一种人肠道病毒71型VP1蛋白特异性结合多肽及其制备方法和应用

一种人肠道病毒71型vp1蛋白特异性结合多肽及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及这一种一种人肠道病毒71型vp1蛋白特异性结合多肽及其制备方法和应用。


背景技术：

2.人肠道病毒71型(ev71)是单股正链rna病毒，从属于小rna病毒科肠道病毒a属。它是引发手足口病(hand-foot-and-mouth disease,hfmd)的主要病原体之一，发病时主要表现为发热、腹泻及疱疹性咽峡炎。与典型手足口病不同的是，某些ev71毒株感染可引起重症手足口病，并导致严重的神经系统并发症如无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹和神经源性肺水肿等，具有较高的病死率和致残率。ev71发病广泛，已成为全球关注的公共卫生问题。
3.ev71病毒有a、b、c三种基因型，其基因组全长约含有7500个核苷酸，编码具有2193个氨基酸的多聚蛋白。该多聚蛋白可以水解为p1、p2、p3三种前体蛋白，这三种前体蛋白可被自身酶系切割为vp1、vp2、vp3、vp4四种结构蛋白以及2a、2b、2c、3a、3b、3c、3d七个非结构蛋白。其中，vp4蛋白包埋于病毒外壳的内侧，其余三个结构蛋白均暴露于病毒颗粒表面，直接接触宿主免疫系统；vp1蛋白是ev71重要的衣壳蛋白之一，它决定这病毒的基因型，极易发生氨基酸序列改变，是病毒的毒力决定簇，也是导致患者出现肺水肿的直接原因。因此，vp1蛋白已成为科研工作者重点关注的对象之一。
4.从手足口病在我国首次出现以来，为了防止病毒流行和降低手足口病爆发的隐患，针对ev71病毒进行的抗病毒药物和疫苗研发从未停止过。我国于2015年12月到2017年5月，先后有3种手足口病疫苗经国家食品药品监督管理总局批准上市，分别是中国医学科学院医学生物研究所的ev71人二倍体细胞疫苗、北京科兴生物制品有限公司的ev71灭活疫苗和武汉生物制品研究所的ev71灭活疫苗。疫苗的预防接种已经大幅度降低了我国手足口病爆发的几率，但是目前仍然存在一些问题需要克服：(1)疫苗接种覆盖率不足以及不是所有人都能对现有疫苗产生良好反应的事实使得研发新型诊断和治疗ev71病毒的药物十分必要，尤其是在遇到大规模感染的时候；(2)ev71病毒具有嗜神经性，目前还不清楚具体的作用机理，严重程度下造成的神经系统疾病能否避免；(3)ev71病毒能够切割参与免疫的蛋白来规避免疫反应，能否克服这一问题也是一个难点；(4)病毒具有潜伏期，大多数情况下发病时已经错过最佳治疗时期，如果能在病毒潜伏期就检测出病毒并有针对性的进行预防和治疗，不但能够降低对患者的伤害，还能降低治疗成本。
5.因此，制备出能够特异性识别vp1蛋白的多肽，对于ev71病毒的检测和治疗药物的研发具有十分重要的意义。


技术实现要素：

6.本发明中提供了一种能够特异性识别和结合ev71病毒的vp1蛋白的多肽，该多肽
的氨基酸序列为hnwmwyaslpdr。
7.本发明中还提供了该多肽的制备方法，包括以下步骤：
8.s1、制备人肠道病毒71型vp1蛋白：以seq id no.3所示的核苷酸序列为模板，制备氨基酸序列如seq id no.4所示的vp1蛋白；
9.s2、生物淘洗：在孔板中加入vp1蛋白和gst蛋白，并接种大肠杆菌菌株和含四环素的培养基，培养；倾去残余液体，加入封闭液，用洗涤液洗涤若干次；加入噬菌体溶液扩增、纯化、洗脱得到洗脱的噬菌体；将洗脱的噬菌体溶液加入大肠杆菌培养物中扩增，分离得到扩增的洗脱液；重复进行第二轮、第三轮筛选，得到筛选出的阳性噬菌斑；
10.s3、扩增阳性噬菌体：：将大肠杆菌培养物稀释，蘸取若干分隔良好的蓝色噬菌斑接种培养扩增；然后离心取上清得到扩增的阳性噬菌体；
11.s4、编码噬菌体呈现的多肽的dna序列测定及氨基酸序列推导和氨基酸序列同源性分析；
12.s5、对筛选出的阳性噬菌体进行elisa鉴定。
13.在可选的实施方式中，步骤s1包括以下步骤：
14.s1-1、合成如seq id no.3所示的ev71病毒vp1蛋白的cdna，扩增ev71病毒vp1蛋白的核苷酸序列，将扩增后的序列连接至pfastbac1载体中，得到重组载体vp1-pfastbac1；
