一种DNA纳米花及其制备方法和用途

一种dna纳米花及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明涉及骨质疏松症技术领域，尤其是一种dna纳米花及其制备方法和用途。


背景技术：

2.骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病，其病理特征为骨含量降低，骨脆性和骨折易感性增加。目前，在骨质疏松病因机制研究中，破骨细胞的异常活化引起的不可逆骨矿物质溶解和有机成分的降解是导致骨质疏松疾病发生的关键因素。然而，目前临床上的治疗方法主要集中于破骨细胞的生物学干预，而忽视了对已受损骨骼的修复。
3.1998年建立的滚环扩增技术(rolling circle amplification，rca)技术可用于扩增大的环状dna模板，例如质粒和噬菌体。使用该技术可以制备出呈现花状的无机-dna杂化的纳米结构。但是现有的技术大多采用mg离子作为dna聚合酶的辅助因子制备出mg基dna纳米花。传统实验方案如下：
4.(1)准备模板/引物(锁式探针)二聚体
5.将模板与引物(锁式探针)按1∶2浓度比(10μm∶20μm)混合，1
×
pbs补足体系。混合体积分装为50μ/管，置于pcr仪器中进行退火处理，以形成稳定的模板/引物(锁式探针)二聚体。退火步骤为：95℃，3min；1℃/min降温至12℃保存。
6.(2)模板连接成环
7.按下述成分浓度准备交联体系(终浓度)：2μm模板/引物混合物(按模板浓度进行计算)，30u/μl t4 dna连接酶，1
×
t4 dna连接酶缓冲液。
8.分装为50μl/管进行交联，以形成完整的环状结构。交联步骤为：16℃过夜(12小时以上)，75℃加热10min灭活。
9.最终产物经10kd超滤离心管离心纯化，以去除体系中的缓冲液成分，避免干扰后续反应过程。
10.(3)成环效果验证
11.成环效果可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证，具体如下(终浓度)：
12.50μl体系中，添加25μl上述成环产物，1μl exo i，0.5μl exo iii以及，1
×
exo i/exo iii缓冲液，水补足体系。体系在37℃反应1h，以充分降解未成功成环的模板与单链状引物(锁式探针)。
13.降解产物用15％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证，降解后产物中仍存在明显单一条带视为成功。
14.通过未成环模板单链与降解后产物的灰度对比，可简单验证成环效率。
15.(4)滚环扩增
16.基于步骤2产物进行滚环扩增，体系如下(终浓度)：500nm环化的模板/引物(锁式探针)，1mm dntp，0.5u/μl phi29 dna聚合酶，1
×
phi29 dna聚合酶缓冲，水补足体系。
17.混合体系于30℃反应一定时间，具体反应时长视需求与序列扩增效果而定。
18.反应后可选择75℃，10min将酶灭活。结合扩增时间长的设计有利于形成纳米花。
或者选择将产物通过50kd超滤离心管纯化，以去除未反应的dntp以及缓冲等成分，这有利于形成线性/团状等结构的以dna为主体的结构。
19.(5)扩增效果验证
20.滚环扩增效果需要通过2％琼脂糖凝胶电泳进行验证。
21.现有的技术大多采用mg离子作为dna聚合酶的辅助因子制备dna纳米花。作为dna纳米花的主要无机成分，mg离子的体内安全性较差，且无特殊功能，这些特点严重限制了以mg离子为基础制备的dna纳米花在临床上的使用。因此，需要设计一种dna纳米花及其制备方法和用途。


技术实现要素：

