一种恒温扩增试剂常温保存方法与流程

1.本发明涉及扩增试剂技术领域，具体为一种恒温扩增试剂常温保存方法。


背景技术：

2.pcr核酸检测技术现已被广泛用于疾病检测，基因检测, 病毒和病原菌检测、食品及环境检测等各个领域。传统 pcr检测试剂一般需要-20℃左右储存和运输，以确保试剂有效成分的生物活性。不仅成本高，而且环境温度的变化造成试剂反复冻融会直接影响检测试剂的性能和保质期。对液体试剂进行干燥后可常温运输和储存，能很好地解决冷链运输的问题，并且干燥型试剂的优势还包括，更长的保质期，以及更灵活的加样量从而更高的检测灵敏度。
3.然而，目前对于核酸检测试剂干燥工艺的研究较少，对于核酸检测试剂冻干工艺的研究还不完善，国外仅少数几家公司实现了核酸检测冻干试剂的商品化应用，在国内该领域更是基本属于空白状态，这大大限制了核酸poct检测技术的发展。因此，亟需发明核酸扩增试剂的常温保存方法。
4.此外，大多数核酸检测试剂盒中，核酸扩增试剂各组分往往独立保存，使用前按照相应的需求配制混合，而在临床应用中，为了简化操作步骤，避免操作误差、交叉污染等，往往是配制成预混液进行保存和使用。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种恒温扩增试剂常温保存方法，以解决上述过程中所提到的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种恒温扩增试剂常温保存方法，包括以下操作步骤：步骤一：制备反应混合液；准备酶混合物、抗体、引物、探针、聚乙二醇8000、dntp、4-羟基邻苯二甲酸，随后使得酶混合物、抗体、引物、探针、聚乙二醇8000、dntp、4-羟基邻苯二甲酸之间均进行混合，可制备出反应混合液；步骤二：制备缓冲液；准备4mm氯化镁、50mm氯化钾、20mm三羟甲基氨基甲烷，随后使得4mm氯化镁、50mm氯化钾、20mm三羟甲基氨基甲烷之间混合，可制备出缓冲液；步骤三：加工反应混合液；采用膜上加液装置，把步骤一制备的反应混合液加入到玻璃纤维膜上，使得反应混合液浸入在玻璃纤维膜上；步骤四：切块；把步骤三中制备的玻璃纤维膜送入到烘干设备当中，至于42℃烘干的模式下，对玻璃纤维膜进行烘干，随后把烘干后的玻璃纤维膜进行切块，块的大小固定，进一步的把切块的玻璃纤维膜装入pcr管中，并进行密封，常温保存。
7.优选的，所述步骤一中引物浓度优选为1μmol/l、探针浓度优选为0.5μmol/l，聚乙二醇8000浓度优选为2%，dntp浓度优选为1mm，4-羟基邻苯二甲酸浓度优选为0.01%，所述反应混合液ph值为7.5，酶混合物由2u逆转录酶、0.5u dna重组酶、0.5u dna聚合酶、0.25u单
链dna结合蛋白组成，所述抗体由0.1mg/ml逆转录酶抗体、0.1mg/ml dna聚合酶抗体组成。
8.优选的，所述步骤二中缓冲液ph值为8.7。
9.优选的，所述膜上加液装置包括有安置底座、中部贯穿转轴、两翼动力齿轮、往复错开块、上端输送架、下压辊、定位连接框、反应混合液储存筒、筒上穿轴与间歇供液杆，其中中部贯穿转轴贯穿安置底座的中部位置布置，所述两翼动力齿轮对称套在中部贯穿转轴的两端，其中往复错开块均匀固定在两翼动力齿轮的一端，所述上端输送架处于安置底座的上端，其中下压辊固定在上端输送架的上端一侧，所述定位连接框对称固定在上端输送架的中部两侧，其中反应混合液储存筒固定在两个所述定位连接框之间，所述筒上穿轴贯穿反应混合液储存筒的下端布置，其中间歇供液杆处于反应混合液储存筒的内部下侧。