15.s1-2、将所述重组载体vp1-pfastbac1转化到大肠杆菌dh10bac中，得到表达vp1蛋白的杆状病毒穿梭载体，选择2个穿梭载体转染sf9细胞产生一代病毒p1；
16.s1-3、将步骤s1-2中sf9细胞的细胞培养上清、细胞裂解上清和经过重悬的细胞裂解沉淀加入到载样缓冲液中混匀、煮沸、离心，取上清进行10％sds-page凝胶电泳，制备背景清晰的干胶保存；对所述干胶进行western blot纯化，得到p1病毒储液；
17.s1-4、选取感染复数为1～10的p1病毒储液感染sf9细胞，确定最佳感染复数，选取最佳感染复数的p1病毒储液进行扩大培养得到二代病毒p2；
18.s1-5、收集p2感染的sf9细胞的裂解上清，用his60 ni superflow resin对vp1蛋白进行纯化，用含有30mmol/l、50mmol/l、200mmol/l、300mmol/l咪唑的pbs缓冲液分阶段洗脱柱子，收集各浓度梯度洗脱下来的蛋白，对洗脱液进行sds-page凝胶电泳分析；
19.s1-6、将步骤s1-5中sds-page分析结束后的凝胶进行western blot鉴定，得到的纯化后的vp1蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。
20.在可选的实施方式中，步骤s2包括以下步骤：
21.s2-1、在96孔板的2个孔中分别加入200μl用0.1mol/l的nahco3溶液稀释的浓度为100μg/ml的vp1-his溶液和gst-his溶液，4℃孵育过夜；接种10ml大肠杆菌于含四环素的20ml lb培养基中，37℃培养；取出96孔板，除尽残余液体；加入200μl tbs封闭液，4℃孵育2h；然后用tbst缓冲液洗涤若干次，每次洗涤均除尽残余液体；
22.s2-2、取200μl经tbst缓冲液稀释后含有2
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pfu的噬菌体溶液，加至步骤s2-1中已封闭好的gst-his包被孔进行预吸附，室温孵育1h；将经过预吸附的液体吸出转移入封闭好的vp1-his包被孔进行结合，室温孵育1h；倾去液体去除未结合的噬菌体，用tbst缓冲液洗涤若干次，每次洗涤均除尽残余液体；然后用100μl洗脱液洗脱，并迅速加入中和液中和，得到洗脱的噬菌体溶液；
23.s2-3、取1μl步骤s2-2的洗脱的噬菌体溶液测滴度，剩余洗脱的噬菌体溶液加至
20mlod为0.2～0.3的大肠杆菌培养物中，37℃振荡培养4.5h；将混合液在4℃、10000rpm下离心10min，取上清第二次离心；取80v/v％第二次离心的上清，加入1/6上清体积的peg8000/nacl溶液，4℃静置过夜；
24.s2-4、取出步骤s2-3所得液体于4℃下10000rpm离心15min，去掉上清；重复离心一次，吸尽残留上清；用1ml tbs缓冲液重悬，于4℃下10000rpm离心5min，取上清，加入1/6上清体积的peg8000/nacl溶液，冰浴1h；然后在4℃下10000rpm下离心15min，去掉上清；再重复离心一次，吸尽残留上清；用200μl含0.01w/v％nan3的tbs缓冲液重悬沉淀，在4℃下以10000rpm的速度离心1min，所得上清即为扩增好的洗脱液，即完成第一轮筛选；
25.s2-5、分别用200μl vp1-his和200μl gst-his蛋白溶液新包被96孔板各一孔，按照步骤s2-1～s2-4中的方法分别进行第二轮和第三轮筛选；第二轮和第三轮筛选中，vp1-his蛋白的浓度分别为50mg/l和20mg/l，tbst缓冲液中tween的浓度为0.5v/v％；
26.s2-6、取1μl第三轮筛选后的洗脱产物进行滴度测定，从滴度测定中菌斑数小于100的平板上随机挑取50个分隔良好的噬菌斑用于后续扩增和纯化。
27.在可选的实施方式中，步骤s3包括以下步骤：
28.s3-1、将大肠杆菌er2738的过夜培养物用lb培养液按体积比1:100稀释，按1ml/管分装于若干50ml的培养管中；
29.s3-2、蘸取50个分隔良好的蓝色噬菌斑分别放入所述培养管中，37℃振荡培养4.5h完成扩增；
