一种缺陷型丝状病毒的制备方法及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种缺陷型丝状病毒的制备方法及其应用。

背景技术：

1、丝状病毒科(学名：filoviridae)，单股反链rna病毒目，是一类感染脊椎动物的病毒，感染哺乳动物的丝状病毒有埃博拉病毒属、马尔堡病毒属、奎瓦病毒属和滇丝病毒属。病毒颗粒(virion)具有复杂构造，具囊膜(envelope)、核衣壳(nucleocapsid)、聚合酶复合体和基质蛋白质(matrix)。病毒颗粒外层有囊膜结构。病毒的外形呈丝状，或具分支多形态，或u形、6形或圆形(特别在纯化后)，病毒的直径约80nm，可达14000nm长，纯化出的病毒长度可能达790-970nm。表面有瘤状突起的形状，散布在脂质双层膜中。

2、丝状病毒科中的埃博拉病毒(ebov)是一种致命病毒，感染后可引起人类和非人类灵长类动物的出血热疾病。已确定埃博拉病毒包含6个种，即扎伊尔病毒(ebola virus)、苏丹病毒(sudan virus)、莱斯顿病毒(reston virus)、本迪布焦病毒(bundibugyo virus)、塔伊森林病毒(forest virus)和邦巴利病毒(bombali virus)。不同种具有不同的特性，其中最为危险的是扎伊尔型埃博拉病，有高达90％的致死率，在流行地区死亡率1976年为88％、1977年为100％、1994年为59％、1995年为81％、1996年为73％、2001年至2002年为80％，2003年则是90％，2007年平均为83％。

3、目前，还没有批准用于对抗埃博拉病毒的抗病毒药物，这使得在开展埃博拉病毒相关研究工作必须在生物安全4级(bsl-4)实验室中开展，受限于高等级生物安全实验室的有限资源，埃博拉病毒相关病毒生物学研究和治疗药物研发的进展艰难。

4、因此，为了绕过这个障碍，本领域急需发明一种新型埃博拉病毒研究模型，可在低等级生物安全实验室内开展病毒生物学及抗病毒治疗技术的研究。

技术实现思路

1、本发明的目的就是提供一种缺陷型重组丝状病毒的制备方法及其应用，例如广泛用于抗病毒药物研发、病毒学研究和疫苗开发等多方面。

2、在本发明的第一方面，提供了一种缺陷型重组丝状病毒，所述缺陷型重组丝状病毒的基因组中一种或多种关键病毒蛋白的编码序列被替换为重组酶编码序列，

3、其中所述关键病毒蛋白选自下组：gp蛋白、vp40蛋白、vp24蛋白，或其组合；所述重组酶选自下组：cre重组酶、flp重组酶、dre重组酶，或其组合。

4、在另一优选例中，所述缺陷型重组丝状病毒包括但不限于：埃博拉病毒、马堡病毒。

5、在另一优选例中，所述缺陷型重组丝状病毒与野生型丝状病毒的相似度≥90％，较佳地≥95％。

6、在另一优选例中，所述缺陷型重组丝状病毒的抗原特征与野生型丝状病毒完全一致。

7、在另一优选例中，所述缺陷型重组丝状病毒从3'端至5'端的基因组结构如式i所示：

8、z1-z2-z3-z4-z5-z6-z7-z8 (i)