22.为了克服现有技术中的缺陷，提供一种dna纳米花及其制备方法和用途。
23.本发明通过下述方案实现：
24.一种dna纳米花，所述dna纳米花含有ca离子和多价cpg。
25.一种dna纳米花的制备方法，该方法包括以下步骤：
26.第一步、将100μm磷酸化模板和200μm初级引物以1∶2的比例在pbs或水溶液中混合得到混合物；
27.第二步、将第一步所得的混合物依次经过多次循环加热，然后使用pcr热反应器逐渐冷却至20℃；
28.第三步、用第二步所得冷却至20℃的产物制备环状dna，退火后，加入t4 dna连接酶和t4 dna连接酶缓冲液，并孵育反应溶液在16℃中过夜；将反应溶液加热至65℃维持10分钟，形成闭合的dna环；
29.第四步、然后将第三步所得闭合的dna环与phi29 dna聚合酶、dntps混合在反应缓冲溶液中，在37℃反应2h；
30.第五步、将第四步所得产物和ca
2+
混合，然后在室温孵育24小时，终止反应得到含有ca
2+
和多价cpg的dna纳米花。
31.在第一步中，所述磷酸化模板的序列号为：gactggtatattttttaacgtcaggaacgtcatggatttttaacgctatagt；
32.所述初级引物的序列号为：atataccagtcactatagcgtt。
33.在第二步中，所述循环加热的具体步骤为：在95℃下加热2分钟、在65℃下加热2分钟、以1℃/min的速率逐渐冷却至60℃，随后再在95℃下加热2分钟、再在65℃下加热2分钟、再在1℃/min的速率逐渐冷却至60℃，所述循环加热的循环次数为80次。
34.在第三步中，所述t4 dna连接酶的浓度为2u/μl。
35.所述dna纳米花用于治疗骨质疏松疾病。
36.本发明的有益效果为：
37.本发明着眼于协同促进骨形成和抗骨吸收的治疗策略，通过优化的滚环扩增技术构建了富含ca2+和多价cpg的新型dna纳米花(dnfs)用于治疗骨质疏松。相较于现有的骨质疏松治疗药物，dnfs利用破骨细胞与骨表面的酸性微环境酸响应释放ca2+，通过增强骨质胶原矿化修复受损的骨组织，增强骨骼硬度。另一方面，dnfs可利用多价cpg通过细胞免疫调节抑制破骨细胞活力，减少破骨细胞对骨骼的吸收作用。本发明制备的dnfs可有效协同
免疫调节和增强骨修复联合治疗骨质疏松，有望拓展dna纳米材料应用的广泛性，也为纳米技术治疗骨质疏松提供新的理论依据和技术保障。
附图说明
38.图1.新型dna纳米花制备和表征的预结果。新型dna纳米花透射电镜(a)和扫描电镜(b)结果。(c)新型dna纳米花高分辨透射电镜mapping结果。(d)新型dna纳米花dls水化粒径结果。
39.图2.新型dna纳米花增强骨质胶原矿化预结果。(a)新型dna纳米花在不同酸性环境中透射电镜结果。(b)micro-ct结果显示不同扩增时间，新型dna纳米花中cpg互补序列荧光强度变化。(c)新型dna纳米花和游离cpg在血清(上图)和dna酶(下图)环境中处理后琼脂糖凝胶电泳结果。
40.图3.新型dna纳米花抑制破骨细胞生成预结果。(a-b)共聚焦评估不同药物处理后破骨细胞细胞轮廓和形态的变化。(c-d)trap染色评估不同药物处理后破骨细胞数量和分布的变化情况。(e)wb分析不同药物处理后破骨细胞功能效应蛋白(nfat2，c-fos，ctsk)的表达情况。
41.图4.dna纳米花生物安全性评价。(a)巨噬细胞摄取dna纳米花呈现计量依赖性。(b)cck-8结果显示高剂量的dna纳米花对巨噬细胞没有明显的细胞损伤。(c)细胞死活染色结果显示高剂量的dna纳米花对巨噬细胞没有明显的损伤。