30.s3-3、将步骤s3-2中扩增好的噬菌体培养液体离心30s；取上清再次离心，再取80％的第二次离心的上清，即得扩增的阳性噬菌体。
31.在可选的实施方式中，步骤s4包括以下步骤：
32.s4-1、分别取步骤s3中扩增后得到的若干个阳性噬菌体的上清进行dna测序；
33.s4-2、根据步骤s4-1中dna测序结果，推导出每个噬菌体呈现肽的氨基酸序列，将所有氨基酸序列分别与已知序列的蛋白质或多肽的氨基酸序列进行同源性比较，确认所述若干个阳性噬菌体所呈现的多肽的种类。
34.在可选的实施方式中，步骤s5包括以下步骤：
35.s5-1、以100mg/l vp1-his蛋白溶液包被96孔酶联板，每孔200μl，同时对每个vp1-his包被孔设立100mg/l gst-his和1w/v％bsa的包被孔作为阴性对照，4℃孵育过夜；
36.s5-2、倾去包被液，加入封闭液，4℃封闭2h；然后倾去封闭液，用tbst缓冲液洗涤若干次，每次洗涤均除尽残余液体；
37.s5-3、根据步骤s4的测序结果，取若干纯化的阳性噬菌体分别加入vp1-his、gst-his和bsa的包被孔中，每孔中阳性噬菌体的滴度为1
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109pfu，室温孵育2h；用tbst缓冲液洗涤若干次，每孔加入100μl hrp标记的小鼠抗m13噬菌体mab，室温孵育1h；再用tbst缓冲液洗涤若干次，用opd显色后测定490nm处的吸光度值；所述hrp标记的小鼠抗m13噬菌体mab的浓度为0.1μg/ml。
38.通过上述方法制备的能够特异性识别和结合ev71病毒vp1蛋白的多肽，可以用于制备检测ev71病毒的产品或/和制备治疗ev71病毒的药物。
39.本发明的有益效果是：本发明制备了一种人肠道病毒71型vp1蛋白特异性结合多肽，该多肽为一种全新的特异性阻断ev71的多肽，其可以特异性识别vp1蛋白，分子量小，易
于化学合成，免疫原性低，在快速检测ev71病毒、研发新型高效治疗手足口病的特异性药物等领域具有良好的潜在应用价值。
附图说明
40.图1为ev71病毒vp1蛋白的sds-page和wb鉴定结果图；
41.图2为sds-page分析ev71病毒vp1蛋白的纯化结果图；
42.图3为western blot方法对ev71病毒vp1蛋白纯化结果的鉴定图；
43.图4为本发明制备的ev71病毒vp1蛋白特异性结合多肽在490nm处的吸光度值。
具体实施方式
44.以下结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。本领域技术人员依据以下实施方式所作的任何等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
45.以下实施例中所使用的试剂和生物材料的来源或主要成分如下：
46.pfastbac1载体：普健生物(武汉)科技有限公司；
47.大肠杆菌dh10bac：普健生物(武汉)科技有限公司；
48.sf9细胞：普健生物(武汉)科技有限公司；
49.his60 ni superflow resin：10ml，普健生物(武汉)科技有限公司；
50.tbs缓冲液：含20mmol/l tris-hcl缓冲液，150mmol/l nacl，ph＝7.5；
51.tbst缓冲液：含上述tbs缓冲液和0.05v/v％tween20，另有规定的除外；
52.pbs缓冲液：8g/l nacl，0.2g/l kcl，1.44g/l na2hpo4，0.24g/l kh2po4，ph＝7.4；
53.大肠杆菌er2738：new england biolab,ph.d.-12
tm
；
54.hrp标记的小鼠抗m13噬菌体mab：new england biolab；
55.羊抗鼠igg-hrp：abcam；
56.ripa裂解液：碧云天生物技术有限公司，p0013；
57.2x载样缓冲液：碧云天生物技术有限公司，商品编号p0015b；
58.peg-8000/nacl：含20w/v％peg-8000，2.5mol/l nacl。
59.实施例1
60.本发明提供的人肠道病毒71型vp1蛋白特异性结合多肽的制备方法，包括以下步骤：
61.s1、ev71病毒vp1蛋白的表达与纯化
