一种无花果叶多糖及其制备方法与应用

1.本发明涉及天然成分提取技术，尤其涉及一种无花果叶多糖及其制备方法与应用。


背景技术：

2.无花果(ficus carica l.)为桑科榕属植物，原产于亚洲西部及地中海地区。多糖是无花果叶中重要的活性成分之一，路蕴等人研究了无花果叶多糖(polysaccharide fromficus carica l.leaves,fcllp)的超声提取工艺及其抗氧化活性，发现fcllp具有良好的抗氧化活性。王婷婷等人采用超声提取技术协同沸水提取fcllp，并采用响应面分析法优化了提取工艺，发现fcllp能有效的降低ⅱ型糖尿病小鼠空腹血糖及糖耐量水平，改善小鼠体重下降。朱佳琳等人采用微波法提取多糖并确定了fcllp的微波提取最佳工艺。姜宏伟发现利用超声-微波协同萃取技术提取fcllp具有时间短，得率高的优势，并且具有较强的抗肿瘤作用。邓佳丽等人发现fcllp可以诱导人体胃癌细胞sgc-7901 细胞凋亡基因表达，抗凋亡基因和周期基因表达受抑，细胞活性氧上升，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。方华等人申请的专利“一种无花果叶中多糖与总黄酮的提取方法”(申请号：201210389512.2)，该专利涉及一种无花果叶中多糖与总黄酮的综合提取方法。
3.综上所述，目前对无花果叶多糖的研究主要集中在粗多糖的提取、初步纯化及生物活性，但是对无花果叶多糖单一组分的纯化、结构特性及活性评价研究鲜见报道。无花果叶却随着每年无花果的采摘而被丢弃，造成资源的巨大浪费，因此本发明研究开发一种无花果叶单一多糖组分及其新的用途，对提高无花果叶附加值、开发无花果叶多糖作为一种新的土鸡免疫调节剂具有重要意义。


技术实现要素：

4.发明目的：针对现有技术的不足与缺陷，本发明提供一种无花果叶多糖及其制备方法，同时公开了该多糖组分产品在提高土鸡机体免疫力功能产品中的应用，可用于土鸡免疫佐剂产品颗粒剂的制备，可以作为免疫调节剂广泛应用于土鸡饲料添加剂领域。
5.技术方案：本发明的一种无花果叶多糖，其特征在于：以无花果叶为原料，经过分离纯化后获得的无花果叶中均一单糖组分，其分子量为21967da，其单糖组成为摩尔比 1.91:1.79:2.28:1.00的阿拉伯糖、木糖、葡萄糖与半乳糖。
6.一种无花果叶多糖的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：
7.(1)粗多糖的提取：将无花果叶洗净并粉碎，按照料液比g/ml为1:30-1:10加入水，在50℃-90℃温度下提取30min-100min后离心得上清液；在40℃温度下减压浓缩，向浓缩液加入四倍体积无水乙醇，在4℃温度下静置24h沉淀多糖，10000r/min离心 10min后收集得到沉淀，冷冻干燥沉淀后得到无花果叶粗多糖；
8.(2)粗多糖的纯化：将粗多糖配制成浓度20mg/ml的溶液，加入sevag试剂脱蛋白3次后通过透析袋透析24h，透析液冷冻干燥得到无花果叶纯化多糖；
9.(3)无花果叶多糖组分的分离：将纯化多糖配置成浓度10mg/ml的溶液，上样至 deae-sepharose cl-6b离子交换柱，依次用去离子水、浓度为0.1mol/l、0.3mol/l、 0.5mol/l、0.7mol/l的nacl溶液洗脱，洗脱流速为60ml/h，自动收集洗脱液5ml/管，苯酚-硫酸法检测od
490
后绘制洗脱曲线，选择性收集峰面积最大的主峰对应的洗脱液，即合并0.3mol/l的nacl溶液所对应的洗脱液，用去离子水对洗脱液透析3次，冷冻干燥得无花果叶多糖组分一次纯化物；
10.将无花果叶多糖组分一次纯化物配置成浓度为15mg/ml的溶液，上样至 sepharosecl-6b凝胶色谱柱，用浓度0.2mol/l的nacl溶液洗脱，洗脱流速为60ml/h，自动收集洗脱液5ml/管，苯酚-硫酸法检测od