42.图5.dna纳米花可逆转ovx诱导的小鼠体内骨丢失。(a)ovx小鼠模型建立示意图及评估dnfs保护作用的实验设计。(b，c)micro-ct评价显示，dnfs能很好地预防胫骨骨量。(d，e)h&e和trap染色图像显示，在dnfs处理的ovx小鼠中，更多的骨微结构得以维持，骨表面形成的破骨细胞较少。(f)dna纳米花处理的ovx小鼠胫骨骨中轴三点弯曲试验的极限力、刚度、弹性模量和极限应力数据统计结果。
具体实施方式
43.下面结合附图对本发明优选的实施例进一步说明：
44.一种dna纳米花，所述dna纳米花含有ca离子和多价cpg。
45.一种dna纳米花的制备方法，该方法包括以下步骤：
46.第一步、将100μm磷酸化模板和200μm初级引物以1∶2的比例在pbs或水溶液中混合得到混合物；
47.第二步、将第一步所得的混合物依次经过多次循环加热，然后使用pcr热反应器逐渐冷却至20℃；
48.第三步、用第二步所得冷却至20℃的产物制备环状dna，退火后，加入t4 dna连接酶和t4 dna连接酶缓冲液，并孵育反应溶液在16℃中过夜；将反应溶液加热至65℃维持10分钟，形成闭合的dna环；
49.第四步、然后将第三步所得闭合的dna环与phi29 dna聚合酶、dntps混合在反应缓冲溶液中，在37℃反应2h；
50.第五步、将第四步所得产物和ca
2+
混合，然后在室温孵育24小时，终止反应得到含有ca
2+
和多价cpg的dna纳米花。
51.在第一步中，所述磷酸化模板的序列号为：gactggtatattttttaacgtcaggaacgtcatggatttttaacgctatagt；
52.所述初级引物的序列号为：atataccagtcactatagcgtt。
53.在第二步中，所述循环加热的具体步骤为：在95℃下加热2分钟、在65℃下加热2分钟、以1℃/min的速率逐渐冷却至60℃，随后再在95℃下加热2分钟、再在65℃下加热2分钟、再在1℃/min的速率逐渐冷却至60℃，所述循环加热的循环次数为80次。
54.在第三步中，所述t4 dna连接酶的浓度为2u/μl。
55.所述dna纳米花用于治疗骨质疏松疾病。
56.本发明不同于现有的dna纳米花制备方法，使用ca离子作为dna聚合酶的辅助因子制备dna纳米花。ca离子是人肌体内重要的组成元素，且能够有效补充骨质疏松发生过程中ca离子缺失的现象，具有较高的临床转化前景。
57.本发明首次使用ca离子作为phi29 dna聚合酶和辅助因子制备了富含ca离子的新型dna纳米花用于骨质疏松的治疗。本发明首次使用可编码cpg的dna链为模板制备装载有多价cpg的新型dna纳米花。本发明首次使用富含ca离子和多价cpg的dna纳米花通过抗骨吸收和促进骨形成治疗骨质疏松。
58.本技术的dna纳米花材料的表征和优化制备条件
59.通过各种电镜技术和谱学方法对得到的新型dna纳米化进行全面的表征，如扫描电镜、(高分辨)透射电镜、原子力显微镜、电感耦合等离子体共振。使用zetasizer nano zs仪器通过动态光散射(dls)检查新型dna纳米花的流体动力学直径。通过优化制备条件(如反应时间、反应温度、各成分投料比)来制备较理想的物理性质和化学性质的新型dna纳米花材料。
60.按照上述的研究方案从透射电镜(图1a)以及扫描电镜(图1b)结果可以看出，在预实验中我们已经成功制备了球型且呈花状的纳米颗粒，纳米颗粒结构圆整分布均一。更重要的是，透射电镜mapping元素分析结果(图1c)显示，dna纳米花中成功装载ca
2+
，初步证明新型dna纳米花可有效递送ca
2+
，有望增强骨质胶原矿化的能力。同时dls数据显示(图1d)，我们制备的新型dna纳米花和水化粒径在350nm左右，和透射电镜结果一致。
