编辑RNA的方法和组合物

本发明涉及利用工程化rna来编辑rna的方法和组合物，工程化rna能够募集腺苷脱氨酶用以使靶标rna中的一个或多个腺苷脱氨基。

背景技术：

1、基因组编辑是生物医学研究和疾病疗法开发的有力工具。到目前为止，最流行的基因编辑技术是成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspacedshort palindromic repeats，crispr)-cas系统，它是从细菌和古细菌的适应性免疫系统开发出来的。crispr-cas可以精确打靶和切割基因组dna，从而产生双链dna断裂(dsb)。dsb可以通过非同源末端连接(nhej)途径修复，导致插入或缺失(indel)，后者在大多数情况下使基因失活。替选地，同源定向修复(hdr)途径可以使用同源模板dsdna或ssdna修复所述dsb，从而实现精确的基因组编辑。

2、最近，利用脱氨酶蛋白(诸如作用于rna的腺苷脱氨酶，adar)，开发了用于rna编辑的新工具。在哺乳动物细胞中，有三种类型的adar蛋白，adar1(两个同种型，p110和p150)，adar2和adar3(无催化活性)。adar蛋白的催化底物是双链rna，它可以从腺苷(a)核苷碱基中去除-nh2基团，将a变为肌苷(i)，后者被识别为鸟苷(g)并且在随后的细胞转录和翻译过程中与胞苷(c)配对。研究人员将λn肽与人类adar1或adar2脱氨酶结构域相融合来构建λn-adardd系统，该系统可由boxb茎环和反义rna组成的融合rna来引导，结合特定的rna靶标。该方法可以在靶标a碱基处将靶标a编辑为i(引入a-c错配)，从而导致从a至g的rna碱基编辑。用于rna编辑的其他方法包括将反义rna融合至r/g基序(adar-募集rna支架)以通过在哺乳动物细胞中过表达adar1或adar2蛋白来编辑靶标rna，以及利用dcas13-adar精确打靶和编辑rna。

3、本文提及的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的公开内容均通过提及以其整体由此并入本文。

技术实现思路

0、发明概述

1、核酸编辑在生物学研究和治疗学的发展中具有巨大的潜力。目前用于dna或rna编辑的工具依赖于将外源蛋白引入活的生物体，由于可能的异常效应子活性，传递限制和免疫原性，它们可能面临潜在的风险或技术障碍。在一些方面，本技术提供了使用短rna来利用内源性adar(作用于rna的腺苷脱氨酶)蛋白用于靶向rna编辑的可编程方法。在一些方面，本技术提供了一种工程改造的rna，其与靶转录物部分互补以募集天然adar1或adar2以在靶标rna中的特定位点将腺苷变为肌苷。本文所述的方法统称为“leaper”(利用内源性adar进行rna的可编程编辑)，而募集adar的rna可互换地称为“drna”或“arrna”。

2、在一个方面，本技术提供了一种用于编辑宿主细胞中的靶标rna的方法，包含将脱氨酶募集rna(drna)或编码脱氨酶募集rna的构建体引入宿主细胞，其中，所述drna包含与靶标rna杂交的互补rna序列，并且其中，所述drna能够募集作用于rna的腺苷脱氨酶(adar)以使靶标rna中的靶标腺苷(a)脱氨基。在某些实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是人类细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是小鼠细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞。

3、在某些实施方案中，adar天然地或内源地存在于宿主细胞中，例如，天然地或内源地存在于真核细胞中。在一些实施方案中，adar由宿主细胞内源表达。在某些实施方案中，adar对宿主细胞而言是外源的。在一些实施方案中，adar由核酸(例如dna或rna)编码。在一些实施方案中，该方法包括将adar或编码adar的构建体引入宿主细胞。在一些实施方案中，该方法不包含将任何蛋白质引入宿主细胞中。在某些实施方案中，所述adar是adar1和/或adar2。在一些实施方案中，adar是选自由hadar1，hadar2，小鼠adar1和小鼠adar2构成的组的一种或多种adar。

4、在某些实施方案中，cas不识别所述drna。在一些实施方案中，所述drna不包含crispr/cas系统中使用的crrna，tracrrna或grna。在一些实施方案中，该方法不包含将cas或cas融合蛋白引入宿主细胞中。

5、在某些实施方案中，所述靶标rna中的靶标a的脱氨基作用导致所述靶标rna中的错义突变、过早的终止密码子、异常剪接或可变剪接。在一些实施方案中，靶标rna编码蛋白质，而所述靶标rna中靶标a的脱氨基作用导致所述蛋白质的点突变、截短、延伸和/或错误折叠。在一些实施方案中，所述靶标rna中靶标a的脱氨基作用导致靶标rna中的错义突变、过早的终止密码子、异常剪接或可变剪接的回复。在一些实施方案中，其中所述靶标rna编码截短的、延长的、突变的或错误折叠的蛋白质，靶标rna中的靶标a的脱氨基作用通过靶标rna中的错义突变、过早的终止密码子、异常剪接或可变剪接的回复产生有功能的、全长的、正确折叠的和/或野生型蛋白质。在一些实施方案中，靶标rna是调节rna，并且靶标a的脱氨基作用导致由靶标rna调节的下游分子的表达的变化。在某些实施方案中，该方法用于利用内源性腺苷脱氨酶在靶标rna上的编辑产生由靶标rna编码的蛋白质的点突变和/或错误折叠、和/或在靶标rna中产生过早的终止密码子、异常剪接位点、和/或的可变剪接位点。

