一种贝类胞内共生菌基因组DNA的提取方法

一种贝类胞内共生菌基因组dna的提取方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种贝类胞内共生菌基因组dna的提取方法。


背景技术：

2.贝类种类繁多，分布广泛，现存11万种以上，是动物界中仅次于节肢动物的第二大门类。共生菌，即与生物体共同生存的细菌。近年来，关于贝类环境适应性的研究日益引发关注。陆续有研究发现贝类组织细胞内的共生菌在其适应特殊的生境(如深海等)上发挥重要作用，一些独特且必要的生理过程往往是通过宿主与胞内共生菌的相互作用来实现的。
3.目前，贝类胞内共生菌基因组序列的获取方式主要为：体外培养胞内共生菌至一定丰度后对其进行基因组测序。然而，由于人工配置的培养基难以满足共生菌在贝类组织细胞内的营养条件，且培养方式难以完全模拟共生菌在胞内的生存环境，因此贝类胞内共生菌的培养实验难度极大，过程繁琐且耗时费力，往往难以获取其基因组信息。目前自然界只有0.1％-1.0％的细菌得以通过体外培养的方式成功分离。因此，目前急需一种贝类胞内共生菌基因组dna的提取方法，为胞内共生菌基因组信息的获取，以及为研究宿主与胞内共生菌之间的相互作用关系提供便利。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种贝类胞内共生菌基因组dna的提取方法。
5.为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
6.一种贝类胞内共生菌基因组dna的提取方法，取待提取样品采用抗生素对其进行环境菌清除，清除后进行宿主细胞膜裂解，裂解后使用显微操作系统分离胞内共生菌，而后对分离获得胞内共生菌基因组dna进行提取。
7.上述显微操作系统由倒置光学显微镜和油压式注射装置搭配而成，现有油压式注射装置置于显微镜旁侧，该装置包括油压泵(提供动力)、显微注射针和管路等元件，显微注射针和管路被固定于显微镜载物台和物镜附近，在使用该系统时，将显微注射针置于显微镜下观察到的胞内共生菌附近，轻轻拨动活塞将其吸入管路后，排放至预先存储有pbs的微量离心管中，以达到分离胞内共生菌的目的。
8.进一步的说，
9.(1)使用硫酸庆大霉素溶液浸泡待提取样品经无菌解剖的贝类组织1-2h；浸泡后洗涤待用；
10.(2)向步骤(1)的样品中加入1％tritonx-100细胞裂解液，使用电动组织研磨器匀浆组织样品；
11.(3)将步骤(2)的样品置于搭配有倒置光学显微镜和油压式注射装置的显微操作系统下观察，基于的胞内共生菌的形态和大小特征，使用搭配的油压式注射装置抽取约10个细菌；
12.(4)而后对分离获得胞内共生菌基因组dna进行提取。
13.3.按权利要求2所述的贝类胞内共生菌基因组dna的提取方法，其特征在于：
14.将100mg待提取贝类组织样品，加入至600ul的硫酸庆大霉素溶液中浸泡1-2h，以除去胞外细菌；而后采用pbs对其洗涤；洗涤后加入400ul的1％tritonx-100细胞裂解液对样品中宿主细胞膜进行充分裂解，使胞内共生菌释放。
15.所述将步骤(3)中分离获得的胞内共生菌加入至pbs中，充分混匀，而后反复冷冻-加热，处理后向溶液中加入变性缓冲液，充分混匀；混匀后水浴加热处理，并加入反应终止液，充分混匀后置于冰上；而后经pcr体系进行提取获得胞内共生菌基因组dna。
16.所述将步骤(3)中分离获得的胞内共生菌加入至pbs中，充分混匀，混匀后密封于管内，而后对其进行反复冷冻-加热处理3-5个循环；每个循环中冷冻和加热各处理5min，其中，冷冻处理为置于液氮中进行，加热为冷冻后再置于100℃水浴中进行。
17.所述变性缓冲液为二硫苏糖醇(dtt)和dlb缓冲液组成，其中，dtt和dlb的体积比为1：11。