490
后绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线，得到两个洗脱峰，选择性收集峰面积最大的主峰对应的洗脱液，用去离子水对洗脱液透析 24h，冷冻干燥得到无花果叶多糖组分二次纯化物，即最终产品。
11.优选的，所述的步骤(1)中料液比g/ml为1:20。
12.优选的，所述的步骤(1)中在80℃温度下提取60min后离心得上清液。
13.优选的，所述的步骤(3)中洗脱液透析采用透析袋，透析袋的截留分子量为7000da。
14.优选的，所述的步骤(3)中上样的色谱柱为deae-sepharose cl-6b离子交换柱和 sepharosecl-6b凝胶色谱柱。
15.一种无花果叶多糖在制备增强土鸡机体免疫力的功能产品方面的应用。
16.其中，所述的功能产品为颗粒剂。
17.其中，应用时，将无花果叶多糖组分产品、可溶性淀粉和糊精按照质量比例为3：2： 4混合均匀，加80％乙醇作为润湿剂制备软材，过40目筛制得颗粒剂，置于50℃烘箱中干燥2h，整粒，筛除细粉，即得多糖颗粒剂产品。
18.有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：本发明的多糖组分产品以无花果叶多糖为原料，经醇沉、deae-sepharose cl6b离子交换柱层析及sepharosecl-6b 凝胶色谱柱层析分离纯化获得，为天然提取物，具有良好的安全性。
19.经测试，本发明的多糖组分产品具有显著的增强机体免疫力作用，能够提高土鸡机体免疫力，可以作为免疫调节剂广泛应用于土鸡饲料添加剂领域。
附图说明
20.图1为本发明的无花果叶纯化多糖的deae-sepharose cl-6b洗脱曲线图；
21.图2为本发明的无花果叶多糖组分fcllp-0.3的sepharose cl-6b洗脱曲线图；
22.图3为本发明的无花果叶多糖组分fcllp-0.3-b单糖组成的高效液相色谱图；
23.图4为本发明的无花果叶多糖组分fcllp-0.3-b的分子量分布图；
24.图5为本发明的无花果叶多糖组分fcllp-0.3-b的紫外扫描图；
25.图6为本发明的无花果叶多糖组分fcllp-0.3-b的红外光谱图。
具体实施方式
26.下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案做进一步的描述。
27.本发明采用新鲜无花果叶。
28.本发明中所用的试剂：细胞因子il-2、il-12、tnf-α、ifn-γelisa试剂盒(武汉凯普瑞生物技术有限公司)；硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、tris-hcl缓冲溶液(50mmol/l， ph8.2)、邻苯三酚、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、乙醇等均为分析纯。
29.本发明中所用的仪器与设备：hh-2智能数显恒温水浴锅，re-52a旋转蒸发仪， shb-b95循环水式多用真空泵，el-800酶联检测仪，df-101s恒温加热磁力搅拌器， ftir-650傅里叶变换红外光谱仪，752紫外-可见分光光度计，uv2102 pcs紫外扫描仪， gc-14a气相色谱仪，waters 600高压液相气谱仪(美国waters公司)。所有实验做三次平行，数据表达为均值
±
sd，数据的统计分析采用t-检验或anova分析，p《0.05认为存在统计学差异。
30.另外，在下述的实施例中，如无特别说明，本发明中选用的所有试剂、原料和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
