一种从具柄重楼中提取的甾体皂苷类化合物和制备及用途

1.本发明涉及一种从重楼属(paris)植物具柄重楼(paris fargesii var.petiolate)中提取分离得到的新的化合物，具体涉及一种从具柄重楼中提取的甾体皂苷类化合物和制备及用途，属于医药技术领域。


背景技术：

2.肿瘤是人类死亡的主要原因之一，抗肿瘤药物的研发成为医药领域研究的重点和难点。抗肿瘤化药因毒副作用大、易产生耐药性以及不良的预后，使得越来越多的研究者将目光转向天然药物。其中，皂苷的抗肿瘤作用备受关注，它们广泛存在于植物体内，种类繁多，组成复杂。目前研究较多的甾体皂苷类成分以重楼皂苷为主，如重楼皂苷ⅰ、重楼皂苷ⅱ、重楼皂苷
ⅴ
、重楼皂苷ⅵ、重楼皂苷ⅶ等，以及人参皂苷、柴胡皂苷、甘草皂苷等三萜皂苷。
3.中药重楼为百合科(liliaceae)重楼属云南重楼(paris polyphylla smith var.yunnanensis)或七叶一枝花(p.polyphylla var.chinensis)的干燥根茎，具有清热解毒、消肿止痛和凉肝定惊的功效，常用于疔疮痈肿、咽喉肿痛、虫蛇咬伤、跌打损伤、惊风抽搐等证，是著名中成药云南白药胶囊、痛血康胶囊、热毒清片等的主要组成药材。药理研究发现，重楼的主要药效物质即为甾体皂苷，亦总称为重楼皂苷，现代临床上常用于炎症的治疗。
4.具柄重楼(p.fargesii var.petiolate)属于南重楼组植物球药隔重楼的变种，多生于海拔1150～2270m阴湿的阔叶林下，主要分布于我国西南各省区，如江西、广西、贵州和四川。具柄重楼的根茎粗壮，具有较高的药用价值，但是，尚未见对其化学成分分离鉴定研究以及抗肿瘤活性方面研究的相关报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一是：提供一种从具柄重楼中提取的甾体皂苷类化合物。
6.本发明的目的之二是：提供一种从具柄重楼中提取的甾体皂苷类化合物的制备方法。
7.本发明的目的之三是：提供一种从具柄重楼中提取的甾体皂苷类化合物的用途。本发明的甾体皂苷类化合物能够对胶质瘤细胞、肝癌细胞和胃癌细胞均有显著的抑制作用。
8.本发明的技术方案是：一种从具柄重楼中提取的甾体皂苷类化合物，该甾体皂苷类化合物分子式为c
44h70o17
，其化学结构式为：
[0009][0010]
上述结构的化学名称为偏诺皂苷元-3-o-β-d-呋喃芹糖基-(1
→
4)-[α-l-吡喃鼠李糖基-(1
→
2)]-β-d-吡喃葡萄糖苷，是从具柄重楼中分离得到的甾体皂苷类化合物，简称为pfp1。
[0011]
进一步，所述的一种从具柄重楼中提取的甾体皂苷类化合物的制备方法，以具柄重楼为原料，将其根茎粉碎成粗粉后，取2kg，加入20l浓度为70％的乙醇进行回流提取，共提取5次，每次2小时，合并提取液，减压回收乙醇，得提取物；将提取物分散于8l水中，用石油醚萃取3次，每次8l；萃取后的水相再用水饱和正丁醇萃取3次，每次8l，合并水饱和正丁醇萃取液，减压回收正丁醇后得到总皂苷提取物；
[0012]
将总皂苷提取物进行硅胶柱层析，以体积比为100:1:0～65:35:5的二氯甲烷-甲醇-水混合溶剂的下层饱和溶剂作为洗脱液进行梯度洗脱，以200ml为一个流份进行接收，并用硅胶薄层层析检测，收集rf值在0.4～0.65处显示紫红色斑点的流份，即为含化合物pfp1的总皂苷混合物，减压蒸干溶剂后得3.8g样品；
[0013]
样品采用sephdex lh-20葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇洗脱，按200ml为一个流份接收，薄层层析检测，合并含pfp1的第13～17流份，减压蒸干溶剂后得1.4g样品；
[0014]
将1.4g样品再用反相柱层析，以甲醇:水按体积比2:3～1:0洗脱，按100ml为一个流份接收，薄层层析检测，合并含pfp1的第20～34流份，减压蒸干溶剂后得812.8mg样品；