61.本技术的dna纳米花材料的增强胶原矿化机制的评价
62.将dna纳米花添加到400μl ph值分别为7.4和5.0的pbs缓冲液中。37℃保温不同时间后，释放的钙离子用超滤管收集，通过钙比色测定试剂盒或者电感耦合等离子发射光谱仪测量释放的ca
2+
的浓度。
63.双侧摘取8周龄雌性sprague-dawley(体重290-330克)卵巢诱导建立骨质疏松模型。处死大鼠后，将骨质疏松的胫骨切成薄片并在使用前在37℃的烘箱中干燥7天。将新型dna纳米花注入骨质疏松的骨骼中，然后将骨骼置于37℃的水浴中14d。之后，在进一步实验之前，将骨头在室温下干燥。实用高分辨率micro-ct扫描仪测量骨骼微结构变化并进行定量和分析。进一步采用扫描电镜观察骨质疏松微结构的变化，并检测骨质疏松骨中钙、磷的含量。
64.由于破骨细胞过度活化分泌大量的酸，骨质疏松微环境处于酸性环境中，而这种酸性环境有望促进dna纳米花释放装载的ca2，从而更好的增强胶原矿化。透射电镜结果显示(图2a)，通过将新型dna纳米花孵育在酸性环境中，花状的结构被破坏，初步证明酸性环
境可促进ca
2+
的释放。通过模拟体内胶原矿化的环境，micro-ct结果显示(图2b-c)，新型dna纳米花可增强骨质胶原矿化，而提前用酸性环境处理的dna纳米花可增强胶原矿化过程。同时，使用扫描电镜也可观察到更精细的矿化结果(图2d)。
65.本技术的dna纳米花抑制破骨细胞机制的评价
66.新型dna纳米花抑制破骨细胞的研究：从6-8周大的c57小鼠中分离出骨髓来源的巨噬细胞。简而言之，冲洗出股骨和胫骨中的骨髓细胞。为了获得纯骨髓来源巨噬细胞(bmms)，收集非贴壁细胞并在α-mem培养基中加入25ng/m lm-csf中进行培养。然后，将贴壁细胞用pbs洗涤3次并接种到12孔板上。与m-csf(30ng/ml)和rankl(100ng/ml)孵育3天后，加入一定浓度的新型dna纳米化共同抚育。处理5天后，实用actin细胞骨架染色以及trap染色等技术考察dnfs抑制破骨细胞生成的能力。为了探究抑制细胞融合的作用，提前使用蓝色荧光核染料hoechst或红色荧光细胞膜染料cm-dil分别标记细胞，并在室温下孵育10分钟。将两组细胞一起放在培养板上，加入dna纳米花共孵育24小时后去除培养基，进行荧光显微镜检查细胞融合情况。
67.骨吸收测定：骨髓来源巨噬细胞bmms以2
×
105个细胞/孔的密度铺在冻干牛骨切片的表面，以模拟体内骨吸收过程。加入rankl(50ng/ml)用于刺激细胞破骨细胞生成持续5天，并且在溶液中添加dna纳米花。实验结束后，用4％多聚甲醛(pfa)固定骨片30min，用刷子刮去表面细胞。然后将骨切片用au-pd溅射并通过sem观察破骨细胞侵蚀骨表面的情况。
68.破骨细胞是由骨髓来源巨噬细胞融合而成，随之伴随的特点是细胞体积大，触角多，所以可以通过观察细胞形态的变化考察药物对破骨细胞生成的影响。actin染色结果显示(图3a-b)，rankl诱导后细胞体积变大，触角变多，证明骨髓来源巨噬细胞成功诱导分化成破骨细胞。而加入cpg后破骨细胞的形成被抑制，证明游离cpg能够抑制骨髓来源巨噬细胞分化成破骨细胞。而加入含有等量cpg的dna纳米花这种抑制效果更强。一个原因是上述结果显示的dna纳米花可以给予cpg更好的稳定性，另外的原因可能是dna纳米花增加了细胞摄取cpg。而使用破骨细胞特征性识别方法trap染色后，也能观察到dna纳米花相较于游离的cpg可以更好的抑制骨髓来源巨噬细胞分化成破骨细胞(图3c-d)。而wb结果进一步显示(图3e)，dna纳米花可以抑制破骨细胞相关蛋白表达，证明了dna纳米花对破骨细胞的抑制作用。
