新型冠状病毒单克隆抗体XY6及其应用

新型冠状病毒单克隆抗体xy6及其应用
1.本技术是申请号为2021101325814，申请日为2021年1月31日，发明名称为：新型冠状病毒单克隆抗体及其应用，的分案申请。
技术领域：
2.本发明属于单克隆抗体筛选和制备技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒单克隆抗体xy6及其应用。


背景技术：

3.sars-cov-2为线性单股正链的rna病毒，其结构蛋白包括刺突蛋白(spike，s)、小包膜蛋白(envelope，e)、囊膜蛋白(membrance，m)及核蛋白(nucleocapsid，n)。s蛋白由s1和s2亚基构成。
4.sars-cov-2通过病毒颗粒表面的刺突蛋白(spike蛋白，s蛋白)与肺部上皮细胞表面的血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ace2)的膜蛋白结合，ace2随后发生形状结构的变化，导致病毒进入细胞内。基于新冠病毒致病机制，通过s蛋白的中和抗体阻断s蛋白与细胞表面ace2的结合，从而阻断病毒进入细胞。
5.当sars-cov-2入侵体内时，会诱导机体产生相应的效应b细胞和记忆b细胞，效应b细胞会产生抗体，该抗体可用于sars-cov-2的诊断和治疗。从sars-cov-2康复者获得的血浆输入sars-cov-2重症患者体内，症状可以得到明显改善。但是面对庞大数量的患者，sars-cov-2康复者血浆数量有限，可以通过筛选sars-cov-2康复者体内针对sars-cov-2的有效中和抗体，通过基因工程和蛋白表达技术，体外大规模生产单克隆抗体。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的是提供针对sars-cov-2的特异单克隆抗体及其应用。从sars-cov-2康复者体内获取单核细胞构建噬菌体库，快速筛选到针对sars-cov-2特异性抗体，该抗体可用于新型冠状病毒sars-cov-2的临床检测、诊断、预防和治疗。
7.为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
8.从sars-cov-2康复者体内抽取外周血，获取单核细胞并提取总rna,合成cdna，使用重链可变区和轻链可变区兼并引物，扩增重链可变区和轻链可变区，获得的重链可变区和轻链可变区进行随机组合，并与噬菌体载体进行重组，重组产物转化xl1-blue，加入辅助噬菌体vcsm13获得滴度≈10
13
大小sars-cov-2噬菌体抗体库。使用抗原s1或rbd，筛选出抗fab的抗体，通过测序，获得能与s1或rbd结合的重链可变区和轻链可变区序列，重链可变区组装上igg1的fc片段，抗体重链和轻链同时在哺乳动物细胞中表达，表达出全人源化抗s1或rbd的抗体。通过体外亲和力测定及假病毒中和实验，筛选到可用于sars-cov-2检测、诊断、预防或治疗用单克隆抗体。
9.本发明筛选到的新型冠状病毒抗体，包括xy1、xy2、xy3、xy4、xy5、xy6、xy7、xy8、xy9、xy10、xy11总共11种抗体。
10.本发明筛选到的：
11.xy1抗体重链可变区包含:
12.cdrh1氨基酸序列：edtftshy
13.cdrh2氨基酸序列：inptggsi
14.cdrh3氨基酸序列：arggftpdtsapmdv
15.优选xy1抗体重链可变区氨基酸序列：
16.gstgdqvqlvqsgaevkkpgasvkvscrasedtftshyihwvrqapgqglewmgiinptggsisyaqkfqgrvamtkdtststvymelsslrsedtavyycarggftpdtsapmdvwgqgtmvtvss；
17.xy1抗体轻链可变区包含:
18.cdrl1氨基酸序列：qgirns
19.cdrl2氨基酸序列：das
20.cdrl3氨基酸序列：qhyfgtplt
21.优选xy1抗体轻链可变区氨基酸序列：
22.gstgdaeivmtqspsslsasegdrviitcrasqgirnslawyqqkpgkapklllydasklesgvpsrfsgsgsgthftltidslqpedfatyycqhyfgtpltfgggtkveik；
23.xy2抗体重链可变区包含:
24.cdrh1氨基酸序列：edtftshy
25.cdrh2氨基酸序列：inptggsi
26.cdrh3氨基酸序列：arggftpdtsapmdv
27.优选xy2抗体重链可变区氨基酸序列：
28.gstgdevqlvesgaevkkpgasvkvscrasedtftshyihwvrqapgqglewmgiinptggsisyaqkfqgrvamtkdtststvymelsslrsedtavyycarggftpdtsapmdvwgqgtmvtvss；
29.xy2抗体轻链可变区包含:
30.cdrl1氨基酸序列：qtisky
31.cdrl2氨基酸序列：eas
32.cdrl3氨基酸序列：qqsyssrft
33.优选xy2抗体轻链可变区氨基酸序列：
34.gstgdaairltqspsslsasvgdtvtitcrasqtiskylhwyqqkpgeapklliseastfqggvssrfsgsrsgtdftltiyslqpedsatyycqqsyssrftfgpgtkveik；
35.xy3抗体重链可变区氨基酸序列包含：
36.cdrh1氨基酸序列：edtftshy
37.cdrh2氨基酸序列：inptggsi
38.cdrh3氨基酸序列：arggftpdtsapmdv
39.优选xy3抗体重链可变区氨基酸序列：
40.gstgdevqlvesgaevkkpgasvkvscrasedtftshyihwvrqapgqglewmgiinptggsisyaqkfqgrvamtkdtststvymelsslrsedtavyycarggftpdtsapmdvwgqgtmvtvss；
41.xy3抗体轻链可变区氨基酸序列包含：
42.cdrl1氨基酸序列：qgissw
43.cdrl2氨基酸序列：aas
44.cdrl3氨基酸序列：qqansfplt
45.优选xy3抗体轻链可变区氨基酸序列：
46.gstgdaaiqmtqspssvsasvgdrvtitcrasqgisswlawyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqansfpltfgqgtkleik；
47.xy4抗体重链可变区氨基酸包含：
48.cdrh1氨基酸序列：ggtfssia
49.cdrh2氨基酸序列：iipifgta
50.cdrh3氨基酸序列：ardvieatiygmdv
51.优选xy4抗体重链可变区氨基酸序列：
52.gstgdqvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssiainwvrqapgqglawmgkiipifgtanyaqkfqgrvtmtadestntaymelsslrsedtavyycardvieatiygmdvwgqgttvtvss；
53.xy4抗体轻链可变区氨基酸包含：
54.cdrl1氨基酸序列：qsisty
55.cdrl2氨基酸序列：gas
56.cdrl3氨基酸序列：qqsysapyt
57.优选xy4抗体轻链可变区氨基酸序列：
58.gstgdadivmtqspsslpasvgdrvtitcrtsqsistyvnwyqqksgnapellmygasilqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsysapytfaqgtkleir；
59.xy5抗体重链可变区氨基酸包含：
60.cdrh1氨基酸序列：edtftshy
61.cdrh2氨基酸序列：inptggsi
62.cdrh3氨基酸序列：arggftpdtsapmdv
63.优选xy5抗体重链可变区氨基酸序列：
64.gstgdqvqlvqsgaevkkpgasvkvscrasedtftshyihwvrqapgqglewmgiinptggsisyaqkfqgrvamtkdtststvymelsslrsedtavyycarggftpdtsapmdvwgqgtmvtvss；
65.xy5抗体轻链可变区氨基酸序列包含：
66.cdrl1氨基酸序列：qgvsny
67.cdrl2氨基酸序列：aas
68.cdrl3氨基酸序列：qhydsppyt
69.优选xy5抗体轻链可变区氨基酸序列：
70.gstgdaviwmtqspsslsasmgdrvtitcrasqgvsnylawyqhkpgkapelliyaastlqsgvpsrfsasrsgtdftltisslqpediatyycqhydsppytfgqgtklevk；
71.xy6抗体重链可变区氨基酸序列包含：
72.cdrh1氨基酸序列：edtftshy
73.cdrh2氨基酸序列：inptggsi
74.cdrh3氨基酸序列：arggftpdtsapmdv
75.优选xy6抗体重链可变区氨基酸序列：
76.gstgdevqlvqsgaevkkpgasvkvscrasedtftshyihwvrqapgqglewmgiinptggsisyaqkfqgrvamtkdtststvymelsslrsedtavyycarggftpdtsapmdvwgqgtmvtvss；
77.xy6抗体轻链可变区氨基酸序列包含：
78.cdrl1氨基酸序列：alakhf
79.cdrl2氨基酸序列：kdt
80.cdrl3氨基酸序列：qspdttgri
81.优选xy6抗体轻链可变区氨基酸序列：
82.gstgdasyeltqppsvsvspgqtaritcsgdalakhfghwyqqrpgqapvlviykdterplgiperfsgsssgatvtltisaveaedeadyycqspdttgrifgggtkvtvlgqpka；
83.xy7抗体重链可变区氨基酸序列包含：
84.cdrh1氨基酸序列：edtftshy
85.cdrh2氨基酸序列：inptggsi
86.cdrh3氨基酸序列：arggftpdtsapmdv
87.优选xy7抗体重链可变区氨基酸序列：
88.gstgdqvqlvqsgaevkkpgasvkvscrasedtftshyihwvrqapgqglewmgiinptggsisyaqkfqgrvamtkdtststvymelsslrsedtavyycarggftpdtsapmdvwgqgtmvtvss；
89.xy7抗体轻链可变区氨基酸序列包含：
90.cdrl1氨基酸序列：qgissw
91.cdrl2氨基酸序列：aas
92.cdrl3氨基酸序列：qqsysiprt
93.优选xy7抗体轻链可变区氨基酸序列：
94.gstgdaairltqspssvsasvgdrvtitcrasqgisswlawyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsysiprtfgqgtkleik；
95.xy8抗体重链可变区氨基酸序列包含：
96.cdrh1氨基酸序列：edtftshy
97.cdrh2氨基酸序列：inptggsi
98.cdrh3氨基酸序列：arggftpdtsapmdv
99.优选xy8抗体重链可变区氨基酸序列：
100.qvqlvqsgaevkkpgasvkvscrasedtftshyihwvrqapgqglewmgiinptggsisyaqkfqgrvamtkdtststvymelsslrsedtavyycarggftpdtsapmdvwgqgtmvtvss；
101.xy8抗体轻链可变区氨基酸序列包含：
102.cdrl1氨基酸序列：qdisdw
103.cdrl2氨基酸序列：rav
104.cdrl3氨基酸序列：qqtntfpit
105.优选xy8抗体轻链可变区氨基酸序列：
106.gstgdaviwmtqspiqmtqspssvsayvgdrvtitcrasqdisdwlawyqqapgkapklliyravtlqddvpsrfsgsgsgtdfsltitglqredfatyycqqtntfpitfghgtrleik；
107.xy9抗体重链可变区氨基酸序列包含：
108.cdrh1氨基酸序列：edtftshy
109.cdrh2氨基酸序列：inptggsi
110.cdrh3氨基酸序列：arggftpdtsapmdv
111.优选xy9抗体重链可变区氨基酸序列：
112.gstgdevqlvqsgaevkkpgasvkvscrasedtftshyihwvrqapgqglewmgiinptggsisyaqkfqgrvamtkdtststvymelsslrsedtavyycarggftpdtsapmdvwgqgtmvtvss；
113.xy9抗体轻链可变区氨基酸序列包含：
114.cdrl1氨基酸序列：ssdvgsynl
115.cdrl2氨基酸序列：evt
116.cdrl3氨基酸序列：isyagnnnlv
117.优选xy9抗体轻链可变区氨基酸序列：