10.优选的，所述安置底座与中部贯穿转轴之间通过转轴进行连接，其中两翼动力齿轮处于上端输送架的下端，所述两翼动力齿轮与中部贯穿转轴之间采用螺钉连接，其中两个两翼动力齿轮上的往复错开块之间相互错开布置，所述往复错开块为半球块，其中反应混合液储存筒的两端分别与两个定位连接框之间进行螺钉连接，所述筒上穿轴与反应混合液储存筒之间通过转轴连接，其中筒上穿轴的两端分别插入两个定位连接框的内部，所述筒上穿轴与间歇供液杆之间进行卡扣固定连接。
11.优选的，所述上端输送架的中部下侧对称布置固定连接的底部拉距杆，其中底部拉距杆布置的形状为l形，所述底部拉距杆的下端一侧布置固定连接的被顶动块，其中被顶动块处于同侧的两翼动力齿轮的一侧，所述上端输送架的框架内均匀布置活动连接的输送辊，其中一个输送辊的两端对称布置固定连接的联动侧柱，所述联动侧柱贯穿上端输送架布置，其中联动侧柱的一端套有固定连接的随动齿轮，所述随动齿轮与两翼动力齿轮之间啮合布置，其中随动齿轮的外侧布置与联动侧柱固定连接的增距圆盘，所述增距圆盘的一端靠外部布置通过转轴连接的转动驱动杆，其中转动驱动杆的另一端通过转轴连接在筒上穿轴上，所述转动驱动杆的一端贯穿开设横向滑动槽。
12.优选的，所述反应混合液储存筒的下端中间位置贯穿布置固定连接的出液导向框，其中出液导向框处于间歇供液杆的下端，所述出液导向框的下端布置固定连接的聚液框，其中聚液框的下端中间位置贯穿开设出液口，所述聚液框处于输送辊的上方，其中聚液框的中部两侧对称贯穿开设指引滑槽，所述聚液框的内部下侧放置有分液板，其中分液板的上端两侧对称布置固定连接的覆槽板。
13.优选的，所述覆槽板在聚液框的内部对指引滑槽进行覆盖，其中覆槽板的一端下侧布置固定连接的穿槽板，其中穿槽板贯穿指引滑槽布置，所述穿槽板的一端贯穿布置上下插杆，其中上下插杆上套有复位弹簧，所述上下插杆的上端布置固定连接的顶盖板，其中顶盖板与出液导向框之间进行固定连接，所述穿槽板的另一端布置活动连接的调整杆，其中调整杆的另一端插入到横向滑动槽的内部。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果是：1、本发明能够提供恒温扩增试剂配制与干燥方法，解决了恒温扩增试剂无法常温保存的问题；本发明的恒温扩增试剂常温保存方法，用于核酸恒温检测中，使得恒温扩增试剂能够实现常温长期保存，降恒温扩增试剂的运输储存成本，同时为核酸poct检测提供可靠的技术手段；2、本发明把反应混合液采用间歇式供料的方式，使其均匀分布在玻璃纤维膜上，
并且在分布过程中，可以使得玻璃纤维膜往复晃动，这样不仅可以保证反应混合液的均匀覆盖率，还可以缩短反应混合液浸入玻璃纤维膜内部的时间。
附图说明
15.图1为本发明立体示意图；图2为本发明上端输送架半剖立体示意图；图3为本发明上端输送架半剖右视示意图；图4为本发明反应混合液储存筒半剖立体示意图；图5为本发明输送辊立体示意图；图6为本发明反应混合液储存筒半剖前视示意图；图7为本发明图4中的a处放大示意图。
16.图中：安置底座1、中部贯穿转轴11、两翼动力齿轮12、往复错开块13、上端输送架14、下压辊15、底部拉距杆1401、被顶动块1402、输送辊1403、联动侧柱1404、随动齿轮1405、增距圆盘1406、转动驱动杆1407、横向滑动槽1408、定位连接框16、反应混合液储存筒17、出液导向框1701、聚液框1702、出液口1703、指引滑槽1704、分液板1705、覆槽板1706、穿槽板1707、上下插杆1708、复位弹簧1709、顶盖板1710、调整杆1711、筒上穿轴18、间歇供液杆19。
具体实施方式
