BMP2蛋白或其编码基因在调控猪米色脂肪细胞分化中的应用

bmp2蛋白或其编码基因在调控猪米色脂肪细胞分化中的应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种bmp2蛋白或其编码基因在调控猪米色脂肪细胞分化中的应用。


背景技术：

2.哺乳动物脂肪组织是调节能量平衡的重要内分泌器官。脂肪组织根据功能分为白色脂肪组织和棕色脂肪组织。白色脂肪组织是人体主要的脂肪组织，其主要功能是在营养充足的情况下将未被消耗的能量以甘油三酯的形式储存起来，而当营养条件不足时被脂酶将甘油三酯分解为游离的脂肪酸，供给其他组织器官消耗使用。棕色脂肪组织主要分布在肩胛间、肩胛下、颈部、肾周、胸部动脉和下腔静脉周围，主要负责由线粒体ucp1蛋白介导非颤栗型产热。在寒冷暴露、药物、运动等各种刺激下，白色脂肪组织中会出现米色脂肪细胞，它们具有与棕色脂肪细胞相似的特征，如存在多房脂滴和解耦蛋白1(ucp1) 阳性细胞。白色脂肪组织的这种“棕色化”体现了脂肪组织适应环境的显著能力。长期以来，在白色脂肪组织中募集的ucp1+细胞因为高表达ucp1，线粒体丰富且具有多房脂滴外观，因此白色脂肪组织内的这些细胞被称为“米色脂肪细胞”。现在越来越多的研究表明米色脂肪细胞对能量平衡和营养稳态具有重要贡献。目前已知与米色脂肪形成与发育的转录因子有：prdm16、ebf2、zfp516等。此外，已鉴定出许多特异性的米色细胞标记基因(如tbx1、tmem26、 cd137、fgf21、p2rx5、pat2、car4和cited1)，已经被鉴定并被证明在调节米色分化中发挥重要作用。这些标志物不仅促进了对米色脂肪相关生物学的理解，也为肥胖及其相关代谢紊乱提供了治疗分子靶点。
3.目前普遍认为猪缺乏功能性棕色脂肪组织，而且ucp1基因在猪的进化过程中缺失，这可能是新生仔猪对寒冷比较敏感的原因。新生仔猪对寒冷很敏感，寒冷地区的农村很多仔猪在出生后由于寒冷应激而死亡，给养猪业带来了巨大的损失。此外，ucp1基因的另一个生理学作用是降低脂肪沉积。在猪脂肪中过表达ucp1基因之后，降低了猪的脂肪沉积并提高了仔猪的抗寒能力。但是ucp1过表达后，脂肪组织没有出现米色化的现象。
4.而增加猪米色脂肪细胞的形成不仅能够为降低猪的脂肪沉积提供思路，也可为提高仔猪的抗寒能力提供解决方法。因此，有必要进一步对猪脂肪组织的调控进行研究。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种bmp2基因的新用途，具体提供其在调控猪米色脂肪细胞的分化效率和产热功能中的应用。
6.本发明所述bmp2基因为本领域公知的，如在ncbi上其编号为 100157103。
7.具体地，本发明的技术方案如下：
8.第一方面，本发明提供bmp2蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在以下任一方面中的应用：
9.1)调控猪米色脂肪细胞的形成；
10.2)调控猪米色脂肪细胞的线粒体功能；
11.3)研究动物脂肪发育和代谢；
12.4)猪品种的培育；
13.5)制备预防、缓解和/或治疗肥胖相关疾病的药物；
14.6)构建米色脂肪动物模型。
15.所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。
16.本发明的bmp2蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料还可应用在研究猪米色脂肪基因的筛选与鉴定、低脂优质猪品种的培育、低脂优质猪肉的研究与生产以及预防、缓解和/或治疗肥胖中。
