为一个种植小区。共设置12个种植小区，设4个处理，每个处理设3个种植小区。处理1为对照小区，每个种植穴浇灌50ml无菌水；处理2为多菌灵可湿性粉剂(购于四川国光农化股份有限公司)1000倍稀释液，每个种植穴浇50 ml；处理3为50％甲基硫菌灵悬浮剂（购于山西德威本草生物科技有限公司）400倍稀释液，每个种植穴浇灌50ml；处理4为每个种植穴浇灌50ml微生物菌剂（实施例5方法制备的微生物菌剂）。30d后观察甘蔗凤梨病发生率，处理1对照小区甘蔗凤梨病发生率分别为83%、77%、81%，处理2的种植小区甘蔗凤梨病的发生率为：55%、57%、50%，处理3的种植小区甘蔗凤梨病的发生率为54%、52%、49%，处理4的种植小区甘蔗凤梨病发生率分别为31%、35%、32%。使用微生物菌剂（处理4）后，与多菌灵（处理2）和甲基硫菌灵（处理3）相比，甘蔗凤梨病发病率平均分别下降21%和19%；与对照（处理1）相比，甘蔗凤梨病发病率平均下降47%。
[0038]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的包含范围之内。