17.下面将详细描述本发明的各个方面的特征和示例性实施例。在下面的详细描述中，提出了许多具体细节，以便提供对本发明的全面理解。但是，对于本领域技术人员来说很明显的是，本发明可以在不需要这些具体细节中的一些细节的情况下实施。下面对实施例的描述仅仅是为了通过示出本发明的示例来提供对本发明的更好的理解。本发明决不限于下面所提出的任何具体配置和算法，而是在不脱离本发明的精神的前提下覆盖了元素、部件和算法的任何修改、替换和改进。在附图和下面的描述中，没有示出公知的结构和技术，以便避免对本发明造成不必要的模糊。
18.请参阅图1至图7，本发明提供一种技术方案：包括以下操作步骤：步骤一：制备反应混合液；准备酶混合物、抗体、引物、探针、聚乙二醇8000、dntp、4-羟基邻苯二甲酸，随后使得酶混合物、抗体、引物、探针、聚乙二醇8000、dntp、4-羟基邻苯二甲酸之间均进行混合，可制备出反应混合液；步骤二：制备缓冲液；准备4mm氯化镁、50mm氯化钾、20mm三羟甲基氨基甲烷，随后使得4mm氯化镁、50mm氯化钾、20mm三羟甲基氨基甲烷之间混合，可制备出缓冲液；步骤三：加工反应混合液；采用膜上加液装置，把步骤一制备的反应混合液加入到玻璃纤维膜上，使得反应混合液浸入在玻璃纤维膜上；步骤四：切块；把步骤三中制备的玻璃纤维膜送入到烘干设备当中，至于42℃烘干的模式下，对玻璃纤维膜进行烘干，随后把烘干后的玻璃纤维膜进行切块，块的大小固定，进一步的把切块的玻璃纤维膜装入pcr管中，并进行密封，常温保存。
19.反应混合液得到充分的干燥以除去多余的水分，但又没有因为过度干燥而影响酶的性能。经过大量测试，本发明方法保证了酶的稳定性，并且可以被快速复溶和激活。烘干后的试剂反应性能和液体试剂保持一致的性能，且常温下可储存至少18个月。
20.步骤一中引物浓度优选为1μmol/l、探针浓度优选为0.5μmol/l，聚乙二醇8000浓度优选为2%，在干燥过程中，聚乙二醇8000可以封闭玻璃纤维膜的非特异性位点，防止酶非特异吸附在玻璃纤维膜上造成活性下降，dntp浓度优选为1mm，4-羟基邻苯二甲酸浓度优选为0.01%，4-羟基邻苯二甲酸可以螯合二价金属离子，提高酶混合物的稳定性，同时避免环境中的水解酶对酶混合物的水解。进一步，4-羟基邻苯二甲酸还具有防腐的作用，防止反应混合液在保存过程中出现微生物污染，进一步提高反应混合液的长期稳定性，反应混合液ph值为7.5。
21.酶混合物由2u逆转录酶、0.5u dna重组酶、0.5u dna聚合酶、0.25u单链dna结合蛋白组成，发明人经过大量实验发现，由上述组分和浓度组成的酶混合物，在恒温扩增过程中具有高灵敏、高特异性的优点。
22.抗体由0.1mg/ml逆转录酶抗体、0.1mg/ml dna聚合酶抗体组成，在干燥过程中，抗体与逆转录酶和dna聚合酶结合，从而使酶在高温和脱水的情况下依然可以保持它的活性，同时可以增加酶的长期稳定性。此外，抗体与酶结合后，可以封闭酶的催化性能，避免在干燥过程中产生非特异扩增，同时在解离后恢复酶的生物活性。
23.步骤二中缓冲液ph值为8.7，可以进一步增加核酸扩增反应的灵敏度与特异性。
24.膜上加液装置包括有安置底座1、中部贯穿转轴11、两翼动力齿轮12、往复错开块13、上端输送架14、下压辊15、定位连接框16、反应混合液储存筒17、筒上穿轴18与间歇供液杆19，其中中部贯穿转轴11贯穿安置底座1的中部位置布置，两翼动力齿轮12对称套在中部贯穿转轴11的两端，其中往复错开块13均匀固定在两翼动力齿轮12的一端，上端输送架14处于安置底座1的上端，其中下压辊15固定在上端输送架14的上端一侧，定位连接框16对称固定在上端输送架14的中部两侧，其中反应混合液储存筒17固定在两个定位连接框16之间，筒上穿轴18贯穿反应混合液储存筒17的下端布置，其中间歇供液杆19处于反应混合液储存筒17的内部下侧。