9、式中，

10、各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

11、z1为丝状病毒np蛋白的编码序列；

12、z2为丝状病毒vp35蛋白的编码序列；

13、z3为丝状病毒vp40蛋白的编码序列vp40或重组酶编码序列；

14、z4为丝状病毒gp蛋白的编码序列gp或重组酶编码序列；

15、z5为丝状病毒vp30蛋白的编码序列；

16、z6为丝状病毒vp24蛋白的编码序列vp24或重组酶编码序列；

17、z7为丝状病毒l蛋白的编码序列；

18、z8为无或转录辅助序列；

19、并且，z3、z4、z6中至少一个为重组酶编码序列。

20、在另一优选例中，所述重组酶编码序列选自下组：cre重组酶编码序列cre、flp重组酶编码序列flp、dre重组酶编码序列dre，或其组合。

21、在另一优选例中，所述重组酶编码序列为cre重组酶编码序列cre。

22、在另一优选例中，所述转录辅助序列选自下组：hdv核酶序列、d-氨基葡萄糖6-磷酸核糖开关核酶(glucosamine-6-phosphate riboswitch ribozyme)序列(glms核酶序列)、锤头状核酶(hammerhead ribozyme)序列、发夹状(hairpin)核酶序列、varkud卫星(vs)核酶序列，或其组合。

23、在另一优选例中，所述z8为hdv核酶序列。

24、在另一优选例中，所述基因组结构为：z1-z2-vp40-cre-z5-vp24-z7-z8。

25、在另一优选例中，所述基因组结构为：z1-z2-cre-gp-z5-vp24-z7-z8。

26、在另一优选例中，所述基因组结构为：z1-z2-vp40-gp-z5-cre-z7-z8。

27、在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码如本发明第一方面所述的缺陷型重组丝状病毒。

28、在另一优选例中，所述多核苷酸可为dna、rna或cdna。

29、在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：

30、(a)序列如seq id no:1所示的多核苷酸；

31、(b)核苷酸序列与seq id no:1所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；

32、(c)如seq id no:1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-99个(较佳地1-49个，更佳地1-9个)核苷酸的多核苷酸；和

33、(d)与(a)-(c)中任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸；和

34、在另一优选例中，所述多核苷酸具有如式i所示的结构：

35、z1-z2-z3-z4-z5-z6-z7-z8 (i)

36、式中，

37、各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

38、z1～z8如上所述；

39、并且，z3、z4、z6中至少一个为重组酶编码序列。

40、在另一优选例中，所述重组酶编码序列为如seq id no:5所示的序列。

41、在另一优选例中，所述z1为如seq id no:2所示的序列。

42、在另一优选例中，所述z2为如seq id no:3所示的序列。

43、在另一优选例中，所述z3为如seq id no:4所示的序列。

44、在另一优选例中，所述z4为如seq id no:5所示的序列。

45、在另一优选例中，所述z5为如seq id no:6所示的序列。

46、在另一优选例中，所述z6为如seq id no:7所示的序列。

47、在另一优选例中，所述z7为如seq id no:8所示的序列。

48、在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体包含如本发明第二方面所述的多核苷酸。

49、在另一优选例中，所述的载体选自下组：dna、rna、病毒载体、质粒载体、转座子、其他基因转移系统、或其组合。优选地，所述载体为质粒。

50、在另一优选例中，所述病毒载体包括但不限于：慢病毒、腺病毒、aav病毒、逆转录病毒、或其组合。

51、在另一优选例中，所述质粒载体包括但不限于：细菌人工染色体载体(bacvector)、酵母人工染色体(yac)载体、黏端质粒(cosmid)载体，或其组合。

52、在另一优选例中，所述载体为细菌人工染色体载体。

53、在另一优选例中，所述载体包括：启动子元件、终止子元件，或其组合。

54、在另一优选例中，所述启动子元件包括但不限于：人聚合酶i启动子、小鼠聚合酶i启动子，或其组合。

55、在另一优选例中，所述启动子元件为人聚合酶i启动子。

56、在另一优选例中，所述终止子元件包括但不限于：小鼠聚合酶i终止子、人聚合酶i终止子，或其组合。

57、在另一优选例中，所述终止子元件为人聚合酶i终止子。

58、在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第三方面所述的载体，或其基因组中整合有如本发明第二方面所述的多核苷酸。

