一种利用不定芽体外再生提高菊属植物基因编辑效率的方法

本发明属于基因编辑领域，涉及提高crispr/cas9在菊属植物中的基因编辑效率的方法，尤其涉及一种利用不定芽体外再生提高菊属植物基因编辑效率的方法。

背景技术：

1、菊花(chrysanthemum morifolium ramat.)是菊科、菊属的多年生宿根草本植物，观赏价值高，是世界四大切花之一。但栽培菊花多为六倍体植物，起源复杂，基因组高度杂合，基因功能分析困难。甘野菊(chrysanthemum seticuspe)gojo-0是一个和菊花亲缘关系较近的自交亲和的二倍体菊属植物。它不仅具有野菊的优良特性，且具有自交亲和性和基因组纯合的特点。相对于六倍体的栽培菊花品种，甘野菊gojo-0遗传分析相对简单，将其作为菊属植物研究的模式植物有利于栽培菊花品种中复杂生物学现象的研究。

2、近年来，基因编辑技术高速发展，crispr/cas9技术在多种园艺作物上的应用为基因功能研究和新品种育种提供了一种高效的手段，提高crispr/cas9系统的基因编辑效率也变得非常迫切。

3、中国专利申请cn 110129363 a公开了一种提高番茄crispr/cas9基因编辑效率的方法，但是该方法中是在外植体的培养转化过程中发现通过提高温度可以显著提高基因编辑的效率，该方法仅仅是利用了初次组培再生过程中的温度对于基因编辑的效率的影响，而并不能用于已经转化成功的植株进行二次诱导基因编辑。

4、目前，gojo-0的基因组已公布，以叶盘为外植体的再生体系和农杆菌介导的遗传转化体系建立的完成为甘野菊gojo-0基因编辑奠定了基础。但影响编辑效率的因素有很多，亟需一种能够提高菊属植物中的基因编辑效率的方法。

技术实现思路

1、发明目的：本发明提供了一种利用不定芽体外再生提高植株编辑效率的方法，并进一步通过连接phee401e载体的方式验证了此方法显著提高了植株crispr/cas9基因编辑的效率。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种利用不定芽体外再生提高菊属植物基因编辑效率的方法，包括以下步骤：将crispr/cas9基因编辑菊属植物的幼叶的叶盘经过不定芽再生培养获得不定芽，然后将不定芽切下接种到生根培养基上进行生根培养得到再生植株。

3、其中，所述crispr/cas9基因编辑菊属植物为甘野菊gojo-0，其他菊属类植物也在本发明的保护范围之内。

4、其中，所述crispr/cas9基因编辑植物是将phee401e-csdrm1载体导入农杆菌中得到浸染液，然后将甘野菊gojo-0的幼叶叶盘在浸染液中浸染培养获得。

5、其中，所述叶盘尺寸为4mm×4mm。

6、其中，所述不定芽再生培养的培养基为ms+6-ba1.0mg·l-1+naa0.2mg·l-1。

7、其中，所述生根培养基为ms+hyg2mg·l-1+cb150mg·l-1。

8、进一步地，phee401e-csdrm1载体对应的农杆菌抗性为卡那霉素(kan)，所述转基因植物对应筛选标记抗性为潮霉素(hyg)。

9、进一步的，所述农杆菌od600＝0.4-0.6；农杆菌侵染时间为8-10min。

10、进一步的，所述提高基因编辑方法所需时间为28-32d，优选30d。

11、进一步的，验证基因编辑效率的方法为连接pmd19-t载体转化大肠杆菌后挑取单克隆测序。比较再生苗株系与野生型植株在编辑位点的序列差异，计算编辑效率。

12、基因编辑效率(％)＝已编辑序列克隆数/总克隆数×100(％)。

13、有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：

14、1)方法简单易行：本方法需将插入基因编辑载体片段的植株无菌苗叶片切成4mm×4mm的叶盘，放置在适宜不定芽再生的培养基(ms+1.0mg·l-1 6-ba+0.2mg·l-1 naa)上培养30d，即可获得编辑效率100％的基因编辑植株。

15、2)显著提高了植物体基因编辑效率：本方法将植物体的基因编辑效率从≤50％提升至100％，使植物体内目的基因均有片段被敲除，阻碍了基因表达。

16、综上，本发明提供的提高植物中基因编辑效率的方法，为甘野菊基因功能研究奠定了方法学基础，为基因编辑发展研究提供新方法，具有较高的实用性和科研应用价值。

技术特征：

1.一种利用不定芽体外再生提高菊属植物基因编辑效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：将crispr/cas9基因编辑菊属植物的幼叶的叶盘经过不定芽再生培养获得不定芽，再将不定芽切下接种到生根培养基上进行生根培养得到再生植株。

2.根据权利要求1所述的利用不定芽体外再生提高菊属植物基因编辑效率的方法，其特征在于，所述crispr/cas9基因编辑菊属植物为甘野菊gojo-0。

3.根据权利要求1所述的利用不定芽体外再生提高菊属植物基因编辑效率的方法，其特征在于，所述crispr/cas9基因编辑植物是将phee401e-csdrm1载体导入农杆菌中得到浸染液，然后将甘野菊gojo-0的幼叶叶盘在浸染液中浸染培养获得。

4.根据权利要求1所述的利用不定芽体外再生提高菊属植物基因编辑效率的方法，其特征在于，所述叶盘尺寸为4mm×4mm。

5.根据权利要求1所述的利用不定芽体外再生提高菊属植物基因编辑效率的方法，其特征在于，所述不定芽再生培养的培养基为ms+6-ba l.0mg·l-1+naa 0.2mg·l-1。

6.根据权利要求1所述的利用不定芽体外再生提高菊属植物基因编辑效率的方法，其特征在于，所述生根培养基为ms+hyg 2mg·l-1+cb 150mg·l-1。

技术总结
本发明公开了一种利用不定芽体外再生提高菊属植物基因编辑效率的方法，包括以下步骤：将CRISPR/Cas9基因编辑菊属植物的幼叶的叶盘经过不定芽再生培养获得不定芽，再将不定芽切下接种到生根培养基上进行生根培养得到再生植株。本发明通过构建含有编辑CsDRM1基因的载体，利用叶盘转化法获得基因编辑植株，再利用不定芽体外再生的方式将基因编辑效率从≤50％提升至100％，此方法具有操作简单，效果显著等优点，为基因编辑发展提供新方法，具有较高的实用性和科研应用价值。

技术研发人员：宋爱萍,张佳丽,王振兴,袁叶,慈惠婷,房伟民,陈发棣
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11