[0015]
最后经半制备高效液相色谱hplc分离纯化得到pfp1的纯品。
[0016]
进一步，所述的一种从具柄重楼中提取的甾体皂苷类化合物的用途是：所述甾体皂苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0017]
进一步，所述甾体皂苷类化合物在制备抗胶质瘤、肝癌或胃癌药物中的应用。
[0018]
进一步，所述的胶质瘤为u87mg人胶质瘤细胞或u251人胶质瘤细胞，所述的肝癌为hepg2人肝癌细胞，所述的胃癌为sgc-7901人胃癌细胞。
[0019]
进一步，所述甾体皂苷类化合物单独使用或与其他药物混合，配制成在临床上使用的注射剂、或散剂、或丸剂、或片剂、或微囊剂、或软胶囊剂、或膜剂、或膏剂、或酊剂、或颗粒剂、或气雾剂。
[0020]
本发明的特点是：本发明分离得到这种新的甾体皂苷类化合物，具有较好的生物活性，其中该甾体皂苷类化合物pfp1糖基中的β-d-呋喃芹糖基比较罕见，在甾体皂苷中甚少发现，在本属植物中更是少见。该甾体皂苷类化合物对胶质瘤细胞、肝癌细胞和胃癌细胞都有明显的抑制作用，表明其可以进一步制备为新的抗肿瘤药物进行研究开发。
[0021]
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚的了解本发明的技术手
段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如下。
附图说明
[0022]
图1是本发明甾体皂苷类化合物pfp1的二维核磁1h-1h cosy、hmbc和noesy谱相关信号。
具体实施方式
[0023]
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
[0024]
实施例1
[0025]
本实施例提供了一种从具柄重楼中提取的甾体皂苷类化合物的提取和分离，该甾体皂苷类化合物是从具柄重楼根茎中分离获得，分子式为c
44h70o17
，化学结构式为：
[0026][0027]
上述结构的化学名称为偏诺皂苷元-3-o-β-d-呋喃芹糖基-(1
→
4)-[α-l-吡喃鼠李糖基-(1
→
2)]-β-d-吡喃葡萄糖苷，是首次从具柄重楼根茎中分离得到的新的甾体皂苷类化合物，以下简称为pfp1。
[0028]
进一步，所述的一种从具柄重楼中提取的甾体皂苷类化合物的制备方法，具体如下：
[0029]
制备pfp1的原料采自陕西省安康市镇坪县，将其根茎粉碎成粗粉后，2kg，加入20l质量百分比浓度为70％的乙醇进行回流提取，共提取5次，每次2小时，合并提取液，减压回收乙醇，得提取物700g；将提取物分散于8l水中，用石油醚萃取3次，每次8l；萃取后的水相再用水饱和正丁醇萃取3次，每次8l，合并水饱和正丁醇萃取液，减压回收正丁醇后得到总皂苷提取物200g；
[0030]
将总皂苷进行硅胶柱层析，以体积比为100:1:0～65:35:5的二氯甲烷-甲醇-水混合溶剂的下层饱和溶剂作为洗脱液进行梯度洗脱，以200ml为一个流份进行接收，并用硅胶薄层层析检测，收集rf值在0.4～0.65处显示紫红色斑点的流份，即为含化合物pfp1的总皂苷混合物，减压蒸干溶剂后得3.8g样品。
[0031]
样品采用sephdex lh-20(ge-healthcare公司)葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇洗脱，按200ml为一个流份接收，薄层层析检测，合并含pfp1的第13～17流份，减压蒸干溶剂后得1.4g样品。
[0032]
将1.4g样品再用ods c18(merck公司)反相柱层析，以甲醇:水按体积比2:3～1:0洗脱，按100ml为一个流份接收，薄层层析检测，合并含pfp1的第20～34流份，减压蒸干溶剂后得812.8mg样品；
[0033]
最后经高效液相色谱仪(汉邦公司)分离纯化(hplc条件为：hedra ods-2色谱柱20
×