17.本发明通过增加bmp2基因的表达发现其能促进猪米色脂肪分化并提升线粒体功能，降低bmp2基因的表达可降低猪米色脂肪分化并降低线粒体功能，进而提出了bmp2基因在猪米色脂肪细胞分化和线粒体功能调控中的应用。
18.骨形态发生蛋白最早于1965年从脱钙骨基质提取物中分离得到，它是一类具有使未分化的间充质细胞定向分化为成骨细胞，并进而合成胶原，形成钙化的骨组织能力的活性蛋白。bmp是一类多功能生长因子，除了诱导软骨与骨的形成外，还参与了胚胎发生中诸如神经分化、体节发育等诸多过程。近年来，对间充质干细胞、脂肪前体细胞以及胚胎干细胞研究发现，bmp在脂肪生成过程中也起着重要的调控作用。白色脂肪是甘油三酯贮存以及脂肪酸释放的部位，而棕色脂肪和米色脂肪主要参与能量代谢。2种脂肪的发育模式大不一样。bmp可能通过不同的信号通路调控两种类型脂肪的生成。其中，已知bmp4通过smad依赖信号通路参与白色脂肪生成的调节，而 bmp7则通过p38mapk通路参与棕色脂肪生成的调控。bmp7通过抑制早期脂肪生成抑制因子以及诱导褐色脂肪定向的关键分子 (prdm16、pgc-1a)表达，从而生成特定表达ucp1和含有大量线粒体的成熟棕色脂肪。
19.bmp2作为bmps家族重要的成员之一，具有bmps家族的典型分子结构特征，分子质量约为30ku，其为疏水性糖蛋白，同属分泌性蛋白质。猪的bmp2基因定位于17号染色体上，编码区长为1188nt，有4个外显子。bmp2是bmps家族生物活性最高的成员，它的生物学功能非常广泛，在骨组织形成和修复、胚胎发育、肿瘤发生起重要作用。有研究表明bmp2可诱导干细胞向脂肪细胞系分化，并定向分化为白色脂肪细胞，但对米色脂肪细胞的形成有何作用鲜有报道。
20.本发明利用基因工程手段及重组蛋白，对bmp2基因进行过表达，从转录和翻译水平上促进或提高bmp2基因的表达，从线粒体氧化磷酸化水平验证了其可促进米色脂肪产热功能。
21.本发明利用rnai技术，对bmp2基因进行敲降，从转录水平上降低bmp2基因的表达。
22.本发明中，bmp2基因在ncbi上的参考序列编号为ng_023233.1。
23.第二方面，本发明提供bmp2基因激动剂、bmp2蛋白激活剂、bmp2基因过表达载体或可提升bmp2基因表达的靶向bmp2基因的编辑系统的以下任一方面的应用：
24.a)增加猪米色脂肪细胞的分化效率；
25.b)增加猪米色脂肪细胞的产热能力；
26.c)研究猪脂肪性状的特征；
27.d)减少动物脂肪沉积；
28.e)培育低脂优质猪品种；
29.f)生产低脂优质猪肉产品。
30.其中，所述bmp2基因激动剂是指能够从转录或翻译水平上促进 bmp2基因表达的物质，所述激动剂包括但不限于过表达质粒、腺病毒、慢病毒、小分子化合物、肽、抗体等。
31.第三方面，本发明提供bmp2基因抑制剂、bmp2蛋白抑制剂、可降低bmp2基因表达的bmp2基因的编辑系统的以下任一方面的应用：
32.a)降低猪米色脂肪细胞的分化效率；
33.b)降低猪米色脂肪细胞的产热能力；
34.c)改善动物脂肪沉积；
35.d)用于研究肥胖相关疾病。
36.其中，所述bmp2基因抑制剂是能够从转录或翻译水平上抑制 bmp2基因表达的物质，所述抑制剂包括但不限于shrna、sirna、dsrna、mirna、cdna、反义rna/dna、低分子化合物、肽、抗体等。
37.可选地，所述bmp2基因的编辑系统为sirna抑制bmp2基因表达的操作系统。
38.第四方面，本发明提供一种靶向bmp2基因的sirna，其核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。
39.seq id no.1：gacccuugcuagucacuuu；
40.seq id no.2：aaagugacuagcaaggguc。