18.将处理后向溶液中加入变性缓冲液按3:4的体积比例充分混匀；混匀后65℃水浴加热处理10min，而后向体系内加入反应终止液按3:7的比例充分混匀，充分混匀后置于冰上；而后向加入终止液中加入配置的扩增体系混匀，混匀后依次在30℃的水浴温度下反应8h，反应后再于70℃的水浴温度下反应3min，即可获得样品中胞内共生菌基因组dna。
19.所述配置的扩增体系为：无rna酶h20 9ul，反应缓冲液29ul，phi29 dna聚合酶2ul。
20.对所得胞内共生菌基因组dna通过使用qubit仪器检测dna的浓度，将提取所得胞内共生菌基因组dna稀释后，通过0.8％脉冲场电泳检测dna片段大小，电泳条件为5-80k，电泳时间为17h。
21.本发明的优点在于：本发明的样本处理方式，可以大大清除胞外环境菌的干扰；使用显微操作系统，实现直接对胞内共生菌进行分离和保存；反复冷冻和加热筛选出来的菌，有利于细菌细胞充分裂解和dna释放；使用的扩增体系和phi29 dna聚合酶能够从单细胞水平上实现胞内共生菌基因组dna扩增。本发明能够精确、高效且快速地从贝类组织细胞内分离共生菌，并从单细胞水平上实现其基因组dna扩增，获得的dna产量和质量均满足目前的基因组测序技术要求。本发明所用试剂耗材均易于获取和购买，解决了诸多贝类胞内共生菌难以通过体外培养，以进行基因组测序的难题。
附图说明
22.图1为本发明方法提取的贝类胞内共生菌基因组dna的脉冲场电泳结果。
23.图2为本发明方法、通过基于细胞大小差异的过滤法和使用商品化试剂盒提取的贝类胞内共生菌dna中宿主序列所占比例效果图。
具体实施方式
24.以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
25.本发明通过环境菌清除、宿主细胞膜裂解、显微操作分离胞内共生菌、胞内共生菌dna释放和变性、胞内共生菌基因组dna扩增，基因组dna浓度和片段大小检测这六个步骤。
本发明的样本处理方式，可以大大清除胞外环境菌的干扰；使用显微操作系统，实现直接对胞内共生菌进行分离和保存；反复冷冻和加热筛选出来的细菌，有利于细菌细胞充分裂解和dna释放；使用的扩增体系和phi29 dna聚合酶能够从单细胞水平上实现胞内共生菌基因组dna扩增。本发明能够精确、高效且快速地从贝类组织细胞内分离共生菌，并从单细胞水平上实现其基因组dna扩增，获得的dna产量和质量均满足目前的基因组测序技术要求。本发明所用试剂耗材均易于获取和购买，解决了诸多贝类胞内共生菌难以通过体外培养，以进行基因组测序的难题。
26.实施例
27.船蛆鳃组织胞内共生菌(teredinibacter turnerae)基因组dna的提取方法，需用到以下仪器和试剂：
28.电动组织研磨器；
29.微型离心机；
30.恒温水浴锅；
31.显微操作系统；
32.qubit仪器；
33.硫酸庆大霉素溶液：购自索莱宝科技有限公司(solarbio)；
34.tritonx-100细胞裂解液：购自索莱宝科技有限公司(solarbio)；
[0035]1×
磷酸盐缓冲液(pbs)：购自索莱宝科技有限公司(solarbio)；
[0036]
二硫苏糖醇(dtt)：购自索莱宝科技有限公司(solarbio)；
[0037]
dlb缓冲液：内含氢氧化钾等，在使用前需加入500μl无rna酶h20，购自凯杰生物技术有限公司(qiagen)；
[0038]
反应终止液(stop solution)：购自凯杰生物技术有限公司(qiagen)；
[0039]
无rna酶h20：购自赛默飞世尔科技公司(thermo fisher)；
[0040]
phi29 dna聚合酶反应缓冲液：内含随机六聚体引物，购自neb(new england biolabs)；
[0041]