31.实施例1：无花果叶粗多糖的提取与纯化：
32.无花果叶清洗干净，粉碎，按照料液比为1:10(g/ml)加入水，在60℃条件下提取，提取时间90min，提取结束后离心得上清液，40℃减压浓缩，向浓缩液加入四倍体积无水乙醇，4℃静置24h沉淀多糖，10000r/min离心10min，收集得到沉淀，沉淀冷冻干燥后得到无花果叶粗多糖。将粗多糖配制成浓度为20mg/ml的溶液，加入sevag试剂(正丁醇:三氯甲烷＝1:4)脱蛋白3次，然后再通过透析袋(截留分子量7000da)透析24h，透析液冷冻干燥得到无花果叶纯化多糖。
33.实施例2：无花果叶粗多糖的提取与纯化：
34.无花果叶清洗干净，粉碎，按照料液比为1:15(g/ml)加入水，在80℃条件下提取，提取时间60min，提取结束后离心得上清液，40℃减压浓缩，向浓缩液加入四倍体积无水乙醇，4℃静置24h沉淀多糖，10000r/min离心10min，收集得到沉淀，沉淀冷冻干燥后得到无花果叶粗多糖。将粗多糖配制成浓度为20mg/ml的溶液，加入sevag试剂(正丁醇:三氯甲烷＝1:4)脱蛋白3次，然后再通过透析袋(截留分子量7000da)透析24h，透析液冷冻干燥得到无花果叶纯化多糖。
35.实施例3：无花果叶粗多糖的提取与纯化：
36.无花果叶清洗干净，粉碎，按照料液比为1:20(g/ml)加入水，在85℃条件下提取，提取时间50min，提取结束后离心得上清液，40℃减压浓缩，向浓缩液加入四倍体积无水乙醇，4℃静置24h沉淀多糖，10000r/min离心10min，收集得到沉淀，沉淀冷冻干燥后得到无花果叶粗多糖。将粗多糖配制成浓度为20mg/ml的溶液，加入sevag试剂(正丁醇:三氯甲烷＝1:4)脱蛋白3次，然后再通过透析袋(截留分子量7000da)透析24h，透析液冷冻干燥得到无花果叶纯化多糖。
37.实施例4：无花果叶粗多糖的提取与纯化：
38.无花果叶清洗干净，粉碎，按照料液比为1:30(g/ml)加入水，在90℃条件下提取，提取时间40min，提取结束后离心得上清液，40℃减压浓缩，向浓缩液加入四倍体积无水乙醇，4℃静置24h沉淀多糖，10000r/min离心10min，收集得到沉淀，沉淀冷冻干燥后得到无花果叶粗多糖。将粗多糖配制成浓度为20mg/ml的溶液，加入sevag试剂(正丁醇:三氯甲烷＝1:4)脱蛋白3次，然后再通过透析袋(截留分子量7000da)透析24h，透析液冷冻干燥得到无花果叶纯化多糖。
左右不存在吸收峰，表明fcllp-0.3-b经过纯化后不含有蛋白质。
51.如图6所示，从无花果叶多糖组分fcllp-0.3-b的红外光谱图中，可以观察到 3420cm-1
附近存在一个宽峰，这是由-oh的伸缩振动引起的；2930cm-1
附近的峰分别归属-ch
2-的不对称伸缩振动；1620cm-1
附近的强峰是典型的羰基所特有的吸收峰， 1099cm-1
附近的吸收峰归属吡喃环的伸缩振动。红外分析结果表明，fcllp-0.3-b符合吡喃型多糖的结构特征。
52.实施例7：fcllp-0.3-b多糖颗粒剂的制备：
53.将无花果叶多糖组分fcllp-0.3-b、可溶性淀粉和糊精按照质量比例为3:2:4混合均匀，加80％乙醇作为润湿剂制备软材，过40目筛制得颗粒剂，置于50℃烘箱中干燥2h，整粒，筛除细粉，即得fcllp-0.3-b多糖颗粒剂。
54.实施例8：无花果叶多糖fcllp-0.3-b颗粒剂对土鸡的免疫调节作用：
55.1、试验设计
56.选取200只健康、体重接近的1日龄土鸡，随机分为4组，每组5个重复，每个重复10只土鸡(公母各半)。对照组饲喂基础日粮，其他处理组分别在基础日粮中添加无花果叶多糖fcllp-0.3-b颗粒剂，添加量分别为5％(试验1组)、10％(试验2组)、 15％(试验3组)，试验周期为42d，基础日粮配制参考nrc(2012)鸡的营养标准和《鸡饲料标准》(ny/t 33-2004)。
