一种双核壳负载微生物材料及其制备方法和应用

1.本发明涉及重金属污染水体修复技术领域，具体涉及一种双核壳负载微生物材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.重金属具有稳定性和不易消除的特点，常通过食物链进入人体，对人的脑，肾，骨骼，肺，肝脏和生殖系统等造成损害。传统的镉污染治理方法主要有物理、化学和生物的方法。其中物理化学的治理方法具有处理效率高，工艺简单特点。但是往往设备费用、运行费用昂贵，且容易带来二次污染。因此，更加环保和廉价的生物治理方法受到越来越多人的关注。
3.生物吸附法具有许多优点，其原材料来源丰富、品种多、成本低；而且吸附速度快、吸附量大、选择性好，在处理低浓度废水时尤其有效。中国发明专利(cn109364887a)公开了一种多孔海藻酸钙吸附剂，其纤维分子链上含有大量羟基、羧基，对镉离子具有较好的吸附能力，可用于重金属污水的处理。但海藻酸盐凝胶球会受ph上升影响导致溶解，导致无法长效的发挥重金属处理效果。
4.生物矿化是去除重金属研究热点，最常见和有效的生物诱导矿化过程是由尿素酶水解尿素引起的。尿素经脲酶分解形成铵盐而呈碱性，有利于钙和碳酸盐的结合和存在。生物诱导碳酸盐沉淀修复重金属的原理包括：一是产脲酶菌在代谢过程中产生的脲酶；其次，脲酶水解尿素产生铵离子和碳酸根离子；最后，产生的碳酸根离子与重金属离子反应形成碳酸根沉淀物，能够快速矿化重金属，降低其危害。另外，海藻酸钙和琼脂是优良的载体，用于包覆脲酶菌时，既能吸附镉离子又能起到保护产脲酶微生物免于镉毒害。
5.cn113373139a一种含重金属离子废水处理用固定化微生物材料及制备方法，固定化微生物材料包括包埋骨架以及包埋在所述包埋骨架内部的产脲酶微生物、尿素和缓冲剂，包埋骨架由海藻酸钠和钙盐交联而成，此专利解决了现有技术中的重金属离子废水中尿素易水解、micp过程无尿素难以顺利进行的难题。但这种将尿素和脲酶菌同时包裹在包埋骨架中，会使尿素提前分解成铵根离子和碳酸钙离子，导致不利于提高废水中的ph，进而不能有效去除重金属。


