一种降解交链孢酚的太平洋芽孢杆菌、生物制剂及其应用

本发明属于微生物应用，主要涉及一种降解交链孢酚的太平洋芽孢杆菌、生物制剂及其应用。

背景技术：

1、交链孢酚(alternariol，aoh)是链格孢菌产生的有毒次级代谢产物。1953年由raistrick等从alternaria tenuis中分离出，是检出率最高的链格孢毒素之一。近年来研究人员在农作物(玉米、小麦、大麦、高梁等)、水果(苹果、葡萄、橘柑、石榴)、蔬菜(西红柿、油菜、白菜等)均检出不同污染水平的交链孢酚。体内外试验发现，交链孢酚具有遗传毒性、细胞毒性、诱变性、类雌激素毒性以及致癌性，对人和动物具有潜在的危害。

2、目前，大多数关于链格孢毒素的研究旨在调查其生物合成、生理毒性、检测方法和污染状况。关于食品与饲料中交链孢酚脱毒技术研究主要集中在物理降解方面。wang等(2022)通过冷等离子体处理枣汁中的aoh 2分钟后，aoh减少了56.0％。aoh在食品、谷物饲料中的污染情况较为严重，给人类和动物造成潜在危害。因此，链格孢毒素去除技术的研究和应用将能大大提高谷物饲料和食品的安全性，保障人和动物的身体健康。目前关于aoh的生物降解研究稀缺，仅发现个别微生物菌株能够降解aoh。本发明旨在筛选能高效降解交链孢酚的有益微生物，并将其用于食品和饲料中交链孢酚的生物脱毒。最终，本发明克服上述缺点，筛选到一株对交链孢酚降解效果高，适合于果蔬及饲料中交链孢酚降解的太平洋芽孢杆菌(bacillus pacifiicus)ansb901，该菌有望作为新的菌种资源用于食品和饲料工业中交链孢酚的生物脱毒。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一株太平洋芽孢杆菌(bacillus pacifiicus)ansb901，该菌株已于2022年06月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.25071。

2、所述太平洋芽孢杆菌具有以下特性：

3、(1)菌落特征：菌落形态表面凸起，菌落呈圆形，不透明，边缘整齐，革兰氏染色阳性(图1)；光学显微镜下(图2)，菌株呈杆状且被覆鞭毛，尺寸为20.0-22.5μm(长)×10.0-11.5μm(宽)。

4、(2)分子特性：对菌株ansb901进行分子生物学鉴定，利用通用引物扩增，得到16srdna序列。使用琼脂糖凝胶检测其条带(图3)，测序后的拼接条带大小为1539bp。将测序结果经blast比对，绘制系统进化树(图4)，菌株ansb901与菌株bacillus pacifiicus mccc1a06182(nr_157733.1)的亲缘关系最近，相似性为99.60％，该菌株被鉴定并命名为太平洋芽孢杆菌bacillus pacifiicus。

5、(3)降解aoh的活性组分：试验结果表明，太平洋芽孢杆菌ansb901降解aoh的活性组分主要在菌体细胞中，其对aoh的降解活性为94％(图5)。

6、(4)活性组分降解aoh的时间曲线：太平洋芽孢杆菌ansb901活性组分对aoh的降解率在24h内随时间的增加而增加，0-4h降解启动时间较慢，12h对aoh的降解率在67％，24h对aoh的降解率为98.4％(图6)。

7、(5)活性组分降解aoh的最适温度范围：太平洋芽孢杆菌ansb901活性组分在20-50℃对aoh的降解率均在70％左右(图7)。

8、(6)活性组分降解aoh的最适ph范围：太平洋芽孢杆菌ansb901活性组分在ph为9.0和10.0条件下对aoh降解率接近100％，在ph为7.0和8.0条件下对aoh降解率为70％左右，在ph为6.0的酸性条件下aoh降解率降低，但仍保持58％的降解率(图8)。

9、本发明还提供一种用于交链孢酚脱毒的太平洋芽孢杆菌ansb901的生物制剂及其制备方法。其特征是将太平洋芽孢杆菌ansb901活化培养后离心获得太平洋芽孢杆菌菌体，洗涤后收集菌体得到太平洋芽孢杆菌菌生物制剂；或者，将收集得到的菌体再用保护剂重悬达到浓度108cfu/ml，将悬浮液培养一段时间后进行冷冻干燥得到太平洋芽孢杆菌菌粉生物制剂。