59、在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

60、在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。

61、在另一优选例中，所述的宿主细胞为hek293细胞。

62、在本发明的第五方面，提供了一种组合物，所述组合物包括：

63、(a)如本发明第三方面所述的载体，其中所述载体中关键病毒蛋白的编码序列被替换为重组酶编码序列；和

64、(b)调控表达载体，其中所述调控表达载体受到(a)中所述重组酶的表达的调控，在合适的条件下表达(a)中所述的关键病毒蛋白。

65、在另一优选例中，所述组合物还包括：

66、(c)其他病毒蛋白表达载体。

67、在另一优选例中，(b)中所述调控表达载体为pdio-gp质粒。

68、在另一优选例中，所述调控表达载体具有如式ii所示的结构：

69、x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7-x8 (ii)

70、式中，

71、各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

72、x1为无或启动子；

73、x2、x7为重组酶的特异性识别位点；

74、x3为无或抗性基因；

75、x4为关键病毒蛋白的编码序列；

76、x5为剪切肽；

77、x6为报告基因；

78、x8为poly a信号肽；

79、并且，x2与x7的方向相反。

80、在另一优选例中，所述x1为cmv启动子。

81、在另一优选例中，所述特异性识别位点选自下组：cre重组酶识别的lox位点、flp重组酶识别的frt位点、dre重组酶识别的rox位点，或其组合。

82、在另一优选例中，所述lox位点选自下组：loxp位点、loxn位点、lox2272位点、lox5171位点，或其组合。

83、在另一优选例中，所述x2为loxp位点和loxn位点。

84、在另一优选例中，所述x7为loxp位点和loxn位点。

85、在另一优选例中，所述x3位于两个特异性识别位点中间。

86、在另一优选例中，所述x3包括但不限于：博莱霉素(zeocin)抗性基因、新霉素(neomycin)抗性基因、杀稻瘟菌素(blasticidin s)抗性基因、嘌呤霉素(puromycin)抗性基因、潮霉素b(hygromycinb)抗性基因，或其组合。

87、在另一优选例中，所述x3为博莱霉素(zeocin)抗性基因。

88、在另一优选例中，所述x4选自下组：gp蛋白的编码序列、vp40蛋白的编码序列、vp24蛋白的编码序列，或其组合。

89、在另一优选例中，所述x4为gp蛋白的编码序列。

90、在另一优选例中，所述x5为p2a或t2a。

91、在另一优选例中，所述x6包括但不限于：荧光蛋白基因、荧光素酶(luciferase)基因、荧光素酶类似蛋白(nanoluciferase)编码基因、lacz基因、分泌型碱性磷酸酶(seap)基因、氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase)基因，或其组合。

92、在另一优选例中，所述荧光蛋白基因包括但不限于：gfp基因、rfp基因、bfp基因、yfp基因、cfp基因。

93、在另一优选例中，所述x6为萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白(fluc:gfp)融合蛋白基因。

94、在另一优选例中，所述其他病毒蛋白表达载体选自下组：np蛋白表达载体、vp35蛋白表达载体、vp30蛋白表达载体、l蛋白表达载体，或其组合。

95、在另一优选例中，所述其他病毒蛋白表达载体具有如式iii所示的结构：

96、y1-y2-y3 (ii)