技术实现要素：

6.为了进一步解决水体中重金属污染的问题，本技术提供了一种双核壳负载微生物材料及其制备方法和应用，用以矿化污染水体重金属；首先将微生物包埋于琼脂，获得琼脂负载微生物内壳；然后将上述琼脂负载微生物内壳外面覆盖氯化钙层，最后包埋在混合尿素的海藻酸钠溶液中，即获得双核壳负载微生物材料，即可以耐受更高浓度重金属并提高重金属去除率。
7.一种双核壳负载微生物材料的制备方法，包括以下步骤：
8.首先，将微生物菌液包埋于琼脂溶液中，获得琼脂负载微生物内壳；
9.然后，将琼脂负载微生物内壳置于氯化钙溶液中，使琼脂负载微生物内壳表面覆盖氯化钙层；
10.最后，将覆盖有氯化钙层的琼脂负载微生物内壳包埋在混合尿素的海藻酸钠溶液中，即获得双核壳负载微生物材料；
11.述微生物是脲酶菌，上述微生物菌液和琼脂溶液的体积用量比为1:(5-10)。
12.上述脲酶菌为巴氏芽孢杆菌
13.上述琼脂溶液的浓度为20-50g/l；上述氯化钙浓度为100-1000mm。
14.上述巴氏芽孢杆菌菌液是通过如下方法获得的：将巴氏芽孢杆菌接种于培养基中，28℃
±
0.5℃条件下振荡培养2天，通过离心浓缩或加入生理盐水调节菌液浓度至od
600
＝1。
15.上述培养基包括20g酵母粉、15gnh4cl，59mg nicl2，加水补足至1l；上述培养基ph为9.2-9.3。
16.上述琼脂负载微生物内壳通过以下方法制备得到：配制浓度为20-50g/l的琼脂溶液，在锥形瓶中摇匀，置于微波炉中，大火加热2分钟至琼脂溶解；待溶解的琼脂溶液温度降至50℃
±
0.5℃(由于40℃是琼脂凝固点，50℃时琼脂具有流动性便于混匀细菌)，将微生物菌液(od600＝1-10)加入琼脂中摇匀，在4℃冰箱静置冷却至凝固；使用6x6mm网割刀将琼脂分割成大小均匀琼脂块可得到琼脂负载微生物内壳。
17.上述混合尿素的海藻酸钠溶液中海藻酸钠水溶液浓度为5-20g/l，尿素浓度为100mm。
18.双核壳负载微生物材料的制备具体包括以下步骤：
19.将琼脂负载微生物内壳置于100-1000mm氯化钙溶液，待表面充分覆盖一层氯化钙；另外配制海藻酸钠和尿素混合液，混合尿素的海藻酸钠溶液中海藻酸钠水溶液浓度为5-20g/l，尿素浓度为100mm；最后将海藻酸钠和尿素混合液用蠕动泵滴到覆盖氯化钙层的琼脂负载微生物内壳上，待表面均匀覆盖混有尿素的海藻酸钙凝胶层，即得到双核壳负载微生物材料。将双核壳负载微生物材料放进含镉重金属污染水体溶液，用来固定废水中的镉。
20.通过上述的制备方法得到的双核壳负载微生物材料。
21.双核壳负载微生物材料的应用，该双核壳负载微生物材料用于含重金属离子废水处理，可以耐受更高浓度重金属并提高重金属去除率。
22.本发明相比现有技术具有以下优点：
23.(1)本发明操作简单，成本低廉。采用双核壳负载微生物材料修复重金属污染，可以有效解决了产脲酶微生物不能耐受高浓度重金属的难题；
24.(2)可以同时将尿素与微生物分开包埋，解决外加尿素源和提前反应的问题。另外，尿素的缓释可有效提高尿素利用效率，具有广泛的工业化前景和市场价值。
附图说明
25.图1是双核壳负载微生物材料示意图；
26.图2是微生物耐受重金属镉对比示意图；
27.图3是镉去除率图；
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.以下实施例中使用的菌株、试剂均为常规试剂，由市售途径获得。
30.实施例中使用的巴氏芽孢杆菌为市售巴氏芽孢杆菌atcc11859，该菌株为本领域常规菌株，如专利cn109295108a实施例所使用的菌株。
31.实施例中培养基配方如下：每升培养基包含：20g酵母粉，15g nh4cl，59mg nicl2，加水补足至1l；ph 9.2-9.3。
32.取巴氏芽孢杆菌母液接种至灭菌后的培养基，在28℃条件下振荡培养两天。培养完成后使用分光光度计测量菌液吸光值，通过离心浓缩及生理盐水调节菌液浓度至od600＝10以备用；利用纯水与氯化镉配置镉浓度为2mm含镉废水，备用。
33.以下各实施例中使用的双核壳负载微生物材料的制备：
34.配制浓度为25g/l的琼脂溶液，待高温溶解冷却至50℃后，将巴氏芽孢杆菌菌液按体积比1：9加入琼脂中摇匀，在4℃冰箱静置冷却至凝固；使用6x6mm网割刀将琼脂分割成大小均匀琼脂块可得到琼脂负载微生物内壳。
35.将琼脂负载微生物内壳置于100mm氯化钙溶液，待表面充分覆盖一层氯化钙后滤出；另外在配制的5g/l的海藻酸钠水溶液中加入100mm尿素，获得海藻酸钠和尿素混合液；最后将海藻酸钠和尿素混合液用蠕动泵滴到覆盖一层氯化钙的琼脂负载微生物内壳上，待表面均匀覆盖一层混有尿素的海藻酸钙凝胶可得到双核壳负载微生物材料。
36.实施例1：制备10ml的反应体系；10ml的反应体系中，双核壳负载微生物材料的菌液和含镉废水的终浓度分别为od
600
＝1和1mm。将反应体系置于28℃摇床条件下修复1天。
37.实施例2：制备10ml的反应体系；10ml的反应体系中，双核壳负载微生物材料的菌液和含镉废水的终浓度分别为od
600
＝1和2mm。将反应体系置于28℃摇床条件下修复1天。
38.实施例3：制备10ml的反应体系；10ml的反应体系中，双核壳负载微生物材料的菌液和含镉废水的终浓度分别为od
600
＝1和5mm。将反应体系置于28℃摇床条件下修复1天。
39.对比例1：制备10ml的反应体系；10ml的反应体系中，巴氏芽孢杆菌菌液和含镉废水的终浓度分别为od
600
＝1和1mm。将反应体系置于28℃摇床条件下修复1天。
40.对比例2：制备10ml的反应体系；10ml的反应体系中，巴氏芽孢杆菌菌液和含镉废水的终浓度分别为od
600
＝1和2mm。将反应体系置于28℃摇床条件下修复1天。
41.对比例3：制备10ml的反应体系；10ml的反应体系中，巴氏芽孢杆菌菌液和含镉废水的终浓度分别为od
600
＝1和5mm。将反应体系置于28℃摇床条件下修复1天。
42.对比例4：制备10ml的反应体系；10ml的反应体系中，单核壳负载微生物材料的菌液和含镉废水的终浓度分别为od
600
＝1和1mm。将反应体系置于28℃摇床条件下修复1天。其中单核壳负载微生物材料的菌液的制备：巴氏芽孢杆菌和海藻酸钠溶液(5g/l)混合，后滴入到100mm的氯化钙溶液中。
43.测试例1：微生物活性测试
44.通过纳氏试剂分光光度法测定重金属镉污染水中增加的铵根浓度，得出微生物对
尿素的分解能力，从而判断微生物所具备的活性。
45.实施例1和对比例1、对比例4各设置三组平行样品，检测结果取平均值。
46.修复1天后，检测结果如图2所示，实施例1和对比例1的测试结果表明对于重金属镉污染水的微生物矿化去除，在双核壳负载微生物材料的条件下尿素的分解提高了近33倍，即脲酶菌的活性提高了近33倍。实施例1和对比例4的测试结果表明，本发明的双核壳结构相比于现有技术中的单一核壳结构具有较好的微生物活性。
47.测试例2：去除重金属离子能力测试
48.通过icp-oes仪器测试重金属镉污染水中的残余镉浓度，然后对比污染水处理前后的镉浓度，判断去除重金属镉离子能力。
49.实施例和对比例各设置三组平行样品，检测结果取平均值。
50.修复1天后，检测结果如图3所示，对于重金属镉污染水的微生物矿化去除，在双核壳负载微生物材料的条件下，处理2mm镉时去除率提高了三分之一，由60％提高到80％；处理5mm镉时去除率提高了两倍多，由19％提高到63％。
51.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。