62.s1-1、ev71病毒vp1蛋白的核苷酸序列扩增
63.合成ev71病毒vp1蛋白的cdna(核苷酸序列如seq id no.3所示)，经pcr扩增后得到编码vp1蛋白的dna片段，再将该dna片连接至pfastbac1载体中，得到重组载体vp1-pfastbac1；为了便于纯化，在vp1蛋白氨基酸序列的c端加入了his-tag；这一过程由普健生物(武汉)科技有限公司完成；
64.s1-2、将所述重组载体vp1-pfastbac1转化到大肠杆菌dh10bac中，得到表达vp1蛋
白的杆状病毒穿梭载体，选择2个穿梭载体转染sf9细胞产生一代病毒p1；
65.s1-3、收集s1-2中经过感染的细胞以1000rpm的速度离心5min，分别收集细胞培养上清和细胞沉淀，加入ripa裂解液重悬细胞沉淀，反复吹打裂解细胞，以1200rpm速度离心10min，分别收集细胞裂解上清和细胞裂解沉淀；分别取30μl细胞培养上清、细胞裂解上清和经过tbs缓冲液重悬的细胞裂解沉淀加入30μl 2x载样缓冲液混匀。沸水中煮5min，12000rpm离心5min，取10μl上清加样于10w/v％分离胶和6w/v％浓缩胶，上样后电压为90v约20min，待样品进入分离胶后将电压升至110v约1.5h，用0.5w/v％考马斯亮蓝r-250染色2h，脱色至背景清晰后制备干胶保存；sds-page结束后，拆下凝胶，按照bio-rad产品说明，将凝胶靠近阴极一侧，硝酸纤维(nc)膜靠近阳极一侧，在预冷的转移缓冲液(25mmol/l tris，192mmol/l glycine，20v/v％甲醇)中100v恒压1小时电泳，将蛋白转移至nc膜上；电泳结束后，取出nc膜，用tbst缓冲液(含ph＝7.5的20mmol/l tris-hcl缓冲液，150mmol/l nacl，0.05v/v％tween20)清洗后浸入封闭液(含2w/v％bsa的tbst缓冲液)中于37℃保持1小时，室温下用tbst缓冲液洗3次，每次5min，分别加入鼠抗his单克隆抗体(tbs缓冲液稀释，终浓度为0.1μg/ml)，37℃孵育1小时，用tbst缓冲液洗3次，加入羊抗鼠igg-hrp，37℃孵育1小时，用tbst缓冲液洗3次，再用tbs缓冲液(20mmol/l tris-hcl，150mmol/l nacl，ph＝7.5)洗3次，nc膜浸入显色液中，室温避光显色适当时间，蒸馏水冲洗终止反应，鉴定结果如图1所示；图1中，左图为sds-page凝胶电泳结果图，右图为western blot鉴定结果图；medium表示细胞培养液，npe表示sf9细胞的裂解上清，dpe表示sf9细胞的裂解沉淀，mw表示蛋白质分子量marker，表示阴性对照，1表示1号克隆，2表示2号克隆；+表示阳性对照(其它带有his标签的蛋白)。从图1中可以看出，2号克隆的裂解上清中存在大量vp1蛋白；
66.s1-4、用感染复数(moi)分别为1、5和10的p1病毒储液感染sf9细胞确定最佳感染复数moi为1，以此moi感染sf9细胞，于28℃培养24小时，获得第二代病毒p2；
67.s1-5、用his60 ni superflow resin对vp1进行纯化：收集s1-4中经过感染的细胞，1000rpm离心5min后，收集细胞沉淀，ripa裂解液重悬细胞沉淀，反复吹打裂解细胞，1200rpm离心10min后，收集细胞裂解上清，将柱子和上清充分结合后孵育2h；用20倍柱体积的平衡缓冲液(ph＝7.5的pbs缓冲液)洗去未吸附的样品，流速为1～2ml/min，直到流出液点样考马斯亮蓝g250显示无蓝色时开始洗脱柱子上吸附的蛋白；依次用含有30mmol/l、50mmol/l、200mmol/l、300mmol/l咪唑的pbs缓冲液分阶段洗脱柱子，洗脱5～10个柱体积左右，收集各浓度梯度洗脱下来的蛋白，对洗脱液进行sds-page(分离胶浓度为10w/v％，浓缩胶浓度为6w/v％)分析，结果如图2所示；图2中，mw表示蛋白质分子量marker；in代表上样样品，ft代表穿过峰，w1～w3分别表示收集的1～3号洗涤液，e1～e9分别表示收集的1～9号洗脱液。从图2中可以看出，在收集的3～9号洗脱液中，均出现了纯度较好的vp1蛋白；
68.s1-6、对纯化后的vp1蛋白进行western blot鉴定