118.gstgdaqsaltqppsvsgapgqtvtisctgtssdvgsynlvswyqqhpgkapkliiievtkrppgvpdrfsgsksgntasltvtglqaedeadyhcisyagnnnlvfgggtqltvlgqpka；
119.xy10抗体重链可变区氨基酸序列包含
120.cdrh1氨基酸序列：edtftshy
121.cdrh2氨基酸序列：inptggsi
122.cdrh3氨基酸序列：arggftpdtsapmdv
123.优选xy10抗体重链可变区氨基酸序列：
124.gstgdqvqlvqsgaevkkpgasvkvscrasedtftshyihwvrqapgqglewmgiinptggsisyaqkfqgrvamtkdtststvymelsslrsedtavyycarggftpdtsapmdvwgqgtmvtvss；
125.xy10抗体轻链可变区氨基酸序列包含：
126.cdrl1氨基酸序列：ssdigrss
127.cdrl2氨基酸序列：rnn
128.cdrl3氨基酸序列：aawdntlrgyv
129.优选xy10抗体轻链可变区氨基酸序列：
130.gstgdasyeltqlpsasgtpgqrvtiscsgsssdigrssvnwyqqlpgtapklliyrnnqrpsgvpdrlsgsksgtsgslaisglqsedeadyycaawdntlrgyvfgtgtkvtvlgqpka；
131.xy11抗体重链可变区氨基酸序列包含：
132.cdrh1氨基酸序列：edtftshy
133.cdrh2氨基酸序列：inptggsi
134.cdrh3氨基酸序列：arggftpdtsapmdv
135.优选xy11抗体重链可变区氨基酸序列：
136.gstgdqvqlvqsgaevkkpgasvkvscrasedtftshyihwvrqapgqglewmgiinptggsisyaqkfqgrvamtkdtststvymelsslrsedtavyycarggftpdtsapmdvwgqgtmvtvss；
137.xy11抗体轻链可变区氨基酸序列包含：
138.cdrl1氨基酸序列：qsvlfspnnkny
139.cdrl2氨基酸序列：was
140.cdrl3氨基酸序列：qqydsspwt
141.优选xy11抗体轻链可变区氨基酸序列：
142.gstgdadiqltqspdslavslgeratinckssqsvlfspnnknylawyqqkpgqppklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqydsspwtfgqgtkveik。
143.本发明抗体除了包含上述重链和轻链可变区，还包含常规的恒定区。
144.本发明所述的新型冠状病毒抗体包括:xy1、xy2、xy3、xy4、xy5、xy6、xy7、xy8、xy9、xy10、xy11，11种抗体通过检测亲和力及体外中和实验，发现这11种抗体亲和力更加优异，都达到nm水平，而且对假病毒都具有中和作用；进一步优选包括xy4、xy10两种抗体的组合，两者的叠加中和效应非常显著。
145.本发明所述的新型冠状病毒抗体，优选xy1、xy4、xy7、xy10四种抗体中的至少一种是用于新型冠状病毒治疗的抗体；这四种抗体的ic50值具有显著优势；进一步优选xy4和xy10抗体组合是用于新型冠状病毒治疗的抗体。根据不同抗体组合elisa检测结果显示xy4适合于做检测抗原时的检测相；xy1、xy2、xy3、xy5、xy6、xy7、xy8、xy9抗体中的至少一种适合用于检测抗原时的包被相抗体。
146.本发明进一步的优选提供包被相和检测相的抗体组合在制备检测新型冠状病毒试剂中的应用：
147.包被相抗体xy1组合检测相抗体xy4、xy7、xy8、xy9、xy10、xy11中的至少一种，优选检测相抗体xy4、xy10中的至少一种，进一步优选检测相抗体xy4。
148.包被相抗体xy2组合检测相抗体xy4、xy9、xy10中的至少一种，优选检测相抗体xy4、xy10中的至少一种；进一步优选检测相抗体xy4。
149.包被相抗体xy3组合检测相抗体xy4、xy10中的至少一种，优选检测相抗体xy4。
150.包被相抗体xy4组合检测相抗体xy2、xy8，xy10中的至少一种，优选检测相抗体xy10；
151.包被相抗体xy5组合检测相抗体xy4、xy10中的至少一种，优选检测相抗体xy4；
152.包被相抗体xy6组合检测相抗体xy4、xy10中的至少一种，优选检测相抗体xy4；
153.包被相抗体xy7组合检测相抗体xy4、xy10中的至少一种，优选检测相抗体xy4；
154.包被相抗体xy8组合检测相抗体xy4、xy10中的至少一种，优选检测相抗体xy4；
155.包被相抗体xy9组合检测相抗体xy4、xy10中的至少一种，优选检测相抗体xy4；
156.包被相抗体xy10组合检测相抗体xy4；
157.包被相抗体xy11组合检测相抗体xy4。
158.本发明所述的新型冠状病毒中和抗体，还包括重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列与前述的11种抗体重链可变区氨基酸序列和抗体轻链可变区氨基酸序列具有80％以上的相同性的序列。
159.本发明还包括抗体氨基酸序列的保守序列变体的抗体也包括在本发明的范围之内。保守氨基酸序列变体包括不显著改变本发明的中和抗体性质的氨基酸序列的修饰，如源于本领域熟知的相似氨基酸替代的变体，氨基酸的缺失、增加导致的变体。
160.本发明的中和抗体还包括人源与非人源抗体，以及具有与上述中和抗体相同功能或改造及优化的一切抗体。还包括：糖基化或者聚乙二醇修饰等。
161.本发明所述的新型冠状病毒单克隆抗体，还包括fab、fab
′‑
sh、fv、scfv、(fab
′
)2片段中的任一种，包含前述的抗体重链可变区和轻链可变区组合片段中的任一种。
162.fab是指含有一条轻链的可变区和恒定区和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的抗体分子的一部分。
163.fab
’‑
sh是指包含了部分铰链区的fab片段。
164.fv指的是含有抗体重链可变区、轻链可变区并具有全部抗原结合位点的最小抗体
片段。
165.scfv指的是由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体。
166.(fab’)2指的是fab’的二聚体。
167.本发明还提供了所述的新型冠状病毒中和抗体的重链和轻链可变区的核酸序列。