phi29 dna聚合酶：购自neb(new england biolabs)。
[0042]
所述提取方法，包括以下步骤:
[0043]
(1)环境菌清除：使用600ul硫酸庆大霉素溶液浸泡100mg船蛆鳃组织1h；
[0044]
(2)宿主细胞膜裂解：取上述鳃组织样品，轻轻吸出硫酸庆大霉素溶液，pbs洗涤2-3次后，向样品中加入400ul 1％tritonx-100细胞裂解液，使用电动组织研磨器匀浆鳃组织样品；
[0045]
(3)按照上述记载搭建系统显微操作分离胞内共生菌：吸取50ul上述样品滴于载玻片上，并盖上盖玻片。将载玻片置于倒置光学显微镜下，使用60倍物镜观察，基于胞内共生菌的形态和大小特征对其进行筛选。使用油压式注射装置抽取约10个细菌于微量离心管中，在离心管中加入4ul pbs，并使用封口膜密封管盖。
[0046]
(4)胞内共生菌dna释放和变性：将上述样品置于液氮中冷冻而后再于100℃水浴加热处理，按照这种冷冻-加热的处理方式反复5个循环，每次冷冻和加热各持续5min，以充分裂解细菌细胞，作为样品。
[0047]
采用3ul二硫苏糖醇(dtt)和33ul dlb缓冲液配置变性缓冲液，充分混匀，该体系
能够满足12个反应体系。
[0048]
取5ul的样品向其中加入3ul上述配置的变性缓冲液(所述变性缓冲液为：3ul二硫苏糖醇(dtt)和33ul dlb配置而成)，充分混匀后，65℃水浴加热10min。水浴结束后，在样品中加入3ul反应终止液，充分混匀后置于冰上，待用；
[0049]
(5)胞内共生菌基因组dna扩增：使用9ul无rna酶h20、29ul phi29dna聚合酶反应缓冲液、2ul phi29 dna聚合酶为配置1个扩增体系，充分混匀。将该混合溶液加入至上述步骤(4)所得样品中，充分混匀后，置于30℃水浴加热8h。水浴结束后，再次将样品置于70℃水浴加热3min。
[0050]
(6)基因组dna浓度和片段大小检测：吸取1ul dna样品，通过使用qubit仪器检测dna的浓度和纯度(参见表1)。另吸取2ul经稀释10倍的dna样品，通过0.8％脉冲场电泳检测dna片段大小，电泳条件为5-80k，电泳时间为17h。
[0051]
结果如表1、图1和图2，从中可以看出，实例样dna浓度和总量较高，满足目前的基因组测序技术要求。此外，实例样基因组dna片段达到48kb以上，且未发生降解，dna中宿主(即贝类)序列占比极低(3.12
±
0.54％)，表明胞内共生菌分离效果好。
[0052]
表1
[0053][0054][0055]
对比例1
[0056]
基于细胞大小差异分离贝类胞内共生菌的方法
[0057]
由于贝类细胞与其胞内共生菌的细胞大小存在明显差异(贝类细胞直径约为10μm，胞内共生菌直径约为1μm)，因此可通过基于细胞大小差异的过滤法分离贝类胞内共生菌。宏基因组技术是对于一些难以体外培养微生物的群落结构和功能进行研究的新技术。通过高通量测序与分析，对微生物种群的dna片段进行测序和拼接，并与公布数据库中其他菌类的信息比对，从而预测菌种的丰度和功能。通过宏基因组技术对过滤分离出的胞内共生菌dna进行测序，可获得菌群组成信息和进行菌种功能预测等。
[0058]
需用到以下仪器和试剂：
[0059]
电动组织研磨器；
[0060]
离心机；
[0061]
恒温水浴锅；
[0062]
70μm细胞筛：购自bioshap公司；
[0063]
40μm细胞筛；购自bioshap公司；
[0064]
5μm滤膜：购自密理博(millipore)公司；
[0065]
100％酒精：购自中国医药集团；
[0066]
氯仿：购自索莱宝科技有限公司(solarbio)；
[0067]
异戊醇：购自索莱宝科技有限公司(solarbio)；
[0068]1×