69.步骤s1-5中sds-page结束后，拆下凝胶，按照bio-rad公司的产品说明，将凝胶靠近阴极一侧、硝酸纤维(nc)膜靠近阳极一侧，在预冷的转移缓冲液(含25mmol/l tris，192mmol/l glycine，20v/v％甲醇)中100v恒压1小时电泳，将蛋白转移至nc膜上；电泳结束后，取出nc膜，用tbst缓冲液(含20mmol/l tris-hcl，150mmol/l nacl，0.05v/v％tween20，ph＝7.5)清洗后浸入封闭液(含2w/v％bsa的tbst洗涤液)中于37℃保持1小时，室温下用tbst缓冲液洗3次，每次5min，分别加入鼠抗his单克隆抗体(tbs稀释，终浓度为0.1μg/ml)，
37℃孵育1小时，再用tbst缓冲液洗3次，加入羊抗鼠igg-ap，37℃孵育1小时，继续用tbst缓冲液洗3次，再用tbs缓冲液(含20mmol/l tris-hcl，150mmol/l nacl，ph＝7.5)洗3次，nc膜浸入显色液中，室温避光显色适当时间，蒸馏水冲洗终止反应；鉴定结果如图3所示，图3中mw表示蛋白质分子量marker，2μg表示上样量；从图3中可以看出，vp1蛋白得到了较好的纯化。该vp1蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。
70.s2、生物淘洗
71.s2-1、在96孔板的2个孔中分别加入200μl用0.1mol/l的nahco3(ph＝8.6)稀释的vp1-his蛋白溶液和gst-his蛋白溶液，蛋白浓度均为100μg/ml；置于湿盒中轻轻摇动，4℃孵育过夜；预先接种10ml(测滴度用)大肠杆菌er2738菌种于含四环素的20ml(扩增噬菌体用)的lb培养基(主要成分包含：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l)中，37℃培养；将96孔板取出，倾去液体，并将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体；加入200μl含1w/v％bsa的tbs缓冲液，4℃孵育2h；用tbst缓冲液(tbs+0.1v/v％tween)洗涤6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体；
72.s2-2、将200μl用tbst缓冲液稀释的含2x10
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pfu噬菌体(new england biolab,ph.d.-12
tm
噬菌体展示肽库)的溶液加入到已封闭好的gst-his包被孔进行预吸附，室温孵育1h；将经过预吸附的液体吸出转移入封闭好的vp1-his包被孔进行结合，室温孵育1h；倾去液体去除未结合的噬菌体，用tbst缓冲液洗涤10次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体；用100μl洗脱液(0.2mol/l glycine-hcl，10g/l bsa，ph＝2.2)洗脱结合的噬菌体，并迅速加入中和液(1mol/l tris-hcl，ph＝9.1)中和，得到洗脱的噬菌体溶液；
73.s2-3、取1μl步骤s2-2中得到的洗脱的噬菌体溶液测滴度，剩余的洗脱的噬菌体溶液加入20ml处于od＝0.2～0.3的er2738培养物中，于37℃剧烈振荡培养4.5h，进行扩增；将扩增好的噬菌体和大肠杆菌er2378的混合液倒入离心管，于4℃下以10000rpm的速度离心10min；将离心上清转入新的离心管，同法再离心一次，取80v/v％的离心上清加入新的离心管；在离心管中加入1/6上清体积的peg8000/nacl，于4℃静置过夜；
74.s2-4、次日取出步骤s2-3中peg8000/nacl沉淀好的液体，于4℃下以10000rpm的速度离心15min，小心倾去离心上清；再同法快速离心一下，用微量移液器吸尽残留上清；用1ml tbs缓冲液重悬离心沉淀，将重悬液转入小离心管中，于4℃下以10000rpm速度离心5min，以将残留的细胞沉淀下来；将离心上清移入新的小离心管中，加入1/6上清体积的peg8000/nacl冰浴1h；在4℃下以10000rpm的速度离心15min，小心倾去离心上清，再同法快速离心一下，用微量移液器吸尽残留上清；用200μl含0.01w/v％nan3的tbs缓冲液重悬沉淀，10000rpm离心1min以沉淀不能溶解的物质；将上清移入新的离心管，即为扩增好的洗脱液，取1μl洗脱液用于测滴度，余下的液体于4℃存放；