250mm，40％乙腈为流动相，流速10ml/min，25℃，206nm紫外检测)，得到pfp1的纯品29.6mg。
[0034]
实施例2
[0035]
在实施例1的基础上，对化合物pfp1的结构进行鉴定：
[0036]
化合物pfp1为白色粉末，溶于吡啶，liebermann-burchard和molish反应呈阳性，20％硫酸乙醇溶液显色反应呈紫红色，表明该化合物可能是甾体皂苷类化合物。esi-ms给出其准分子离子峰m/z 892[m+na]
+
和m/z 868[m-h]-，hr-esi-ms给出准分子离子峰m/z 869.4541[m-h]-(calc.for c
44h69o16
,869.4540)，结合
13
c-nmr(125mhz，c5d5n)数据，如表1所示，确定其分子式为c
44h69o17
。
[0037]
通过分析化合物的
13
c nmr(c5d5n,125mhz)、1h nmr(c5d5n,500mhz)和dept谱发现其分子结构中44个碳信号中的27个归属于苷元。结合hmqc谱图，该化合物的1d nmr数据显示4个甲基氢信号δ
h 0.93(s,h
3-18),1.10(s,h
3-19),1.25(d,j＝8.0hz,h
3-21),0.72(d,j＝8.0hz,h
3-27)和对应的甲基碳信号δ
c 17.6,19.9,10.2,17.8；1个烯氢质子信号δ
h 5.30(br s)和对应的烯烃碳信号δ
c 122.3(c-6),141.3(c-5)；1个连氧季碳信号δ
c 90.7(c-17)；2个连氧次甲基碳信号δ
c 78.7(c-3)和90.6(c-16)；1个半缩醛季碳信号δ
c 110.3(c-22)。以上数据都是偏诺皂苷元的特征信号，表明该化合物的苷元具有偏诺皂苷元骨架。在hmbc谱中，h-4(δ
h 2.79)、h-7(δh1.90)与c-5、c-6分别存在远程相关信号，表明双键位于5(6)位。在noesy谱中，h
3-19β/h-1a(δ
h 1.76)和h-1b(δh0.99)/h-3(δh3.85)的noe相关峰表明3-oh是β构型；c-16、c-17的化学位移值分别为δc90.6,90.7，表明c-17位连有羟基且羟基，按照生源途径，该羟基为α构型；通过h
2-26化学位移值差δ
ha-δ
hb
＝3.52-3.52＝0《0.48，可以确定c
25
为r构型
[16]
。苷元的
13
c-nmr(200mhz,c5d5n)数据见表1。化合物pfp1通过酸水解及衍生，经gc分析表明其糖基为d-葡萄糖(glc)、l-鼠李糖(rha)和d-芹糖(api)，组成比为1:1:1。在1h-nmr谱中显示3个糖的端基氢信号δ
h 4.94(d,j＝7.5hz,glc h-1),6.27(br s,rha h-1),5.93(d,j＝3.5hz,api h-1)，在hsqc谱中分别与相应的糖端基碳信号相关(δ
c 100.6,102.5,111.7)。由glc端基氢偶合常数(j＝7.5hz》7.0hz)可知葡萄糖形成的苷键为β构型；虽然鼠李糖的端基氢信号显示为单峰，但通过其c-3和c-5的化学位移值可推测其形成的苷键为α构型；芹糖五个碳的化学位移值δ
c 111.7(c-1),77.9(c-2),80.6(c-3),75.5(c-4),65.3(c-5)与α-和β-d-apiose五个碳的化学位移值比较可知其形成的苷键为β构型。在hmbc谱中，glc h-1与苷元c-3存在远程相关峰，说明glc连接于苷元c-3位；rha h-1与glc c-2的远程相关表明rha连接于glc的c-2位；同样，api h-1与glc c-4的远程相关表明api连接于glc的c-4位。noesy谱的相关信号进一步验证了上述糖链结构。综上所述，化合物pfp1的结构被鉴定为偏诺皂苷元-3-o-β-d-呋喃芹糖基-(1
→
4)-[α-l-吡喃鼠李糖基-(1
→
2)]-β-d-吡喃葡萄糖苷，如图1所示。
[0038]
表1式ι化合物的1h和