25.反应混合液储存筒17的上端中间位置插入布置固定连接的加液管，经过加液管可以箱反应混合液储存筒17的内部加入反应混合液。
26.玻璃纤维膜铺设在上端输送架14上，上端输送架14上的输送辊1403可以对玻璃纤维膜进行位置输送，使得玻璃纤维膜经过出液口1703的下方。
27.安置底座1与上端输送架14之间进行可滑动连接。
28.安置底座1与中部贯穿转轴11之间通过转轴进行连接，其中两翼动力齿轮12处于上端输送架14的下端，两翼动力齿轮12与中部贯穿转轴11之间采用螺钉连接，其中两个两翼动力齿轮12上的往复错开块13之间相互错开布置，往复错开块13为半球块，其中反应混合液储存筒17的两端分别与两个定位连接框16之间进行螺钉连接，筒上穿轴18与反应混合液储存筒17之间通过转轴连接，其中筒上穿轴18的两端分别插入两个定位连接框16的内部，筒上穿轴18与间歇供液杆19之间进行卡扣固定连接。中部贯穿转轴11由电机进行带动转动。
29.上端输送架14的中部下侧对称布置固定连接的底部拉距杆1401，其中底部拉距杆1401布置的形状为l形，底部拉距杆1401的下端一侧布置固定连接的被顶动块1402，其中被顶动块1402处于同侧的两翼动力齿轮12的一侧，上端输送架14的框架内均匀布置活动连接的输送辊1403，其中一个输送辊1403的两端对称布置固定连接的联动侧柱1404，联动侧柱
1404贯穿上端输送架14布置，其中联动侧柱1404的一端套有固定连接的随动齿轮1405，随动齿轮1405与两翼动力齿轮12之间啮合布置，其中随动齿轮1405的外侧布置与联动侧柱1404固定连接的增距圆盘1406，增距圆盘1406的一端靠外部布置通过转轴连接的转动驱动杆1407，其中转动驱动杆1407的另一端通过转轴连接在筒上穿轴18上，转动驱动杆1407的一端贯穿开设横向滑动槽1408。
30.中部贯穿转轴11可以发生转动并带动两个两翼动力齿轮12进行转动，此时两翼动力齿轮12会通过随动齿轮1405进行转动，同时增距圆盘1406发生转动，进一步的增距圆盘1406在转动驱动杆1407的作用下，带动筒上穿轴18发生转动，进一步的间歇供液杆19发生转动，当间歇供液杆19不会对出液导向框1701覆盖时，反应混合液储存筒17内部的反应混合液可以经过出液导向框1701进入带聚液框1702的内部，此外在两翼动力齿轮12转动的转动，其中一个两翼动力齿轮12上的往复错开块13可以首先对被顶动块1402进行顶动，这样上端输送架14在安置底座1上向一侧偏移，在上端输送架14偏移的过程中，上端输送架14上的另一侧的被顶动块1402与另一个两翼动力齿轮12上的往复错开块13重叠，随后此两翼动力齿轮12上的被动块1402对上端输送架14顶动，这样往复使得上端输送架14摆动，使得反应混合液快速融合在玻璃纤维膜内。
31.反应混合液储存筒17的下端中间位置贯穿布置固定连接的出液导向框1701，其中出液导向框1701处于间歇供液杆19的下端，出液导向框1701的下端布置固定连接的聚液框1702，其中聚液框1702的下端中间位置贯穿开设出液口1703，聚液框1702处于输送辊1403的上方，其中聚液框1702的中部两侧对称贯穿开设指引滑槽1704，聚液框1702的内部下侧放置有分液板1705，其中分液板1705的上端两侧对称布置固定连接的覆槽板1706。