磷酸盐缓冲液(pbs)：购自索莱宝科技有限公司(solarbio)；
[0069]
硫酸庆大霉素溶液：购自索莱宝科技有限公司(solarbio)；
[0070]
蛋白酶k，购自索莱宝科技有限公司(solarbio)；
[0071]
tris饱和酚，购自青岛海螺生物科技有限公司；
[0072]
tritonx-100细胞裂解液：购自索莱宝科技有限公司(solarbio)；
[0073]
所述提取方法，包括以下步骤:
[0074]
(1)环境菌清除：使用600ul硫酸庆大霉素溶液浸泡100mg贝类鳃组织1h；
[0075]
(2)宿主细胞膜裂解：轻轻吸出硫酸庆大霉素溶液，pbs洗涤2-3次后，向上述鳃组织样品中加入400ul 1％tritonx-100细胞裂解液，使用电动组织研磨器匀浆；
[0076]
(3)匀浆梯度过滤：将上述样品通过70μm细胞筛进行过滤，保存滤液。将所获得的滤液再通过40μm细胞筛过滤，保存滤液；最后将该滤液再通过5μm滤膜过滤，并保存滤液。
[0077]
(4)滤液dna提取和宏基因组测序：通过酚－氯仿法提取滤液dna，主要包括如下几个步骤：在滤液中加入10μl蛋白酶k，置于恒温水浴锅中56℃孵育1h；在样品中加入等体积的tris饱和酚，充分混合摇匀；经12000rpm，7min，4℃离心后，样品分为三层，最上层的即为dna，吸取最上层液体于新的离心管中；配置混合液，tris饱和酚：氯仿：异戊醇＝25:24：1；在样品中加入450μl该混合液，并充分混匀；经12000rpm，7min，4℃离心后，吸取上清液于新的离心管中；加入2.5倍体积的100％酒精；再次12000rpm，7min，4℃离心，弃上清；在样品中加入400μl 75％酒精，反复吹打溶解，即获得dna样品。将该dna样品进行鸟枪法宏基因组测序，并将所获得原始序列比对到该贝类的参考基因组上。
[0078]
结果如图2，从中可以看出，对比例1样dna中宿主(即贝类)序列占比极高(85.36
±
7.52％)，其原因很可能在于宿主细胞在裂解和过滤时产生的大量细胞碎片通过滤膜进入滤液中。因此，通过基于细胞大小差异分离贝类胞内共生菌的方法获得的样品中包含大量宿主污染，分离效果差。
[0079]
对比例2
[0080]
通过使用商品化试剂盒分离贝类组织胞内共生菌dna的方法
[0081]
市面上用于动物组织胞内共生菌dna提取的试剂盒种类繁多(大多为进口，且价格昂贵)，其在贝类组织胞内共生菌dna提取的使用效果并不理想。
[0082]
需用到以下仪器和试剂：
[0083]
电动组织研磨器；
[0084]
离心机；
[0085]
恒温水浴锅；
[0086]
100％酒精：购自中国医药集团；
[0087]1×
磷酸盐缓冲液(pbs)：购自索莱宝科技有限公司(solarbio)；
[0088]
硫酸庆大霉素溶液：购自索莱宝科技有限公司(solarbio)；
[0089]
qiagen qiaamp dna微生物富集试剂盒：购自凯杰生物技术有限公司(qiagen)；
[0090]
所述提取方法，包括以下步骤:
[0091]
(1)环境菌清除：使用600ul硫酸庆大霉素溶液浸泡100mg贝类鳃组织1h，轻轻吸出硫酸庆大霉素溶液，使用pbs洗涤2-3次；
[0092]
(2)按试剂盒说明书，使用qiagen qiaamp dna微生物富集试剂盒，获得贝类鳃组织胞内共生菌dna；
[0093]
(3)胞内共生菌dna宏基因组测序：将上述dna样品经鸟枪法宏基因组测序，并将所
获得原始序列比对到该贝类的参考基因组上。
[0094]
结果如图2，从中可以看出，对比例2样dna中宿主(即贝类)序列占比过高(24.12
±
3.04％)。因此，通过使用商品化试剂盒分离贝类组织胞内共生菌dna的方法所获得的样品中包含大量宿主污染，分离效果不佳。