97、式中，

98、各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

99、y1为无或启动子；

100、y2选自下组：np蛋白的编码序列、vp35蛋白的编码序列、vp30蛋白的编码序列、l蛋白的编码序列，或其组合。

101、y3为poly a信号肽。

102、在本发明的第六方面，提供了一种缺陷型重组丝状病毒的制备方法，所述制备方法包括步骤：

103、(a)提供如本发明第三方面所述的载体，其中所述载体中关键病毒蛋白的编码序列被替换为重组酶编码序列；

104、(b)构建一调控表达载体，其中所述调控表达载体受到(a)中所述重组酶的表达的调控，在合适的条件下表达(a)中所述的关键病毒蛋白；

105、(c)将步骤(b)中所述的调控表达载体转导入一真核细胞中，从而获得互补细胞；

106、(d)任选地，构建其他病毒蛋白表达载体；和

107、(e)将步骤(a)中所述载体和任选地其他病毒蛋白表达载体转导入步骤(c)中获得的互补细胞中，从而获得所述缺陷型重组丝状病毒。

108、在另一优选例中，步骤(c)中所述的真核细胞为hek293细胞。

109、在另一优选例中，步骤(c)和步骤(e)中所述转导使用脂质体转染试剂。

110、在另一优选例中，步骤(c)中所述转导之后继续培养所述真核细胞48小时以获得所述互补细胞。

111、在另一优选例中，步骤(c)中所述互补细胞为hek293-loxgp。

112、在另一优选例中，步骤(e)中所述转导之后培养所述互补细胞96小时以收集所述缺陷型重组丝状病毒。

113、在另一优选例中，所述制备方法还包括：

114、(f)分离和/或纯化步骤(e)中获得的缺陷型重组丝状病毒；和/或

115、(g)扩大培养步骤(e)或(f)中获得的缺陷型重组丝状病毒。

116、在另一优选例中，步骤(f)中使用0.45μm滤器过滤。

117、在另一优选例中，步骤(g)中所述扩大培养是在所述互补细胞中进行的。

118、在本发明的第七方面，提供了一种如本发明第五方面所述的组合物的用途，用于制备如本发明第一方面所述的缺陷型重组丝状病毒。

119、在本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：

120、(i)灭活或减毒的如本发明第一方面所述的缺陷型重组丝状病毒；和

121、(ii)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

122、在另一优选例中，所述药物组合物包括疫苗组合物。

123、在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。

124、在另一优选例中，所述疫苗中包括0.01～99.99％的如本发明第一方面所述的缺陷型重组丝状病毒和0.01～99.99％的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。

125、在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：注射剂、冻干剂。

126、在另一优选例中，所述药物组合物还包括：

127、(iii)其他药物及其药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

128、在本发明的第九方面，提供了一种检测试剂，所述的检测试剂含有如本发明第一方面所述的缺陷型重组丝状病毒，并且所述的缺陷型重组丝状病毒偶联有可检测标记物。

129、在本发明的第十方面，提供了一种体外检测样品中丝状病毒抗体的方法，所述方法包括步骤：

130、(1)在体外，将所述样品与如本发明第一方面所述的缺陷型重组丝状病毒接触；和

131、(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在所述丝状病毒抗体。

132、在另一优选例中，所述的检测包括诊断性的或非诊断性的。

133、在本发明的第十一方面，提供了一种丝状病毒抗体的制备方法，所述制备方法包括步骤：将如本发明第一方面所述的缺陷型重组丝状病毒作为免疫原，免疫非人哺乳动物。

134、在另一优选例中，所述制备方法还包括步骤：将所述缺陷型重组丝状病毒与适当佐剂混合并乳化。

135、在另一优选例中，所述免疫可包括多次免疫。

136、在另一优选例中，所述免疫方式包括但不限于：肌肉注射、皮下注射、皮内注射、静脉注射、腹腔注射等。

137、在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括但不限于：小鼠、大鼠、兔子、羊驼等。

138、在本发明的第十二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的缺陷型重组丝状病毒的用途，用于丝状病毒的检测方法或试剂盒中的标准参比物质。