6、在某些实施方案中，提供了用于编辑宿主细胞中的多种靶标rna的方法，其中所述方法包含将多种drna或编码所述多种drna的构建体引入宿主细胞中，其中所述多种脱氨酶募集rna中的每一种包含与多种靶标rna中的相应靶标rna杂交的互补rna序列，并且其中每种drna能够募集作用于rna的腺苷脱氨酶(adar)以使相应靶标rna中的靶标腺苷(a)脱氨基。

7、在一些实施方案中，提供了经编辑的rna或宿主细胞，其具有通过如上所述的rna编辑方法中的任一种生产的经编辑的rna。

8、在一个方面，本技术提供了治疗或预防个体疾病或病症的方法，包含根据如上所述的rna编辑方法的任何一种编辑与个体细胞中的疾病或病症相关的靶标rna。在一些实施方案中，该方法包含离体编辑细胞中的靶标rna。在一些实施方案中，该方法包含将经编辑的细胞施用于个体。在一些实施方案中，该方法包含向个体施用有效量的drna或者编码该drna的构建体。在一些实施方案中，该方法还包含向细胞中引入adar或编码adar的构建体(例如，病毒载体)。在一些实施方案中，该方法还包含向个体施用adar或编码该adar的构建体(例如，病毒载体)。在一些实施方案中，疾病或病症是遗传性的基因疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病症与一种或多种获得性基因突变(例如，药物抗性)相关。

9、本技术的一个方面提供了一种drna，其通过募集作用于rna的腺苷脱氨酶(adar)来使靶标rna中的靶标腺苷脱氨基，所述腺苷脱氨酶包含与靶标rna杂交的互补rna序列。在一些实施方案中，drna包含seq id no：25-44、142-205、341-342中任一项的核酸序列。

10、在根据本文所述的方法或drna的任何一项的一些实施方案中，所述drna包含下述rna序列，其包含直接与在靶标rna中待编辑的靶标腺苷相对的胞苷(c)、腺苷(a)或尿苷(u)。在某些实施方案中，所述rna序列还包含一个或多个鸟苷，每个鸟苷直接与靶标rna中的非靶标腺苷相对。在某些实施方案中，靶标rna序列中靶标a的5'最近邻位是选自u，c，a和g的核苷酸，优先度u>c≈a>g，而且靶标rna序列中靶标a的3'最近邻位是选自g，c，a和u的核苷酸，优先度g>c>a≈u。在某些实施方案中，在靶标rna中靶标a处于选自：由uag，uac，uaa，uau，cag，cac，caa，cau，aag，aac，aaa，aau，gag，gac，gaa和gau构成的组的三碱基基序中。在某些实施方案中，其中所述三碱基基序是uag，所述drna包含与所述三碱基基序中的u正对的a，与靶标a正对的c，和与三碱基基序中的g正对的c，g或u。在某些实施方案中，其中所述三碱基基序是靶标rna中的uag，所述drna包含与靶标rna的uag相对的acc，acg或acu。

11、在根据本文所述的方法或drna的任何一项的一些实施方案中，所述脱氨酶募集rna包含超过40、45、50、55、60、65、70、75或80个的核苷酸。在某些实施方案中，脱氨酶募集rna长度为40-260、45-250、50-240、60-230、65-220、70-210、70-200、70-190、70-180、70-170，70-160、70-150、70-140、70-130、70-120、70-110、70-100、70-90、70-80、75-200、80-190、85-180、90-170、95-160、100-150或105-140个核苷酸。在某些实施方案中，靶标rna是选自：由前信使rna，信使rna，核糖体rna，转移rna，长非编码rna和小rna(例如mirna)构成的组的rna。

12、在根据本文所述的方法或drna的任何一项的一些实施方案中，所述drna是单链rna。在一些实施方案中，所述互补rna序列是单链的，并且其中所述drna还包含一个或多个双链区。在一些实施方案中，所述drna包含一种或多种修饰，例如2'-o-甲基修饰和/或硫代磷酸酯修饰。

13、在一些实施方案中，提供了编码上述任何一种drna的构建体(例如，病毒载体或质粒)。在一些实施方案中，所述构建体包含与编码drna的序列可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，所述构建体是dna构建体。在一些实施方案中，所述构建体是病毒载体，诸如aav，诸如aav8。

14、在一些实施方案中，提供了文库，其包含根据上述任何一种drna的多个drna或根据上述任何一种构建体的多个构建体。

15、还提供了组合物，宿主细胞，试剂盒和制品，其包含本文所述的任何一种drna，本文所述的任何一种构建体，或本文所述的任何一种文库。