168.还包括与其具有80％以上的相同性的核酸序列或含有与其表达相同氨基酸的兼并密码子的核酸序列。
169.本发明还提供了一种检测、预防或者治疗新型冠状病毒的制剂，包括所述的新型冠状病毒中和抗体。
170.本发明还提供了所述的新型冠状病毒中和抗体的应用，包括以下中的任一种或多种；
171.(1)用于制备新型冠状病毒检测制剂；
172.(2)用于制备预防新型冠状病毒感染的制剂；
173.(3)用于制备治疗新型冠状病毒感染的制剂。
174.本发明通过从新冠康复者体内获得单核细胞，提取rna，然后反转录成cdna，通过兼并重链可变区和轻链可变区引物，扩增出抗体的重链和轻链，再将重链可变区和轻链可变区组装到噬菌体载体上，构建出sars-cov-2 fab噬菌体抗体库；使用抗原s1或rbd(rbd为s1蛋白中一段蛋白，与ace2的结合起关键作用)，筛选出抗fab的抗体，通过测序，获得能与s1或rbd结合的重链可变区和轻链可变区序列，重链变区组装上igg1的fc片段，抗体重链和轻链同时在哺乳动物细胞中表达，表达出全人源化抗rbd或s1的抗体。通过体外亲和力测定及假病毒中和实验，筛选到亲和力和病毒中和能力较强的可用于sars-cov-2检测、诊断、预防或治疗用单克隆抗体。对新型冠状病毒的预防、治疗起到积极的推动作用。
附图说明
175.图1为抗体重链可变区扩增电泳条带；
176.图2为抗体轻链可变区κ链扩增电泳条带；
177.图3为抗体轻链可变区λ链扩增电泳条带；
178.图4为抗体重链和轻链融合后电泳条带；
179.图5为sfii酶切pc3c质粒后的电泳条带；
180.图6为pc3c质粒连接抗体重链和轻链融合后产物转化xl1-blue进行菌落pcr鉴定结果；
181.图7为第5轮富集噬菌体抗体库elisa检测；
182.对照孔中加入辅助噬菌体(vcms13)，实验组加入的第5轮富集噬菌体；
183.图8为rbd噬菌体加入到xl1-blue进行单克隆菌液pcr鉴定结果；
184.图9为单克隆抗体的表达及考马斯亮蓝染色；
185.图10为单克隆抗体elisa鉴定结果；
186.对照孔不加入抗体，但加入抗人fab-hrp二抗；
187.图11为单克隆抗体ic50测定；
188.图12为利用抗体xy1、xy4、xy7、xy10组合，检测抗体叠加中和效应。
具体实施方式：
189.以下结合具体实施例对本发明作进一步的描述，而不会形成对本发明的限制。
190.本发明实施例中使用的sars-cov-2的rbd蛋白购买于北京义翘神州生物科技有限公司，sars-cov-2的s1购于北京百谱赛斯生物科技有限公司。
191.本发明噬菌体抗体库构建方法参考于：antony s.dimitrov(ed.),generation and selection of rabbit antibody libraries by phage display，2009，therapeμtic antibodies:methods and protocols,vol.525，101-128.
192.实施例1
193.一、噬菌体抗体库的构建
194.获取18份sars-cov-2康复者外周血(血样来源于康复出院1月以内的康复者)使用人外周血淋巴分离液分离单核细胞。提取总rna，18份rna等量混合，反转录成cdna，使用重链可变区和轻链可变区兼并引物，扩增获得重链可变区和轻链可变区片段，将抗体重链可变区和轻链可变区进行随机拼接并与噬菌体载体连接，并转化xl1-blue菌(购自于唯地生物科技有限公司)，在辅助噬菌体vscm13(购自ntcc国家典型培养物保藏中心)存在条件下，组装成噬菌体抗体展示库。
195.具体包括以下步骤：
196.1、单核细胞分离
197.从18位sars-cov-2康复者身上每人抽取10ml外周血，使用人外周血淋巴分离液(lts1077-1，天津灏洋生物制品科技有限责任公司，)分离单核细胞。
198.(1)采血：无菌抽取供血者外周血10ml，加入抗凝剂(肝素为30u/ml)分装于15ml离心管中。
199.(2)将装有抗凝全血的15ml离心管，3000rpm，10min，加速度7，减速度6。
200.(3)将上层血浆吸出，下层细胞加入等体积pbs稀释。
201.(4)取一支50ml离心管，先加入与血液样本等量的分离液。
202.(5)用吸管小心吸取血液样本加于分离液之液面上，500-1100g(1800rpm)，离心10min，加速度5，减速度4。
203.(6)离心后，此时离心管中由上至下分为四层；第二层为环状乳白色淋巴细胞层。
204.(7)用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层转移到新的15ml离心管中，向所得离心管中加入10mlpbs，混匀细胞。
205.(8)1800rpm，离心10min，加速度5，减速度4。
206.(9)弃上清，每支15ml离心管加入5ml的红细胞裂解液，稍微混匀后室温静置5min。
207.(10)1800rpm，离心10min，加速度5，减速度4。
208.(11)弃上清，吸取10ml pbs重悬所得细胞。
209.(12)1800rpm，离心10min，加速度5，减速度4。
210.(13)弃上清，沉淀为pbmc。
211.2、总rna提取
212.将获得的单核细胞，按照5x106个细胞加入0.75ml trizol(thermo fisher)提取总rna，然后各取1μg rna将18份rna等量混合。
213.(1)5x106个细胞中加入0.75ml trizol。
214.(2)上下混匀数次，冰上孵育5min，保证细胞充分裂解。
215.(3)4℃12000rpm离心10分钟，将上清转移到干净离心管。
216.(4)1mltrizol中加入0.2ml氯仿，混匀。
217.(5)冰上孵育2-3min。
218.(6)4℃12000rpm离心15分钟。
219.(7)转移上清水相到干净离心管。
220.(8)上清中加入等体积的异丙醇混匀。
221.(9)室温孵育10min，4℃12000rpm离心10-15分钟。
222.(10)弃上清，保留沉淀。
223.(11)加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀。
224.(12)4℃12000rpm离心5分钟。
225.(13)尽可能弃去上清。
226.(15)室温干燥5-10min，管壁上看不到液体。
227.(16)加入20-50μl无rnase的水回溶rna。