41.第五方面，本发明提供一种提升猪米色脂肪细胞分化效率和/或产热功能的方法，其通过重组蛋白、基因工程技术增加猪的bmp2 基因的表达。
42.第六方面，本发明提供一种降低猪米色脂肪细胞分化效率和/或产热功能的方法，其通过重组蛋白、基因工程技术降低猪的bmp2 基因的表达。
43.本发明的方法中，通过对bmp2基因的敲低、敲除、沉默、突变或失活降低猪的bmp2基因的表达。
44.优选，通过sirna敲低bmp2基因的表达；利用同源重组的方式进行bmp2的突变、敲除或插入失活；利用基因编辑的方式抑制 bmp2基因的表达。
45.本发明的有益效果至少在于：
46.本发明填补了增加猪米色脂肪分化效率的研究空白，提供了一种增加bmp2基因的表达促进猪米色脂肪细胞分化及产热的方法，为增加猪米色脂肪细胞的形成提供了理论基础。
附图说明
47.图1为本发明实施例1、实施例2中猪米色脂肪细胞形成过程及猪各组织中bmp2基因的表达情况。其中，a：猪前脂肪细胞向米色脂肪细胞方向分化第0、2、4、6、8天的细胞形态以及油红定量结果；图中标尺为200μm；b：猪前脂肪细胞向米色脂肪细胞方向分化第0、 2、4、6、8天时bmp2基因，脂肪细胞分化标记基因pparγ，cebp
ɑ
， fabp4以及米色脂肪细胞标记基因cidea的mrna的表达情况；c：猪前脂肪细胞向米色脂肪细胞方向分化第0、2、4、6、8天时bmp2，脂肪细胞分化标记基因pparγ，cebp
ɑ
的蛋白表达情况，β-tubulin 为内参；d：bmp2基因在猪不同组织中的mrna表达情况。图中， *p《0.05、**p《0.01及***p《0.001表示显著性。
48.图2为本发明实施例3中的添加bmp2重组蛋白后猪米色脂肪细胞的分化情况。其中，a：猪米色脂肪细胞诱导分化过程中添加不同浓度(0ng/ml，10ng/ml，25ng/ml，50ng/ml)的bmp2重组蛋白的操作流程示意图；b：培养皿中的油红o染色情况；c：异丙醇萃取油红o后的情况；d：油红o染色后的脂肪细胞照片；图中标尺为500μm；e：bodipy493/503染色后的脂肪细胞照片；图中标尺为50μm；f：油红o染色定量结果。图中，***p《0.001表示显著性。
49.图3为本发明实施例3中的添加bmp2重组蛋白后的猪米色脂肪细胞标记基因的表达情况。其中，a-b：猪米色脂肪细胞诱导分化过程中添加不同浓度的bmp2重组蛋白后的脂肪酸合成相关基因的 mrna的表达量情况；c：猪米色脂肪细胞诱导分化过程中添加不同浓度的bmp2重组蛋白后的米色脂肪细胞标记基因的mrna表达量情况；d：猪米色脂肪细胞诱导分化过程中添加不同浓度的bmp2重组蛋白后的脂肪酸合成相关基因及米色脂肪细胞标记基因的蛋白表达情况，其中tubulin为内参。图中，*p《0.05、**p《0.01及***p《0.001 表示显著性。
50.图4为本发明实施例3中的添加bmp2重组蛋白后的猪米色脂肪细胞的线粒体功能测试结果。其中，a：猪米色脂肪细胞诱导分化过程中添加不同浓度的bmp2重组蛋白后的细胞耗氧量的检测结果，图中oligomycin为寡霉素，ant/rot为鱼藤酮/抗霉素a；b-d：猪米色脂肪细胞诱导分化过程中添加不同浓度的bmp2重组蛋白后的细胞最大呼吸、基础呼吸和质子漏呼吸的检测结果。e：猪米色脂肪细胞诱导分化过程中添加不同浓度的bmp2重组蛋白后的线粒体拷贝数的检测结果。图中，**p《0.01及***p《0.001表示显著性，ns表示无显著性差异。
51.图5为本发明实施例4中的利用基因工程技术过表达bmp2基因对于猪米色脂肪细胞的分化效率影响情况。a：bmp2基因mrna表达量检测结果；b：过表达bmp2基因的猪前脂肪细胞及未过表达 bmp2基因(对照组)的前脂肪细胞向猪米色脂肪细胞诱导分化至第 8天后的油红o染色结果；图中标尺为500μm；c-d：过表达bmp2 基因的猪前脂肪细胞及未过表达bmp2基因(对照组)的前脂肪细胞向猪米色脂肪细胞诱导分化至第8天后的脂肪合成相关基因及米色脂肪标记基因的mrna表达量结果。图中，*p《0.05、**p《0.01及 ***p《0.001表示显著性，ns表示无显著性差异。