139、在本发明的第十三方面，提供了一种丝状病毒的检测试剂盒，所述试剂盒包括：

140、(i)如本发明第一方面所述的缺陷型重组丝状病毒，作为标准参比物质；

141、(ii)丝状病毒抗体；和

142、(iii)一说明书，所述说明书记载了定性和定量检测样品中丝状病毒的方法。

143、在另一优选例中，所述试剂盒还含有丝状病毒抗体的酶标二抗。

144、在另一优选例中，所述试剂盒还含有显色剂和终止剂。

145、在另一优选例中，所述试剂盒还含有样品稀释剂。

146、在本发明的第十四方面，提供了一种丝状病毒的体外检测方法，所述方法包括步骤：

147、(i)提供一待测样品，将所述待测样品、标准参比物质、空白对照与丝状病毒抗体接触，其中所述标准参比物质为如本发明第一方面所述的缺陷型重组丝状病毒；

148、(ii)加入所述丝状病毒抗体的酶标二抗，与底物反应显色后终止反应；和

149、(iii)测定所述待测样品的检测值a2、标准参比物质的检测值a1和空白对照的检测值a0，

150、若a1≥2a0，则判定本次检测的结果有效；

151、若a1＜2a0，则判定本次检测的结果无效；

152、若a2≥2a1，则判定所述待测样品为强阳性，表明待测样品中含有大量所述丝状病毒；

153、若0.5a1＜a2＜2a1，则判定所述待测样品为弱阳性，表明待测样品中含有少量所述丝状病毒；

154、若a2≤0.5a1时，则判定所述待测样品为阴性，表明待测样品中不含有或基本不含有所述丝状病毒。

155、在另一优选例中，步骤(i)中所述丝状病毒抗体被包被于酶标板上。

156、在另一优选例中，步骤(iii)中所述测定通过酶标仪进行。

157、在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

158、(iv)使用不同稀释度的待测样品的检测值绘制标准曲线，并对待测样品中所述丝状病毒的含量进行定量判定。

159、在本发明的第十五方面，提供了一种抗丝状病毒药物发现及评价的方法，所述方法包括步骤：

160、(a)提供一待检药物与滴度为e0的如本发明第一方面所述的缺陷型重组丝状病毒，将所述待检药物与所述缺陷型重组丝状病毒接触；和

161、(b)检测与所述待检药物接触之后的缺陷型重组丝状病毒滴度e1，

162、若e1≥1e0，则判定所述待检药物不具有抗丝状病毒活性或其活性太弱不足以作为抗丝状病毒药物。

163、若e1≤0.8e0，则判定所述待检药物具有抗丝状病毒活性。

164、在另一优选例中，若0.2e0＜e1≤0.5e0，则判定所述待检药物具有一般抗丝状病毒活性。

165、在另一优选例中，若0.1e0＜e1≤0.2e0，则判定所述待检药物具有较强抗丝状病毒活性。

166、在另一优选例中，若e1≤0.1e0时，则判定所述待检药物具有强抗丝状病毒活性。

167、在另一优选例中，所述方法可包括将多种待检药物的检测值进行比较以评价不同待检药物的效果。

168、在本发明的第十六方面，提供了一种如本发明第一方面所述的缺陷型重组丝状病毒的用途，所述缺陷型重组丝状病毒用于：

169、(a)批量制备丝状病毒颗粒；

170、(b)丝状病毒-宿主相互作用研究；和/或

171、(c)建立转基因互补动物模型。

172、在另一优选例中，所述丝状病毒-宿主相互作用研究包括但不限于：模拟丝状病毒感染后导致的宿主细胞的相关免疫反应、研究体内丝状病毒对靶器官的亲嗜性等。

173、在另一优选例中，所述转基因互补动物模型适用的研究包括但不限于：研究体内发病机制、测试抗丝状病毒药物或疫苗的功效等。

174、在本发明的第十七方面，提供了一种如本发明第八方面所述的药物组合物或如本发明第一方面所述的缺陷型重组丝状病毒的用途，其被用于制备一药物，所述药物用于预防和/或治疗丝状病毒感染相关疾病。

175、在另一优选例中，所述丝状病毒感染相关疾病包括但不限于：恶心、呕吐、抽筋、发烧、晕眩、疲倦、虚弱、咽喉痛、腹泻、腹痛、胸痛、全身皮疹、肤色改变、头痛、全身酸痛、体内出血、体外出血、血液凝固、出血热、肝衰竭、中风、心肌梗塞、低血容量休克、多发性器官衰竭、死亡等。

176、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。