75.s2-5、分别用200μl vp1-his蛋白溶液和200μl gst-his蛋白溶液新包被96孔板各一孔，按照步骤s2-1～s2-4中的方法进行第二轮和第三轮筛选，为了提高筛选肽的严谨性，第二轮和第三轮筛选中，gst-his蛋白的浓度与第一轮筛选一样，vp1-his蛋白的浓度分别降至50mg/l和20mg/l，并将tbst缓冲液中tween的浓度提高至0.5v/v％；
76.s2-6、第三轮生物淘洗后的洗脱产物不需进行扩增，取1μl洗脱产物进行滴度测定，剩余洗脱产物存放于4℃环境中；从滴度测定中菌斑数小于100的平板上随机挑取50个
分隔良好的噬菌斑用于后续扩增和纯化，此时应注意挑取的噬菌斑培养的时间不能超过18h。
77.s3、阳性噬菌体的扩增
78.s3-1、将大肠杆菌er2738的过夜培养物用lb培养液按体积比1:100稀释，按1ml/管分装于50个50ml的培养管中；
79.s3-2、用无菌牙签蘸取步骤s2-6中得到的50个分隔良好的蓝色噬菌斑分别放入上述培养管中，37℃剧烈振荡培养4.5h，进行扩增；
80.s3-3、将步骤s3-2中扩增好的噬菌体培养液体倒入离心管，瞬间离心30s；将离心上清转入新的离心管，同法再离心一次，取80v/v％的上清，即为扩增的阳性噬菌体；扩增的阳性噬菌体置于4℃下可存放几周，若要长时间保存，可加入终浓度为50v/v％的无菌甘油存放于-20℃。
81.s4、噬菌体呈现肽的序列测定
82.s4-1、噬菌体单链dna序列测定
83.取步骤s3中扩增的50个噬菌体上清各10μl交由苏州金唯智生物科技有限公司进行dna测序；
84.s4-2、噬菌体呈现肽的氨基酸序列推导及氨基酸同源性分析
85.根据dna测序结果，推导出每个噬菌体呈现肽的氨基酸序列，比较50个不同克隆之间的氨基酸序列；结果显示50个噬菌体克隆一共呈现了12种多肽序列，并且这12种多肽序列与已知的蛋白质或多肽序列均无同源性，为新发现的多肽序列。
86.s5、噬菌体elisa鉴定
87.s5-1、以100mg/l vp1-his蛋白溶液包被96孔酶联板3孔，每孔200μl，同时对每个vp1-his包被孔设立100mg/l gst-his和1w/v％bsa的包被孔作为阴性对照，4℃孵育过夜；
88.s5-2、倾去包被液，加入封闭液(含5mg/l bsa，0.1mol/l nahco3，ph＝8.6)，4℃封闭2h；倾去封闭液，用tbst缓冲液洗6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体；
89.s5-3、根据步骤s4中序列分析结果，将12个纯化的阳性噬菌体分别加入对应的孔中，每种噬菌体分布加入3个vp1-his、3个gst-his和3个bsa包被孔中(1
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109pfu/孔)室温孵育2h；用tbst缓冲液洗6次，每孔加入100μl hrp标记的小鼠抗m13噬菌体mab(tbst稀释，终浓度为1μg/ml)，室温孵育1h；用tbst缓冲液洗6次，用opd(邻苯二胺)显色后测定490nm处的吸光值，结果如图4所示；从图4中可以看出，筛选出的多肽对ev71病毒vp1蛋白具有高度的特异性，能够识别和结合ev71病毒vp1蛋白；该多肽的氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.2所示。
90.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。对于任何熟悉本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。任何依据本发明申请保护范围及说明书内容所作的简单的等效变化和修饰，均应包含在本发明的保护范围之内。