一种产香芽孢杆菌及其在烟草中的应用的制作方法

1.本发明公开了芽孢杆菌，具体为一种产香芽孢杆菌及其在烟草中的应用。


背景技术：

2.烟草是世界范围广泛种植的经济作物。随着烟草行业的发展,人们对烟草的品质有了新的要求,消费者希望可以吸食烟气更好,毒性更低,口感更佳的香烟。
3.当年收获的原烟，其内在品质都存在不同程度的缺陷，如青杂气重、刺激性大、烟气粗糙、烟香味被杂气掩盖，尤其是低等级的烟叶还有苦、辣、涩等不良感受，这样的烟叶是不能直接用于制造卷烟的，必须进行适当的醇化处理。通过醇化，使烟叶颜色更加均匀并适当加深，青杂气和刺激性大大减少，香味物质增加，吸味醇和。
4.醇化也称为“发酵”、“陈化”，是一种缓慢的发酵方法。烟叶醇化方法较多，有人工醇化、自然醇化等。将调制后的原烟进行包装并存放在特点的场所在自然气候条件下进行1～3年的发酵，随着季节和环境的变化烟叶的内在成分发生变化，品质中的优点得到显现，品质将逐渐得到改善，这个过程称作烟叶的醇化。烟叶陈化是环境、酶及微生物等共同作用的过程，微生物在其中发挥着重要作用。研究表明纤维素、果胶、蛋白质等大分子对吸味影响较大，而微生物可消耗烟叶中的蛋白质、纤维素及淀粉等，同时将烟叶中大分子物质分解为紫罗兰酮、大马酮、糠醛等小分子香味物质。因此，烟叶陈化是改善烟草品质的重要过程。传统的烟叶陈化过程是利用烟叶自身及其所处环境中微生物的代谢，由于存在较多不可控因素，会出现不同批次间差异较大的问题，而且陈化过程漫长，对生产造成很大的问题。
5.烟草浸膏是从烟叶或烟末中提取的具有烟草本香的一种浸膏，含有糠醛、香叶醇、大马酮、烟酮、甲基紫罗兰酮、乙位紫罗兰酮、巨豆三烯酮、二氢猕猴桃内酯等丰富的烟草香气化合物，其优点是香气逼真、自然，可增强烟香，降低杂气，提高卷烟品质，是优良的卷烟加香原料。但是，由于所用烟叶等级不同、制备工艺不同，很多烟草浸膏仍然存在杂气较重或刺激、辣味类似的问题。
6.在醇化烟草方面，芽孢菌属菌株发现具有可以醇化烟叶的作用。这与芽孢菌株可以产生丰富的各类生物酶相关。例如，中国专利《用于烟草用于降解烟叶中果胶的smxp-58菌株及其应用》(公布号cn 106434450a)中公开了利用枯草芽孢菌株用于烟叶醇化过程，其方法是将烟叶喷撒于打叶复烤烟片表面，于30℃恒温维持60-84h, 之后经过80℃灭活。在所述smxp-58菌株用于醇化剂的方法中，主要作用机制是csmxp-58菌株通过分泌果胶酶使得降解叶片中的果胶成分，降低吸食杂气，其作用因素较为单一。其次，现代打烟复烤流水线高度自动化，其基本流程为:原烟增温增湿9-12％)，真空回潮后 (含水率提升至约22％)，进入储叶柜(40℃)内储存吸收平衡4-6h，之后通过复烤(100-120℃)降低含量率至10-13％，之后打包储藏。公布号为cn 106434450 a中国专利中的枯草芽孢，需要喷雾在打叶复烤复烤叶片30℃恒温维持60-84h，其时间较长，难以匹配烟草打叶复烤生产线的生产流程。打叶复烤中储叶工序，通常需控制在4 h以内，最长不超过6h。
7.此外，河南中烟还公开一种产蛋白酶的短小芽孢杆菌smxp-03用于降解雪茄烟叶
中蛋白质；具体混合时，以体积比计，复配制剂中蛋白降解菌用于喷于雪茄烟叶表面用于降低其中的蛋白含量以提高烟叶品质，其处理条件为1-3％的使用量温30～40℃、环境湿度65～80％，堆积发酵8～12d，同样需要较长处理时间。
8.福建中烟陈笃建组采用产香酵母发酵烟叶方式25℃，发酵16h 方式对烟叶进行发酵处理，在处理后烟叶香气成分占比发生变化从而改善烟气香气组成及吸食效果(产香酵母对低次烟叶吸食品质的影响，贵州农业科学2013,41(4)：44～47)，其处理时间长达16h。
9.云南红云红河烟草集团(cn 102217794 a)采取将短小芽孢杆菌的发酵液作为生化添加剂，按照质量分数5％～10％的添加量喷洒至烟叶表明控制水分12-13％，在醇化车间醇化8个月后，烟叶品质有明显提高，添加生化添加剂醇化8个月的红大b4f烟叶，其化学成分接近于自然醇化24个月的b3f烟叶。陕西中烟公开了一种利用芽孢杆菌菌粉喷雾于烟叶表面，于37℃、相对湿度条件为80％下，发酵培养 24至48h(cn 102505002 b)可以明显提高烟叶香气。陕西中烟及西北农林大学还公开了一种复合菌剂，菌剂采用几种芽孢杆菌属和酿酒酵母菌属的几种菌复合菌粉作为生化处理剂，以喷于叶片表明进行发酵，以改善烟叶的吸味。