228.(17)取1μlrna电泳检测及测定rna浓度。
229.(18)将rna分装保存于-80℃冰箱，避免反复冻融。
230.3、cdna的合成
231.取5μg的rna，使用cdna合成试剂盒(k1612，thermo fisher)。
232.(1)取5μg rna量合成cdna。
233.(2)10μl的rna/primer mixtμre体系见下表1，包括：
234.表1
235.体系成份体积rna5μg50μm oligo(dt)
20
1μlhex random primer1μl10mm dntp1μldepc-treated water总体积10μl
236.(3)65℃孵育5min，置于冰上放置1min。
237.(4)按下表2添加其他试剂，准备cdna synthesis mix进行下一步反应。
238.表2
239.体系成分1反应10xrt buffer2μl25mm mgcl24μl0.1m dtt2μlrnaseoμt(40μ/μl)1μlsuperscript iii rt(200μ/μl)1μl
240.(5)加入10μl的cdna synthesis mix到rna/primer mixture轻轻混匀，离心，按下表3条件进行反应：
241.表3
242.step150℃50minstep285℃5min
ꢀꢀ
冰上冷却，简短离心step3rnaseh1μlstep437℃20min
243.(6)cdna产物分装保存于-20℃。
244.4、抗体重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)扩增
245.将合成的cdna稀释10倍，用于扩增重链可变区和轻链可变区的模板。
246.(1)体系配制如下表4，以vh为例：
247.表4
[0248][0249]
(2)反应条件见下表
[0250]
表5
[0251]
step198℃15sstep298℃10sstep355℃5sstep472℃5s
ꢀꢀ
go to step 2x34step572℃1m 30sstep64℃forever
[0252]
(3)电泳
[0253]
取10μl进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，确定是否扩增到目的条带，大小约400bp(见图1)。
[0254]
(4)将所有扩增的vh等量混合，加入0.1倍体积的3m乙酸钠和2.2倍体积的乙醇，混匀，-20℃放置过夜。
[0255]
(5)4℃，16000g离心15min，去上清，使用1ml 70％乙醇漂洗(室温)，室温干燥，加入200μl水回溶，1％的胶进行凝胶电泳。
[0256]
(6)将400bp大小条带切下，使用qiaquick gel extraction kit(qiagen，28706)
进行回收，测定浓度。
[0257]
(7)vl的扩增及回收按照步骤(1)-(6)进行操作，结果见图2，图3。
[0258]
(8)调整vh和vl纯化后核酸浓度，终浓度为100ng/μl，放-20℃储存。
[0259]
5、扩增cκ-pelb
[0260]
(1)以载体pcκ和pcl(载体购自于add gene)(100ng/μl)为模版扩增cκ-pelb和cl-pelb
[0261]
以扩增cκ-pelb为例，见表6。
[0262]
表6
[0263]
pcκ10μlhck(序列见前述的参考文献)60μlpelb(序列见前述的参考文献)60μlddh2o370μlprimerstar500μltotal1000μl
[0264]
(2)反应条件见表7
[0265]
表7
[0266]
step198℃15sstep298℃10sstep355℃5sstep472℃5s
ꢀꢀ
go to step 2x34step572℃1m 30sstep64℃forever
[0267]
(3)取10μl产物电泳检测，条带大小约400bp。
[0268]
(4)将所有扩增的cκ-pelb混合，加入0.1倍体积的3m乙酸钠和2.2倍体积的乙醇，混匀，-20℃放置过夜。
[0269]
(5)4℃，16000g离心15min，去上清，使用1ml 70％乙醇漂洗(室温)，室温干燥，加入200μl水回溶，使用1％的胶进行凝胶电泳。
[0270]
(6)将400bp大小条带切下，使用qiaquick gel extraction kit(qiagen，28706)进行回收，测定浓度。
[0271]
(7)稀释纯化后的cκ-pelb，终浓度为100ng/μl，放-20℃储存。
[0272]
(8)扩增cl-pelb，按照步骤(1)-(7)进行操作，扩增模板pcκ换成pcl。
[0273]
6、human vκ/human cκ/cl/human vh或human vλ/human cl/human vh融合
[0274]
以human vκ/human cκ/cl/human vh融合为例
[0275]
(1)按下表8将不同量的vl、vh、ck-pelb混合
[0276]
vl浓度100ng/μl，vh浓度100ng/μl，cκ-pelb浓度100ng/μl
[0277]
表8
[0278]
vl10μl
vh10μlck-pelb10μlprimerstar mix500μlh2o470μltotal1000μl
[0279]
(2)反应条件见表9
[0280]
表9
[0281]
step198℃15sstep298℃10sstep350℃5sstep472℃5sstep5 go to step 2x10step672℃1m 30sstep74℃forever
[0282]
(3)扩增human vl/human cκ/human vh，见表10
[0283]
表10
[0284]
拼接产物50μlc-5'sfivl(序列见前述的参考文献)4μlc-3'sfivh(序列见前述的参考文献)4μlddh2o17μlprimerstar25μltotal100μl
[0285]
(4)扩增条件见表11
[0286]
表11
[0287]
step198℃15sstep298℃10sstep355℃5sstep472℃5s(go to step2 x 39)step572℃1m 30sstep64℃forever
[0288]
(5)电泳检测
[0289]
取10μlpcr产物，电泳检测，融合后目的基因条带大小1.2kb。(结果见图4)
[0290]
(6)将所有扩增的human vl/human cκ/human vh，加入0.1倍体积的3m乙酸钠和2.2倍体积的乙醇，混匀，-20℃放置过夜。