13
c核磁共振数据(测试溶剂：氘代吡啶)
[0039][0040]
实施例3
[0041]
对实施例1分离提纯得到的化合物pfp1进行体外抗肿瘤试验，试验所采用的细胞为人胶质瘤细胞(u87mg、u251)、人肝癌细胞(hepg2)和人胃癌细胞(sgc-7901)；采用常规的cck-8法测试。
[0042]
实施方法为：取在对数生长期生长状态良好的肿瘤细胞u87mg、u251、hepg2和sgc-7901细胞，调整细胞密度至6
×
104个/ml。取细胞悬液接种于96孔板上，100μl/孔，置恒温co2培养箱中孵育24h后给药。将细胞分为空白对照组、阳性对照组和实验组，pfp1、重楼皂苷ⅰ(polyphyllin
ꢀⅰ
)、重楼皂苷
ⅴ
(polyphyllin v)、重楼皂苷ⅵ(polyphyllin
ꢀⅵ
)和cisplatin的浓度均设置为0.5、1、2、4、8、16、32和64μm，每组分别设置3个复孔。细胞培养24小时后，按照cck-8试剂使用说明操作，每孔加入10μl试剂，再培养2个小时后，用酶联免疫检测仪在波长为450nm处测定每孔的吸光值(od值)。并计算pfp1对肿瘤细胞的抑制率(计算公式：细胞抑制率＝(实验组od值-空白组对照组od值)/空白对照组od值
×
100％)。再采用spss 16.0计算半数抑制浓度(ic
50
)。ic
50
＞20μm表示无细胞毒性作用。
[0043]
其中，所述的polyphyllin
ꢀⅰ
、polyphyllin v、polyphyllin
ꢀⅵ
是在制备甾体皂苷类化合物pfp1过程中总皂苷混合物根据薄层层析检测和体外抗肿瘤活性筛选所得的产物。
[0044]
试验结果见表2。
[0045]
表2式i化合物pfp1、polyphyllin i、polyphyllin
ꢀⅴ
和polyphyllin
ꢀⅵ
对四种肿瘤细胞株u87mg、u251、hepg2和sgc-7901的抑制作用(ic
50
值，μm)
[0046][0047]
结果显示，化合物pfp1对四种肿瘤细胞的抑制作用强于polyphyllin v和polyphyllin
ꢀⅵ
，对胶质瘤细胞(u251)的抑制作用强于polyphyllin
ꢀⅰ
。pfp1对u87mg(人胶质瘤细胞)、u251(人胶质瘤细胞)、hepg2(人肝癌细胞)和sgc-7901(人胃癌细胞)都有明显的抑制作用，且pfp1对四种肿瘤细胞的生长抑制作用均强于polyphyllin v和polyphyllin
ꢀⅵ
，其半数抑制浓度(ic
50
值)分别为8.29
±
0.08，6.07
±
0.06，8.24
±
0.57和6.20
±
0.79μm，而polyphyllin v对u87mg和u251两种胶质瘤细胞几乎无细胞毒性作用；pfp1对hepg2和sgc-7901的抑制作用略弱于polyphyllin
ꢀⅰ
，但对两种胶质瘤细胞(u87mg和u251)的抑制作用与polyphyllin
ꢀⅰ
相当。
[0048]
总结：本发明的甾体皂苷类化合物pfp1对u87mg(人胶质瘤细胞)、u251(人胶质瘤细胞)、hepg2(人肝癌细胞)和sgc-7901(人胃癌细胞)这几种人肿瘤细胞系均有显著的抑制作用，其半数抑制浓度(ic
50
值)分别为8.29
±
0.08，6.07
±
0.06，8.24
±
0.57和6.20
±
0.79μm。进一步用于制备为新的抗肿瘤药物进行研究开发，特别是所述甾体皂苷类化合物在制备抗胶质瘤、肝癌或胃癌药物中的应用。
[0049]
本发明的甾体皂苷类化合物pfp1可以单独使用或与其他药物混合，采用常规方法配制成在临床上可以使用的注射剂、或散剂、或丸剂、或片剂、或微囊剂、或软胶囊剂、或膜剂、或膏剂、或酊剂、或颗粒剂、或气雾剂。
[0050]
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。
[0051]
本实施例没有详细叙述的测试方法和英文缩写属本行业的公知常识，这里不一一叙述。