69.体外生物学性质研究：对上述制备的新型dna纳米花材料进行多方位的生物学效应评价。首先使用经典的mtt、cck-8法和calcein-am/pi法研究纳米花材料对不同种类细胞(上皮细胞、巨噬细胞、破骨细胞)的毒性，在此基础上评价经过dna纳米花处理后，各种细胞细胞膜的完整性以及dna损伤等。从6-8周大的c57小鼠中分离出骨髓来源的巨噬细胞。取上述方法得到的骨髓来源巨噬细胞，接种到96孔板(1
×
104个细胞/孔)中，加入不同量的dna纳米花孵育24h以测定细胞毒性。
70.结果显示(图4a)，随着纳米花加入量的增加，细胞中的纳米粒的荧光强度逐渐增加，增明纳米花在细胞内的摄取呈现计量依赖的特点。cck-8(图4b)和细胞死活染色(图4c)结果显示，纳米花加入的量即使到100μm也不会对细胞造成明显的损伤，证明其具有良好的生物相容性。
71.本技术的dna纳米花体内抗骨质疏松和安全性的评价
72.体内考察dna纳米花缓解骨质疏松的能力：首先，通过双侧摘除雌性小鼠卵巢构建
骨质疏松模型，通过骨腔内给药的给药方式，考察dnfs缓解骨质疏通的能力；利用荧光标记的方法，使用活体成像系统考察骨腔内给药方式的可靠性，并考察dnfs在体内的代谢情况；取出小鼠腿骨，使用trap染色，alp染色，micro-ct，elisa骨形成指标，力学实验等方法系统的考察dnfs缓解骨质疏松的能力。
[0073][0074]
术后2个月，采用micro-ct评估骨内支架对胫骨的保护作用。如图5a所示，在小鼠中，ovx程序诱导的骨组织骨丢失被抑制，骨小梁的骨减少表型在mdfs治疗后得到缓解。骨特征定量测量显示骨量单位组织体积和骨小梁数在ovx+mdfs组较ovx组明显升高，接近正常水平，与sham组相似(图5c)。组织学检查(h&e染色)一致显示，与ovx组相比，mdfs治疗组的骨体积和骨表面保持良好(图5d)。trap染色观察mdfs抑制破骨细胞形成的保护作用。如图5e所示，ovx处理导致破骨细胞(trap阳性细胞)的数量增加，而mdfs处理显著抑制了骨质疏松症患者体内破骨细胞的形成，并恢复到接近正常水平。进一步定量分析显示，mdfs组骨小梁上trap+破骨细胞和多核trap+破骨细胞均少于ovx组(图5f)。对矿物质沉积率(mar)和骨形成率/骨表面(bfr/bs)的定量分析进一步表明，mdfs可促进骨形成(图5h)。最后，利用三点弯曲试验评估mdfs治疗后的骨强度变化(图s16)。如图5所示，从胫骨对待ovx小鼠显示增强的材料强度与ovx组：包括更高的最大载荷，极限荷载失败，能量最大负载，和能源的极限载荷mdfs-treated ovx组高于ovx组。
[0075]
本发明首次着眼于协同抗骨吸收和促进骨形成两种策略治疗骨质疏松，使用富含钙离子和多价cpg的新型dna纳米花通过促进骨胶原矿化和抑制破骨细胞生成达到协同治疗骨质疏松的效果。相较于单独抗骨吸收或者促进骨形成的治疗策略，本技术可以更有效地实现对骨质疏松的治疗和修复。不同于其它纳米递送系统，本技术制备的dna纳米花制备方法简单、高效，具有一定的创新型和普适性，为其他功能载体的构建提供一定的参考价值，同时为骨质疏松治疗药物递送系统的开发提供了新的思路。本技术中使用的dna纳米花中的每一种重要成分(ca
2+
和dna)均发挥重要功能，且具有良好生物相容性、生物可降解性和酸响应性，因此具有一定的临床转化潜力。
[0076]
尽管已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域技术人员来说，对上述实施例做出修改或者采用等同的替代方案，这对本领域的技术人员而言是显而易见，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。