[0291]
(7)4℃，16000g离心15min，去上清，使用1ml 70％乙醇漂洗(室温)，室温干燥，加入200μl水回溶，使用1％的胶进行凝胶电泳。
[0292]
(8)将1.2kb大小条带切下，使用qiaquick gel extraction kit(qiagen，28706)进行回收，测定浓度。
[0293]
(9)稀释human vl/hμman cκ/human vh纯化的核酸，终浓度为150ng/μl，放-20℃储存。
[0294]
(10)human vλ/human cl/human vh的融合按照步骤(1)-(9)进行操作。
[0295]
7、sfii酶切human vκ/human cκ/cl/human vh和human vλ/human cl/human vh
[0296]
以human vκ/human cκ/cl/human vh酶切为例
[0297]
(1)酶切体系见表12
[0298]
表12
[0299]
human vκ/human cκ/cl/human vh(150ng/μl)200μl10xbuffer30μlh2o60μlsfii 40u/μl10μl
[0300]
(2)50℃水浴，酶切反应3h。
[0301]
(3)使用1％凝胶进行电泳，将1.2kb大小的条带切下，使用qiaquick gel extraction kit(qiagen，28706)进行回收。
[0302]
(4)检测sfii酶切后回收human vl/human ck/human vh片段，调整浓度50ng/μl，-20℃保存。
[0303]
(5)酶切human vλ/human cl/human vh，按照步骤(1)-(4)进行操作。
[0304]
8、sfii酶切pc3c(载体购自于add gene)
[0305]
(1)酶切体系见表13
[0306]
表13
[0307]
pc3c 1μg/μl50μl10xbuffer30μlh2o208μlsfii 40u/μl12μl
[0308]
(2)50℃水浴，酶切反应3h。
[0309]
(3)使用1％凝胶进行电泳，会切出两条带，一条3.5kb和一条1.2kb大小片段。
[0310]
(结果见图5)
[0311]
(4)使用qiaquick gel extraction kit(qiagen，28706)回收3.5kb的载体骨架。
[0312]
(5)sfi酶切后回收载体骨架浓度调整为100ng/μl。
[0313]
9、连接pc3c(sfii)和human vl/human cκ/human vh(sfii)和human vλ/human cl/human vh
[0314]
以pc3c(sfii)和human vl/human cκ/human vh(sfii)连接为例
[0315]
(1)连接体系见表14
[0316]
表14
[0317]
100ng/μl sfii酶切后pc3c1.5μl50ng/μl sfii酶切后human vl/human cκ/human vh2μl10xt4 dna ligase buffer2μlh2o13.5μl
t4 dna ligase 2000u/μl1μl
[0318]
对照组见表15
[0319]
表15
[0320]
100ng/μl sfii酶切后pc3c1.5μl10xt4 dna ligase buffer2μlh2o15.5μlt4 dna ligase 2000u/μl1μl
[0321]
(2)16℃反应过夜。
[0322]
(3)合并所有连接反应物，加入1/10体积的3m乙酸钠溶液。
[0323]
(4)加入2.2倍体积预冷的无水乙醇，上下混合均匀，-20℃沉淀过夜。
[0324]
(5)16000g，4℃离心30min，小心弃上清。
[0325]
(6)加入70％乙醇轻轻清洗沉淀，16000g，4℃离心5min，弃上清。
[0326]
(7)室温干燥。
[0327]
(8)用适量的水进行溶解，通常1个连接反应用1μl体积ddh2o进行充分溶解,置-20℃保存。
[0328]
(9)连接pc3c(sfii)和human vλ/human cl/human vh按照步骤(1)-(8)进行操作。
[0329]
10、连接产物转化xl1-blue
[0330]
(1)xl1-blue电击感受态冰上放置10min进行溶解。
[0331]
(2)取19μl沉淀浓缩后的连接产物加入到1.5ml离心管，冰浴，加入300μl的xl1-blue电击感受态混匀，快速的转入2mm电击杯，冰上放置1min。
[0332]
(3)电击条件：2.5kv，4ms
[0333]
(4)电转结束后快速加入5ml(1ml+2ml+2ml)soc培养基，转入50ml尖底离心管，37℃，250rpm，培养1h。取2μl菌液加入198μl的lb中，同时均匀的涂在含100μg/μl羧苄青霉素lb平板上，37℃放置过夜培养，用于计算转化效率及菌落pcr鉴定阳性率。pcr结果见图6。
[0334]
(5)加入10ml sb培养基，3μl 100μg/μl羧苄青霉素，和30μl 5μg/μl四环素。37℃，250rpm，培养1h。
[0335]
(6)加入4.5μl 100μg/μl羧苄青霉素，继续37℃，250rpm，培1-4h。
[0336]
(7)将培养后的菌转移到500ml培养瓶，加入84ml sb培养基，42.5μl 100μg/μl羧苄青霉素，170μl 5μg/μl四环素，加1ml vcms13辅助噬菌体(10
11-10
12
pfu/ml)，37℃，275rpm，90min。
[0337]
(8)加入140μl 50μg/μl卡那霉素，37℃，275rpm，过夜培养。
[0338]
(9)3000g，4℃离心15min。
[0339]
(10)沉淀噬菌体
[0340]
上清(200ml)转移到500ml干净离心管，加入8g peg-8000和6g nacl，放入37℃，300rpm，5min促进溶解。冰上放置30min-1h。15000g，4℃离心15min。弃上清，将离心瓶颠倒放置在滤纸上放置10min干燥，小心的移去多余液体。使用含1％的bsa的tbs 2ml重悬噬菌体(移液器上下混匀)，16000g，4℃离心5min，上清过0.22μm滤膜(millipore)，转移到2ml离心管。短时间可直接放冰上存储，或者加0.01倍体积的2％叠氮化钠放4℃，对于长时间存储加1倍体积甘油放-20℃存储。
[0341]
二、噬菌体抗体库筛选
[0342]