32.分液板1705可以为弧形或者v形，其中覆槽板1706会对指引滑槽1704密封，同时指引滑槽1704的下端向内倾斜布置。
33.覆槽板1706在聚液框1702的内部对指引滑槽1704进行覆盖，其中覆槽板1706的一端下侧布置固定连接的穿槽板1707，其中穿槽板1707贯穿指引滑槽1704布置，穿槽板1707的一端贯穿布置上下插杆1708，其中上下插杆1708上套有复位弹簧1709，上下插杆1708的上端布置固定连接的顶盖板1710，其中顶盖板1710与出液导向框1701之间进行固定连接，穿槽板1707的另一端布置活动连接的调整杆1711，其中调整杆1711的另一端插入到横向滑动槽1408的内部。调整杆1711与穿槽板1707之间通过转轴连接。
34.在转动驱动杆1407向上驱动带动间歇供料杆19转动的过程中，转动驱动杆1407会借助横向滑动槽1408，对调整杆1711向上推动，随后穿槽板1707会在指引滑槽1704的内部向上滑动，进一步的分液板1705向上移动，反应混合液在分液板1705的作用下，分液并经过出液口1703，落在玻璃纤维膜上，进一步的当转动驱动杆1407下时，间歇供液杆19重新对出液导向框1701进行覆盖。
35.实施例一1、酶混合物制备：在一离心管中按照以下浓度配制酶混合物：2u逆转录酶、0.5u dna重组酶、0.5u dna聚合酶、0.25u单链dna结合蛋白。
36.2、抗体配制：加入0.1mg/ml逆转录酶抗体、0.1mg/ml dna聚合酶抗体3、反应混合液制备：引物浓度1μmol/l、探针浓度0.5μmol/l，聚乙二醇8000浓度2%，dntp浓度1mm，4-羟基邻苯二甲酸浓度0.01%；调节反应混合液ph值为7.5。
37.4、配制缓冲液：缓冲液由4mm氯化镁、50mm氯化钾、20mm三羟甲基氨基甲烷组成；调节缓冲液ph值为8.7。
38.5、干燥：将反应混合液，加入到玻璃纤维膜上，置于42℃烘干；将烘干的玻璃纤维膜切成固定大小，装入pcr管中，密封，常温保存。
39.实施例2验证恒温扩增试剂在37℃的稳定性根据实施例1来配制恒温扩增试剂1并干燥，恒温扩增试剂2与温扩增试剂1相比，未加入0.1mg/ml逆转录酶抗体、0.1mg/ml dna聚合酶抗体，其余组分相同。扩增结果如表1所示，恒温扩增试剂1 37℃保存12个月，tt值未明显下降，而恒温扩增试剂2从第4月开始，tt值明显下降。
40.表1 37℃不同保存时间的恒温扩增tt值实施例3验证恒温扩增试剂在55℃的加速稳定性根据实施例1来配制恒温扩增试剂1并干燥，恒温扩增试剂3与温扩增试剂1相比，未干燥，其余组分与操作方法相同。扩增结果如表2所示，恒温扩增试剂1 55℃保存10天，tt值未明显下降，而恒温扩增试剂3从第4天开始，tt值明显下降。
41.表2 55℃不同保存时间的恒温扩增tt值总结，通过实施例一所制备的恒温扩增试剂，较于实施例二与实施例三制备出的恒温扩增试剂而言，具备更长时间的恒温放置，实施例一制备出的恒温扩增试剂可在常温下储存至少十八个月。
42.在不同实施例中出现的不同技术特征可以进行组合，以取得有益效果。本领域技
术人员在研究附图、说明书及权利要求书的基础上，应能理解并实现所揭示的实施例的其他变化的实施例。在权利要求书中，术语“包括”并不排除其他装置或步骤；不定冠词“一个”不排除多个；术语“第一”、“第二”用于标示名称而非用于表示任何特定的顺序。权利要求中的任何附图标记均不应被理解为对保护范围的限制。权利要求中出现的多个部分的功能可以由一个单独的硬件或软件模块来实现。某些技术特征出现在不同的从属权利要求中并不意味着不能将这些技术特征进行组合以取得有益效果。