一种提高数字PCR灵敏度的检测方法与流程

一种提高数字pcr灵敏度的检测方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种提高数字pcr灵敏度的检测方法。


背景技术：

2.dpcr(digital pcr或dpcr)技术是一种新兴的用于核酸检测和定量的分子生物学方法，是继实时荧光定量pcr(real-time quantitative pcr,qpcr)技术之后发展起来的又一种传统pcr技术的改良与升级。与qpcr相比，dpcr不依赖于标准曲线或内参照就可以对靶序列进行绝对定量，直接得出反应体系中靶序列的拷贝数。因此，dpcr比qpcr具有更高的灵敏度和准确度。特别是在痕量核酸检测、复杂背景下稀有突变检测、表达水平的微小差异检测以及拷贝数变异检测等方面，dpcr比qpcr具有明显的优势和广阔的应用前景。
3.dpcr的原理是将一个qpcr反应随机分配到大量微小的反应单元中，使得部分反应微单元包含而其余反应微单元不包含模板分子后，再将整个反应体系进行pcr扩增。扩增反应结束后，对全部反应微单元中发生pcr扩增的阳性微单元进行计数，再根据泊松分布的统计学原理和阳性微单元所占比例计算出整个反应体系中靶序列的拷贝数。实际上dpcr是一种终点pcr技术，其结果判读只判断有/无两种扩增状态，因此与qpcr不同，dpcr不依赖ct值的检测，故而其结果受pcr扩增效率的影响大大降低，对pcr反应抑制物的耐受能力则大大提高。此外，由于dpcr将整个反应体系分配到大量反应微单元中，每个反应微单元中与靶序列具有竞争作用的背景序列的相对浓度大大降低，使得靶序列的扩增反应更容易进行，这也是dpcr特别适合在复杂背景中检测稀有突变的原因。
4.然而是在实际应用过程中，对于一些低拷贝模板，尤其是对于稀有突变检测时，由于靶标浓度过低，会导致其检测灵敏度显著降低，且重复性较差。本发明提供了一种进一步提高数字pcr检测灵敏度的方法，对于双链dna灵敏度提升效果显著。