以rbd噬菌体抗体筛选为例
[0343]
使用包被rbd蛋白的96孔板，进行5轮筛选，然后挑选单克隆鉴定rbd特异性抗体。
[0344]
1、抗原包被
[0345]
(1)将rbd加入到碳酸缓冲液，浓度2μg/ml，
[0346]
(2)康宁高蛋白吸附酶联免疫96孔板，每孔加入50μlrbd，4℃放置过夜；
[0347]
(3)弃去上清，加入5％的脱脂奶粉200μl/孔，37℃放置1h；
[0348]
(4)弃上清，0.05％的tbst洗涤5次。
[0349]
2、rbd抗体筛选
[0350]
(1)将噬菌体抗体库用2％的脱脂奶粉稀释10倍，取2个包被有rbd抗原的96孔微孔，加入100μl稀释后的噬菌体，37℃放置1h。
[0351]
(2)弃上清，0.05％的tbst洗涤5次，加入100μl 100mm甘氨酸，37℃放置15min,期间不断进行吹打，加入9μl 1m tris。
[0352]
(3)将步骤(2)洗脱下来的噬菌体加入到2ml的xl1-blue菌中，室温放置15min。
[0353]
(4)加入6ml sb培养基，加入1.6μl 100μg/μl的羧苄青霉素，12μg 5μg/μl的四环素，37℃，250rpm培养1h。
[0354]
(5)加入2.4μl 100μg/μl的羧苄青霉素继续培养1h；
[0355]
(6)加入1ml辅助噬菌体vcsm13(10
11-10
12
pfu/ml)，转移到500ml培养瓶，加入91ml sb培养基，加入46μl100μg/μl的羧苄青霉素，184μl5μg/μl的四环素，37℃，250rpm培养1.5h，加入140μl 50μg/μl的卡那霉素，37℃，250rpm过夜培养。
[0356]
(7)噬菌体抗体浓缩：将上一步菌液离心去菌体，收集上清(100ml)；加入4gpeg-8000和3g nacl，放入37℃，300rpm，5min促进溶解。冰上放置30min-1h。15000g，4℃离心15min。弃上清，将离心瓶颠倒放置在滤纸上放置10min干燥，小心移去多余液体。使用含1％bsa的tbs 2ml重悬噬菌体(移液器上下混匀)，16000g，4℃离心5min，上清过0.22μm滤膜(millipore)，转移至2ml离心管。短时间可直接放冰上存储，或者加0.01倍体积的2％叠氮化钠放4℃，对于长时间存储加1倍体积甘油放-20℃存储。
[0357]
(8)取步骤(7)噬菌体，按照步骤(1)-(7)进行5轮筛选。
[0358]
(9)五轮筛选的抗体库的elisa鉴定：
[0359]
1)elisa 96孔板，每孔包被100ng的rbd；
[0360]
2)加入100μl噬菌体(2％脱脂奶粉稀释10倍)37℃孵育1h；
[0361]
3)0.05％的tbst洗涤5次；
[0362]
4)加入5％脱脂奶粉稀释2000倍的抗m13-hrp抗体(购自北京义翘神州生物技术有限公司)100μl，37℃孵育1h；
[0363]
5)0.05％的tbst洗涤5次；
[0364]
6)加入100μl tmb，避光显色5min；
[0365]
7)加入50μl 1m h2so4终止反应。
[0366]
8)使用酶标仪在450nm处测定吸光度。
[0367]
结果见图7。
[0368]
3、rbd单克隆抗体鉴定
[0369]
(1)取第5轮筛选的rbd噬菌体，稀释10-7
，取1μl加入到200μl xl1-blue菌，室温放置15min；
[0370]
(2)将步骤(1)菌全部涂在含100μg/ml羧苄青霉素lb个体培养基上，37℃过夜培养；
[0371]
(3)挑选200个单克隆，加入到6ml的含10μg/ml四环素和100μg/ml羧苄青霉素的液体lb培养基中，37℃，250rpm培养xy4个小时，取少量菌液，进行菌液pcr鉴定，挑选能扩增出条带大小为1200bp的克隆(结果见图8)。
[0372]
菌落pcr扩增体系见表16：
[0373]
表16
[0374]
菌液0.5μlvhseq(序列见前述的参考文献)0.2μlvlseq(序列见前述的参考文献)0.2μlddh2o4.1μlprimerstar5μltotal10μl
[0375]
菌落pcr反应条件见表17：
[0376]
表17
[0377]
step198℃3minstep298℃10sstep350℃5sstep472℃15sstep5 go to step 2x34step672℃1m 30sstep74℃forever
[0378]
(4)将步骤(3)的阳性克隆菌液均匀分成2份，一份入3μl辅助噬菌体vcsm13(10
11-10
12
pfu/ml)，室温放置20min，加入2.1μl 50μg/μl的卡那霉素，另外一份不加任何物质，37℃，250rpm过夜培养；
[0379]
(5)将加入辅助噬菌体的菌4000rpm离心10min，将上清转入干净离心管，上清进行10倍稀释，取100μl加入到包被rbd的酶联免疫板，37℃孵育1h，0.05％的tbst洗涤5次，加入2000倍稀释的抗噬菌体带hrp标记的抗体(购于北京义翘神州生物技术有限公司)，37℃孵育1h，0.05％的tbst洗涤5次，加入100μltmb，显色2min，加入50μl 1m的h2so4终止反应，使用酶标仪在450nm处测定吸光度，吸光度高于对照2.1倍的为阳性克隆。
[0380]
(6)挑选步骤(5)阳性克隆，没有加入辅助噬菌体的菌，提取质粒，并进行测序，获得重链可变区和轻链可变区序列。
[0381]
4、s1噬菌体抗体筛选按照步骤1-3进行筛选。
[0382]
三、全人源化抗体的表达及活性鉴定
[0383]
1、全人源化载体构建
[0384]
(1)根据获得的抗体重链可变区或轻链可变区序列，设计相应的引物，分别扩增后，在重链和轻链n端都加入分泌信号肽，重链c端加入igg1的fc片段；
[0385]
(2)将重链可变区和轻链可变区分别同源重组到pcdna3.4载体。(pcdna3.4载体购自于武汉淼灵生物科技有限公司)
[0386]
2、全人源化抗体的表达
[0387]
(1)使用除内毒素中提试剂盒(购自omega)，分别提取对应的重链表达载体和轻链表达载体；
[0388]
(2)当293t细胞(购自于武汉普诺赛生命科技有限公司)融合度达到80％时，使用pei进行转染；
[0389]
(3)转染后12h，更换成无血清蛋白表达培养基，37℃，5％co2培养7天；
[0390]
(4)使用protein a/g填料纯化抗体。结果见图9。
[0391]
3、全人源化抗体活性鉴定
[0392]
以rbd抗体活性鉴定为例
[0393]