52.图6为本发明实施例5中的利用rnai技术降低bmp2基因的表达后对猪米色脂肪细胞的分化效率的影响情况。其中，a：使用sirna 在猪米色脂肪细胞诱导分化中干扰bmp2的操作流程示意图；b：转染sirna-bmp2 48h、72h后的bmp2基因的mrna表达量检测结果； c：猪米色脂肪细胞诱导分化过程中敲降bmp2基因后的米色脂肪细胞的油红o染色结果；图中标尺为500μm；d：猪米色脂肪细胞诱导分化过程中敲降bmp2基因后脂肪酸合成相关基因的mrna表达量情况；e：敲降bmp2基因后细胞耗氧量、基础呼吸和质子漏呼吸检测结果。图中，nc代表转染sirna-nc的实验组，sirna/si-bmp2 代表转染sirna-bmp2的实验组，*p《0.05、**p《0.01及***p《0.001 表示显著性，ns表示无显著性差异。
具体实施方式
53.下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
54.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
55.实施例1猪米色脂肪细胞形成过程中bmp2(骨形成蛋白2)的表达
56.本实施例从藏猪腹股沟皮下脂肪分离得到前脂肪细胞，对其进行诱导分化，并通过油红o观测其在体外向猪米色脂肪细胞方向分化的情况。观测结果参见图1中的a。
57.本实施例进一步检测猪前脂肪细胞诱导分化不同阶段的脂肪细胞中bmp2基因、脂肪细胞分化标记基因pparγ，cebp
ɑ
，fabp4 以及米色脂肪细胞标记基因cidea的mrna的表达水平(内参为 18s)，和bmp2、脂肪细胞分化标记基因pparγ，cebp
ɑ
的蛋白表达水平，结果参见图1中的b和c。从中可知与猪前脂肪细胞相比，在诱导分化两天后，bmp2基因表达水平显著上调；随着猪米色脂肪细胞的分化成熟，bmp2基因的表达持续高水平，说明bmp2基因在猪米色脂肪形成过程中具有重要作用。
58.具体猪前脂肪细胞分离和培养过程如下：
59.1)取1月龄雄性藏仔猪腹股沟皮下白色脂肪组织，用含有5％的青霉素/链霉素的dpbs洗涤、剪碎，在含有2mg/ml i型胶原酶的 dulbecco hanks平衡盐溶液中37℃消化60分钟，获得脂肪组织悬浮液；
60.2)随后用70μm细胞滤器过滤组织悬浮液，1500r/min离心10 min；
61.3)弃去上清液，向沉淀中加入3-4ml红细胞裂解液，裂解10min 后，1500r/min离心10min；
62.4)弃去上清液，沉淀用添加了10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素/ 链霉素(p/s)的dmem/f12培养基重悬；
63.5)放入37℃细胞培养箱进行培养，长满后进行传代。
64.猪米色脂肪细胞的诱导分化过程如下：
65.1)猪前脂肪细胞长满后，进行铺板，一个十厘米大皿的猪前脂肪细胞可铺一个12孔细胞培养板；
66.2)细胞长满后，接触抑制两天后开始诱导分化；
67.3)米色脂肪诱导分化培养液：基础培养基为dmem高糖培养基 (1％ps、2％fbs)+1
×
非必需氨基酸、1
×
微量元素a、1
×
微量元素b、 1
×
微量元素c、0.1mm 2-巯基乙醇、200ng/ml igf1(long-r3-igf1)、 8ng/ml fgf、50μg/ml抗坏血酸。分化培养基在基础培养基中添加1nm t3，1μm地塞米松，0.5mm ibmx和2μm罗格列酮；