技术实现要素：

5.本发明的目的是开发一种提高数字pcr检测灵敏度的方法，解决当前在低拷贝稀有突变检测中灵敏度和重复性不足的问题。
6.本发明提供的技术方案如下：
7.一种提高数字pcr灵敏度的检测方法，将含有dna模板的溶液变性后，快速分散为数字pcr检测微单元；所述变性为高温变性、dna解旋酶处理或核酸变性溶液处理中的任意一种，所述的核酸变性溶液为碱性核酸变性溶液。
8.进一步的，所述的dna模板为双链dna模板。
9.进一步的，所述的含有dna模板的溶液为仅包含dna的水溶液或将dna与数字pcr反应液混合后的溶液。
10.进一步的，所述高温变性还包括加入t字型blockers序列同时进行变性的步骤；所述blockers序列为至少一对；所述blockers序列与数字pcr引物探针序列不能完全重叠。
11.进一步的，所述blockers序列为一对部分互补的序列组成，该对blockers序列其
100℃；在高温变性后需立刻转移至冰浴中或使用金属浴采用2-4℃/秒的速度冷却至10
±
10℃后再进行分液；变性步骤可加入与引物探针浓度接近的人工设计的外源t字型blockers序列同时进行变性；t字型blockers序列设计时应在目标扩增子范围之内，或不超过其上下游50bp以内的范围，所述的blockers序列与数字pcr引物探针序列不能完全重叠；所述的blockers序列为1对部分互补的序列组成，该对blockers序列其余部分与模板dna互补，与模板互补的单臂长度不超过10bp；所述的blockers序列可以加入不止1对。
27.所述dna解旋酶为uvrd解旋酶，浓度为200ng/μl，处理方式为将dna中加入0.5μl的uvrd解旋酶，37℃孵育30分钟。
28.实施例1：
29.将已知浓度的dna模板溶液使用1xte缓冲液稀释至约20拷贝/μl，在1个1.5ml离心管中混匀10μl dna模板溶液和10μl含有引物、探针的2
×
dpcr反应预混液后备用(对照组)。向另外1个1.5ml离心管中加入10μl dna模板溶液和含有引物、探针的10μl 2
×
dpcr反应预混液后，将其置于预热至95℃的金属浴中孵育5分钟，然后立即转移至冰水浴中(实验组)。将上述2个离心管中的全部溶液分别进行反应微单元的制备，反应微单元的制备参照biorad公司数字pcr仪操作流程，将配制好的反应混合液加入微滴生成卡中，放置于微滴生成仪中生成反应微单元，进一步的将制备好的反应体系转移至pcr仪中并运行pcr程序。待反应结束后，使用dpcr数据读取仪读取数据。如图3所示，对照组样本中dna模板的检测浓度为16.2拷贝/μl，而实验组样本中dna模板的检测浓度为35.9拷贝/μl，即实验组样本的检测浓度为对照组样本的2.22倍。这一结果与变性反应体系中dna模板以单链形式存在而未经过变性的反应体系中dna模板以双链形式存在，再将以上溶液分别分散至数字pcr反应微单元中后，含有检测模板的反应微单元数在理论上增加2倍，因此单链模板的检测浓度应为双链模板的2倍相吻合。这一结果也表明，对于同一dna模板，以单链形式存在时的检测灵敏度高于以双链形式存在时的检测灵敏度。
30.实施例2：
31.取将已知浓度的dna模板溶液，使用1xte缓冲液稀释至约10拷贝/μl，加入少量核酸变性溶液(双链dna变性缓冲液，赛默飞)，该核酸变性溶液包含微量氢氧化钠，与双链dna孵育一段时间后会使其变性成为单链dna。37℃孵育15-30分钟后，作为实验组进行反应微单元的制备，将含有引物和探针的2
×
dpcr反应预混液与dna模板混合后进行后续操作，反应微单元制备的其余步骤与实施例1一致，均采用biorad公司的微滴生成装置进行反应。对照组制备方法与实施案例1一致，只是将dna浓度降低至10拷贝/μl。其结果如图4所示，对照组样本中dna模板的检测浓度为8.4拷贝/μl，而实验组样本中dna模板的检测浓度为23拷贝/μl，即实验组样本的检测浓度为对照组样本的2.74倍。这一结果证明使用碱性溶液对双链dna进行预处理之后，导致反应体系中dna模板以单链形式存在而未经过预变性的反应体系中dna模板以双链形式存在，再将以上溶液分别分散至数字pcr反应微单元中后，含有检测模板的反应微单元数在理论上增加2倍，因此单链模板的检测浓度应为双链模板的2倍相吻合。这一结果也表明，对于同一dna模板，以单链形式存在时的检测灵敏度高于以双链形式存在时的检测灵敏度。
32.实施例3
33.以egfr基因为检测目标，将已知浓度的dna模板溶液稀释至约50拷贝/μl，在1个
1.5ml离心管中混匀10μl dna模板溶液后备用(对照组)。向另外1个1.5ml离心管中加入10μl dna模板溶液将其置于预热至95℃的金属浴中孵育5分钟，然后快速转移至冰水浴中(无blockers组)。向另外1个1.5ml离心管中加入10μl dna模板溶液和blockers-1，将其置于预热至95℃的金属浴中孵育5分钟，然后快速转移至冰水浴中(1对blockers组)。向另外1个1.5ml离心管中加入10μl dna模板溶液和blockers-1、blockers-2，将其置于预热至95℃的金属浴中孵育5分钟，然后快速转移至冰水浴中(2对blockers组)。所述的blockers序列和模板序列如图5所示。所述的blockers-1两臂序列为acacaaaatcacg和cgtgatacaatatt，所述的blockers-2两臂序列为cttcggcgatgt和acatcgtgcctc。然后将上述4组溶液平衡至室温，放置24小时后，均加入10μl含有引物和探针的2
×
dpcr反应预混液。将上述4个离心管中的全部溶液分别进行反应微单元的制备，将制备好的反应体系转移至pcr仪中并运行pcr程序。所述的正向引物序列为ctggactatgtccgggaac，所述的反向引物序列为ctttgcgatctgcacacac，所述的探针序列为ttggctcccagtacctgctca。待反应结束后，使用dpcr数据读取仪读取数据。如图6所示，对比对照组，无blockers序列组在室温放置一段时间后，虽然其检查拷贝数相对于对照组略有增加，但其倍数并不足2倍，这是因为长时间孵育导致两条互补的单链序列逐步恢复成双链，进而在数字pcr反应微单元制备时，反应微单元中仅有少量的模板是以单链形式存在，而大部分恢复至双链，因此反应灵敏度仅有略微提升。而当加入blockers序列后，blockers序列由于长度更短，更容易与模板序列进行结合，结合后形成了空间位阻结果，阻止其与另一条链与其进行互补，因此在液滴分散时，大部分液滴中的dna模板仍然可以以单链的形式分散，因此导致含有dna模板的反应液滴数增加2倍，在最终的检测时可以观测到约2倍灵敏度的提升。
34.实施例4
35.以egfr基因为检测目标，将已知浓度的dna模板溶液稀释至约200拷贝/μl，然后将其依次稀释10倍，40倍，160倍，640倍，每个浓度dna分别分成2管dna，一管不做任何处理，作为对照组，另一组每管dna中加入0.5μl的uvrd解旋酶(200ng/μl)，37℃孵育30分钟，作为实验组。然后分别在对照组和实验组当中加入含有引物和探针的2
×
dpcr反应预混液，进一步的使用biorad微滴生成仪进行反应微滴的制备。对照组和实验组当中均加入一个未加dna模板的空白对照。将制备好的反应体系转移至pcr仪中并运行pcr程序。待反应结束后，使用dpcr数据读取仪读取数据。结果如表1所示，经过dna解旋酶处理后的实验组检测灵敏度相对对照组均有一个2倍左右的提升，证明了经dna解旋酶处理后使得含有dna模板的反应微单元数量增加了2倍，结果与理论达到了一致。
36.表1.经dna解旋酶处理前后的数字pcr增强效果对比
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