10、所述的保护剂可以为脱脂奶粉、蔗糖、玉米蛋白粉、大豆浓缩蛋白粉、麸皮、淀粉中的一种或几种。

11、所述太平洋芽孢杆菌ansb901具有以下用途：

12、(1)制成用于交链孢酚脱毒的生物制剂；

13、(2)用来清除苹果、山楂、西红柿、葡萄、橘柑、石榴、桃子、橙子、面粉、玉米、高粱、稻米及其加工制品和坚果及其加工产品、饲料和饲料原料中的交链孢酚。

14、本发明的太平洋芽孢杆菌ansb901在较宽的温度(20-50℃)及ph(6.0-10.0)范围均可以降解aoh，在最适培养条件下培养(ph＝7.0，37℃，发酵时间24h)发酵液可降解90％的aoh(10μg/ml)。所述的太平洋芽孢杆菌ansb901用于去除食品或饲料中的交链孢酚，具有非常广泛的应用前景。

15、本发明进一步提供了一种太平洋芽孢杆菌ansb901生物制剂在降解果汁中交链孢酚中的应用，具体为利用太平洋芽孢杆菌生物制剂与苹果汁混合，孵育24h后测定苹果汁中的交链孢酚含量，试验结果表明太平洋芽孢杆菌生物制剂可降解苹果汁(10μg/mlaoh)中40.24％的交链孢酚。

16、本发明还提供一种太平洋芽孢杆菌ansb901生物制剂在降解霉变玉米中交链孢酚中的应用，具体为在玉米中接种产交链孢酚的链格孢菌(atcc66918)孢子，然后再加入太平洋芽孢杆菌ansb901发酵液或其生物制剂共孵育24h，测定结果表明，发酵液对霉变玉米中50μg/kg和25μg/kg的aoh的降解率分别为54.90％和76.03％。

17、通过实施本发明具体的
技术实现要素：
，可以达到以下有益效果:

18、本发明提供的太平洋芽孢杆菌bacillus pacifiicus ansb901，是一种芽孢杆菌，具有降解食品和饲料中交链孢酚的良好技术效果，通过将该菌种制成的生物制剂与苹果汁发酵反应，并通过将菌种发酵液与霉变玉米进行发酵反应，验证其在实际应用中具有良好的降解交链孢酚的效果，获得降解食品和饲料中交链孢酚显著的技术效果。

19、生物保藏说明

20、ansb901，分类命名：太平洋芽孢杆菌，bacillus pacifiicus，于2022年06月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.25071。

技术特征：

1.一种太平洋芽孢杆菌(bacillus pacifiicus)ansb901，，其保藏编号为cgmccno.25071。

2.一种应用权利要求1所述太平洋芽孢杆菌ansb901制备交链孢酚生物降解剂的方法，其特征在于，将所述太平洋芽孢杆菌ansb901菌活化培养后离心获得菌体，洗涤后收集菌体得到太平洋芽孢杆菌活菌制剂。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，进一步将收集得到的菌体用保护剂溶液重悬达到细胞浓度108cfu/ml，将悬浮液培养一段时间后进行冷冻干燥得到太平洋芽孢杆菌菌粉生物制剂。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的保护剂为脱脂奶粉、蔗糖、玉米蛋白粉、大豆浓缩蛋白粉、麸皮、淀粉中的一种或几种。

5.一种含有权利要求1所述的太平洋芽孢杆菌ansb901的生物制剂。

6.权利要求1所述的太平洋芽孢杆菌ansb901菌株或权利要求5所述的太平洋芽孢杆菌ansb901的生物制剂在交链孢酚生物降解方面的应用。

7.权利要求1所述的太平洋芽孢杆菌ansb901菌株或权利要求5所述的太平洋芽孢杆菌ansb901的生物制剂在去除食品和/或饲料中交链孢酚的应用方法。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述食品包括但不限于苹果、山楂、西红柿、葡萄、橘柑、石榴、桃子、橙子、面粉、玉米、高粱、稻米及其加工制品和坚果及其加工产品。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述饲料包括但不限于苹果渣发酵饲料、青贮饲料、玉米及其加工副产物各种动物用饲料原料及配合饲料。

10.权利要求1所述的太平洋芽孢杆菌ansb901菌株或权利要求5所述的太平洋芽孢杆菌ansb901的生物制剂在制备食品和/或饲料添加剂中的应用。

技术总结
本发明提供一种太平洋芽孢杆菌(Bacillus pacifiicus)ANSB901及其所制备的生物制剂，同时提供该太平洋芽孢杆菌及其生物制剂在交链孢酚毒素生物降解方面的应用。为食品和饲料中交链孢酚的生物脱毒提供菌种资源，该菌株的应用可降低交链孢酚对人和动物的危害，提高食品安全。

技术研发人员：赵丽红,张建云,张新悦,郭永鹏,刘立萌
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15