57.2、饲养管理
58.试验土鸡采用双层立体笼养，饲养条件保持一致，每天定时饲喂2次，自由采食、饮水，自然光照和通风，常规消毒。免疫接种按照正常免疫程序进行，其他按正常饲养管理进行。
59.3、免疫功能指标的测定
60.在试验的第42天，开始进行样品采集(提前6h断料)，每个重复随机选取5只鸡，心脏采血2ml，离心(3000r/min，10min)分离血清，然后严格检测试剂盒说明书对血清中的iga、igg、igm、il-2、il-12、tnf-α、ifn-γ含量进行检测。
61.采血后颈部脱臼致死，解剖采集胸腺、脾脏和法氏囊组织称重，计算免疫器官指数，免疫器官指数计算公式如下：
62.免疫器官指数(g/kg)＝免疫器官重量(g)/土鸡体重(kg)。
63.4、数据分析
64.每组数据进行三次平行试验取平均值，以“平均值
±
标准差”表示，利用spss20软件处理数据软件进行方差分析和显著性分析，p《0.05表示存在显著性差异。
65.fcllp-0.3-b颗粒剂对土鸡免疫血清免疫球蛋白(iga、igg、igm)的影响如表1 所示，与对照组相比，在基础日粮中添加10％(试验2组)、15％(试验3组)的fcllp-0.3-b 颗粒剂，血清中iga、igm含量明显提高(p《0.05)，三个试验组血清中igg明显提高 (p《0.05)，说明fcllp-0.3-b颗粒剂能够通过提高土鸡免疫球蛋白含量，进而增强土鸡的免疫功能。
66.表1、fcllp-0.3-b颗粒剂对土鸡血清免疫球蛋白(iga、igg、igm)的影响
[0067][0068]
注：与对照组相比，同列数据肩标不同小写字母为差异显著(p《0.05)
[0069]
fcllp-0.3-b颗粒剂对土鸡血清il-2、il-12、tnf-α、ifn-γ含量的影响如表2所示，与对照组相比，在基础日粮中添加fcllp-0.3-b颗粒剂，血清中il-2、il-12、tnf-α、 ifn-γ含量明显提高(p《0.05或p《0.01)，说明fcllp-0.3-b颗粒剂能够促进细胞因子 il-2、il-12、tnf-α、ifn-γ的分泌而提高土鸡的免疫性能
[0070]
表2、fcllp-0.3-b颗粒剂对土鸡血清il-2、il-12、tnf-α、ifn-γ含量的影响
[0071][0072][0073]
注：与对照组相比，同列数据肩标不同小写字母为差异显著(p《0.05或p《0.01)
[0074]
fcllp-0.3-b颗粒剂对土鸡免疫器官指数的影响如表3所示，与对照组相比，在基础日粮中添加10％(试验2组)、15％(试验3组)的fcllp-0.3-b颗粒剂，胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数明显提高(p《0.05)，说明fcllp-0.3-b颗粒剂能够通过增加免疫器官质量，提高免疫指数进而增强土鸡的免疫功能
[0075]
表3、fcllp-0.3-b颗粒剂对土鸡免疫器官指数的影响
[0076][0077]
注：与对照组相比，同列数据肩标不同小写字母为差异显著(p《0.05)
[0078]
以上结果综合表明，fcllp-0.3-b颗粒剂通过提高土鸡免疫器官指数、免疫球蛋白含量，促进细胞因子il-2、il-12、tnf-α、ifn-γ的分泌来增强土鸡的免疫性能，可以作为免疫调节剂广泛应用于饲料中。
[0079]
上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作
出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。