(1)elisa鉴定
[0394]
将获得的抗体调整为浓度1mg/ml，使用5％的脱脂奶粉稀释2000倍，加入到包被rbd抗原的酶联免疫孔中，37℃孵育1h，0.05％的tbst洗涤5次，加入5％的脱脂奶粉稀释2000倍抗人fab-hrp二抗(购自于北京索莱宝生物科技有限公司)，37℃孵育1h，0.05％的tbst洗涤5次，加入100μltmb，显色2min，加入50μl1m的h2so4终止反应，使用酶标仪在450nm处测定吸光度。结果见图10。
[0395]
(2)全人源化抗体假病毒中和检测
[0396]
1)将表达sars-cov-2 s蛋白的假病毒200个tcid50与一系列不同稀释浓度的抗体等量进行混合，总体积100μl，加入到96孔细胞培养板，37℃孵育1h，加入100μl含20000个过表达ace2的293t细胞；对照不加入抗体，等量假病毒与过表达ace2的293t混合；本底等量假病毒与293t细胞混合；37℃，5％的co2放置48h后，检测荧光强度。抑制效率＝(实验组-本底)/(对照-本底)*100％。结果见图11。
[0397]
2)利用全人源化抗体xy1、xy4、xy7、xy10组合，检测抗体叠加中和效应如下：将表达sars-cov-2 s蛋白的假病毒200个tcid50与一系列不同稀释浓度的抗体等体积进行混合(单个抗体浓度0.009766μg/ml；两个抗体组合时，等量混合，总浓度0.009766μg/ml)，总体积100μl，加入到96孔细胞培养板，37℃孵育1h，加入100μl含20000个过表达ace2的293t细胞；对照不加入抗体，等量假病毒与过表达ace2的293t混合；本底等量假病毒与293t细胞混合；37℃，5％的co2放置48h后，检测荧光强度。抑制效率＝(实验组-本底)/(对照-本底)*100％。
[0398]
结果见图12。
[0399]
(3)全人源化抗体亲和力测定
[0400]
抗体亲和力的测定使用biacore 8k(biacore，cytiva)进行检测，抗体稀释成20μg/ml的浓度，按照10μl/min流速，20s时间注入，产生1000rμ的响应。以50μl/min的流速和2分钟的注射时间测量对sars-cov-2rbd蛋白结合亲和力。亲和力结果见表18。
[0401]
表18抗体亲和力测定
[0402][0403][0404]
(4)抗体组合检测sars-cov-2的rbd进行检测
[0405]
采用elisa夹心法进行检测，将单克隆全人源化抗体xy1、xy2、xy3、xy4、xy5、xy6、xy7、xy8、xy9、xy10、xy11包被elisa板，加入sars-cov-2抗原rbd，加入xy1、xy2、xy3、xy4、xy5、xy6、xy7、xy8、xy9、xy10、xy11噬菌体抗体，并进行不同的组合，再加入带hrp标记抗m13的抗体，检测显色，颜色越深说明对sars-cov-2抗原捕获能力越强，同时也说明该对抗体适合于sars-cov抗原的检测。结果见表19。
[0406]
具体操作如下：
[0407]
1)elisa 96孔板，每孔包被100ng的全人源化抗体；
[0408]
2)加入100μl抗原(10pg/ml)，37℃孵育1h；
[0409]
3)0.05％的tbst洗涤5次；
[0410]
4)加入用2％脱脂奶粉稀释10倍的噬菌体抗体，37℃孵育1h；
[0411]
5)0.05％的tbst洗涤5次；
[0412]
6)加入5％脱脂奶粉稀释2000倍的抗m13-hrp抗体(购自于北京义翘神州生物技术有限公司)，37℃孵育1h；
[0413]
7)加入100μl tmb，避光显色5min；
[0414]
8)加入50μl 1m h2so4终止反应。
[0415]
9)使用酶标仪在450nm处测定吸光度。
[0416]
10)s1抗原的检测按照步骤(1)-(9)进行操作。
[0417]
下表19中纵列为单克隆全人源化抗体，横列为噬菌体抗体，噬菌体抗体和全抗体重链可变区和轻链可变区都相同，只是同一个抗体不同的形态，下表中下划线数据的组合显示出更为优异的效果。
[0418]
表19不同单克隆抗体交叉组合检测rbd蛋白
[0419]
xy1xy2xy3xy4xy5xy6xy7xy8xy9xy10xy11对照xy10.88480.73263.4973330.77350.4750671.0220331.01651.8006333.0020331.0666330.07912xy20.66350.79343.5614670.5511330.29240.6316330.8470331.06562.0194670.9587330.05423xy30.33610.590153.06770.335150.174450.3690.41250.57621.272650.649750.06881xy40.86881.18780.900050.607350.34710.99181.038550.831352.41420.905150.05987xy50.565050.790050.73132.830850.246350.697350.529150.77211.74830.60840.07762xy60.422050.558450.542152.72780.42060.50860.485250.77851.30350.7020..06931xy70.3980.734750.98443.11260.46790.18850.415150.921551.04760.64430.05542xy80.378350.464050.54553.08730.501250.249750.46810.79791.711950.685650.08339xy90.56950.54380.46392.34470.39120.2060.60990.455351.321550.529850.06871xy100.70530.756050.754153.22430.475250.178050.540150.52490.45935 0.57540.05324xy110.275350.46990.48942.72120.276350.138650.32550.47180.691850.92985 0.04996
[0420]
纵列为包被抗体，横列为检测抗体，空白对照不加噬菌体抗体，但加入辅助噬菌体vcsm13和抗m13-hrp抗体。
[0421]
经过上述一系列活性鉴定，获得单克隆全人源化抗体xy1、xy2、xy3、xy4、xy5、xy6、xy7、xy8、xy9、xy10、xy11共11种新型冠状病毒抗体。