技术实现要素：

10.本发明的目的是为了提供一种产香芽孢杆菌及其在烟草中的应用，以改善烟叶感官。
11.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。
12.一种产香芽孢杆菌，其芽孢菌属菌株cffsh013分离自醇化烟叶，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉市武汉大学；分类命名为：芽孢杆菌cffsh013(bacillus sp.cffsh013)；保藏编号 cctcc no:m2020635。保藏时间为：2020年10月26日，该培养物的存活性本保藏中心于2020年11月10日检测完毕，结果为存活。
13.16s核酸测序结果表明其与地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、海氏芽孢杆菌具有高度同源性，因此鉴定为芽孢菌属菌株。菌株在lb 培养基及以27f与1492r通用引物16s核酸测序鉴定为芽孢菌属菌株，其27f与1492r引物所扩增的18srdna片段序列为序列1：
14.gggngctatacatgcagtcgagcggaccgacgggagcttgctcccttaggtcagcggcg gacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccg gggctaataccggatgcttgattgaaccgcatggttcaatcataaaaggtggcttttag ctaccacttgcagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcacca aggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacgg cccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacg gagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaaactctgttgttagggaag aacaagtaccgttcgaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggct aactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgg gcgtaaagcgcgcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccgg ggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtg tagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtc tgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtag tccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcag caaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaat tgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtgnttaattcgaagcaacgcgaagaacc ttaccaggtcttgacatcct
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15.首先，所述的芽孢菌属菌株cffsh013应用于制备改善烟草吸味的产品。芽孢菌属菌株cffsh013对烟草吸味的改善不仅仅是因为其菌株分泌的某种或者某几种酶的作用，其发酵后的发酵液本身含有提高改善烟草吸味的成分。其原因尚不清楚，猜测与该菌株发酵过程中产生的大量吡嗪类衍生物的含量与丰度有关。这使得发酵后的发酵液可以直接作为发酵液。
16.其次，该菌株能够提升烟草提取物或者烟草浸膏的产品档次。该菌株能够进一步醇化烟草提取物及烟草浸膏，提供香气的满度及质量，降低杂气。该菌株能够较短时间内使得叶黄素等类胡萝卜素细胞色素进一步氧化成大马酮、烟酮等香气成分。
17.此外，该菌株亦可直接作用于烟叶，加速烟叶醇化，提高烟叶的品质等级。该菌株也可以直接作为烟叶醇化剂喷撒于待醇化的烟叶表面打包后用于加速烟草醇化，提高烟叶档次与品质。同时，该菌株也可以在打叶复烤阶段施加至叶片或者在卷烟制丝阶段喷至烟丝上，改善烟叶的品质。
具体实施方式
18.下面结合具体实施例进一步阐述本发明的目的。
19.实施例1：cffsh013的培养
20.配置lb液体培养基(酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l)，115℃灭菌20min，培养基降至室温后，接入1％(v/v) 筛选的芽孢菌属菌株cffsh013，37℃培养24h，作为接种用种子液。
21.实施例2：cffsh013用于改善烟草提取物香气
22.本实施实例采用云烟浸膏(购于深圳波顿香料有限公司，中国)、作为烟草提取物原料。选取100g各烟草提取物原料，置于250ml 三角摇瓶中，分别按照表1所列的不同的条件下进行发酵培养。
23.表1 cffsh013改善烟草提取物发酵条件
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发酵结束后，将发酵烟草浸膏用饮用水稀释100倍后，按0.1％添加量喷到混合叶组烟丝上进行按照按烟草添加剂感官评吸方法(参照国标gb 5606.4)的评价，由具有省级评委资质的专业评委评吸，综合汇总结果见表2，结果表明cffsh013菌株通过发酵能够很好的提高浸膏的品质，增加烟香，降低杂气。
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表2.cffsh013改善烟草提取物发酵条件
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实施例3：芽孢属菌株cffsh013对于烟叶的改善
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现有技术中已经报道的增香菌株在处理烟叶时，其效率较低，难以达适应现有卷烟制丝线或者打叶复烤流水线的工作流程与工序时长。本实施实例中菌株对于烟叶改善的条件完全遵循打叶复烤流水线的工作流程与工序时长，其流程如下，菌株cffsh013按照实施实例 1所述的方式进行种子液的预培养，培养好的菌株菌液按照1g每100 g烟叶的比例在打叶复烤的原烟增温增湿工序被喷到烟叶上(此时烟叶水份9-12％)，真空回潮后(含水率提升至约22％)，之后烟叶进入储叶柜(40℃)内储存吸收平衡4h，之后通过复烤(100-120℃)降低含量率至10-13％。，复烤完成后的烟叶被切丝卷成样品烟用于评吸。
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在本实施实例中，除了菌株cffsh013以外，也选取了15株不同来源的芽孢菌株(见表3)作为对照，其培养过程与对烟叶的处理过程完全和菌株cffsh013一致。
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本实施实例中2019年产的云南烟叶(x3f)被用于本次实验的实验用叶，感官评价按照按烟草添加剂感官评吸方法(参照国标gb 5606.4)的评价，由具有省级评委资质的专业评委评吸，评吸结果如表4所示，其中品吸样品编号和表3中菌株编号一致。
[0034]
结果显示，除了少部分菌株存在微弱的提高香气浓度和降低杂气的作用以外，仅有菌株cffsh013能够在有限的4h的烟叶储叶过程中对烟叶的香气做了大幅度的改善，其明显提高了香气的浓度和香气的品质，同时降低了烟气中的杂气与刺激性，同时由评吸人员反馈， cffsh013菌株处理的烟叶还具有高雅的甜润感，烟气更加上扬开放。
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表3.实施实例3中所使用的微生物及其来源
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表2.cffsh013改善烟叶感官评价结果
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