68.4)每2天换液一次，分化8天。
69.实施例2 bmp2基因在藏猪中的表达情况
70.本实施例共选取藏猪全身11个组织，包括主要代谢相关组织腹股沟皮下脂肪组织，肾周脂肪组织、背膘、颈部脂肪组织、肝脏、肌肉(腿部)以及重要脏器心、脾、肺、肾、睾丸。对bmp2基因在藏猪不同组织中的mrna表达水平进行检测(内参为18s)。结果表明 bmp2基因在藏猪腹股沟脂肪组织中表达最高，背膘次之(参见图1 中的d)，说明bmp2基因可能在猪脂肪形成过程中发挥重要作用。
71.实施例3添加bmp2重组蛋白对猪米色脂肪的分化效率及线粒体功能的影响
72.本实施例采用mce公司购买的bmp2重组蛋白，用以增加猪中 bmp2基因的表达，从而考察bmp2基因对猪米色脂肪形成的影响。
73.具体选取实施例1中分离培养的猪前脂肪细胞为实验对象，实验过程如下：待一个十厘米大皿的猪前脂肪细胞长满后，铺一个12孔细胞培养板，铺板时添加不同浓度的bmp2重组蛋白(其中3个孔不添加bmp2重组蛋白，3个孔添加10ng/ml的bmp2，3个孔添加 25ng/ml的bmp2，3个孔添加50ng/ml的bmp2)；待细胞长满后，再接触抑制两天后(分化第0天)换成米色脂肪诱导分化培养液(参见实施例1)，其中3个孔不添加bmp2重组蛋白，3个孔添加10ng/ml 的bmp2，3个孔添加25ng/ml的bmp2，3个孔添加50ng/ml的 bmp2；分化第2天，4天，6天换不添加bmp2重组蛋白的米色脂肪诱导分化培养液，共诱导分化8天(操作流程示意图见图2中的a)。
74.本实施例对诱导分化8天后收集的细胞样品进行油红o染色观察、拍照(结果见图2中的b和d)，采用异丙醇萃取油红o进行观察(结果见图2中的c)，进行bodipy493/503染色拍照(结果见图2中的e)，并对油红o染色进行定量分析(结果见图2中的f)。结果表明，添加10ng/ml，25ng/ml，50ng/ml的bmp2重组蛋白后米色脂肪细胞分化效率均极显著升高(p《0.001)。
75.采用异丙醇萃取油红o进行观察及定量分析的具体操作是：1. 细胞样品进行完油红染色及拍照后，向每个孔中加入1ml异丙醇，置于摇床上10分钟；2.每个孔吸100ul加入96孔板中，每个孔设置 6个重复；3.用酶标仪读取510nm处的吸光值。
76.本实施例还提取了诱导分化8天后收集的细胞样品的rna和蛋白，以进一步检测标志基因的表达。结果参见图3。
77.具体对脂肪细胞分化标记基因(脂肪酸合成相关基因)cebp
ɑ
， pparγ，fabp4，fasn，elovl6，acaca，ap2，scd，dgat1， dgat2及米色脂肪细胞标记基因cidea，dio2，cd137，pgc1
ɑ
的mrna的表达水平进行了检测(内参为18s)，结果参见图3中的 a-c。对脂肪酸合成相关基因及米色脂肪细胞标记基因atp5a、 mtco1、sdhb、dio2、acc、ppary、cebp
ɑ
的蛋白表达水平进行了检测，结果参见图3中的d。
78.此外，本实施例还通过seahorse系统检测米色脂肪细胞的ocr (氧气消耗速率)，结果见图4。
79.具体对猪米色脂肪细胞诱导分化过程中添加不同浓度的bmp2 重组蛋白后的细胞耗氧量进行检测，结果参见图4中的a，从中可知：猪米色脂肪细胞诱导分化过程中添加25ng/ml和50ng/ml的bmp2 重组蛋白后，猪米色脂肪细胞的耗氧量增加。
80.具体对猪米色脂肪细胞诱导分化过程中添加不同浓度的bmp2 重组蛋白后的细胞最大呼吸、基础呼吸和质子漏呼吸进行检测，结果参见图4中的b-d，从中可知：猪米色脂肪细胞诱导分化过程中添加 50ng/ml的bmp2重组蛋白后，猪米色脂肪细胞最大呼吸，基础呼吸以及质子漏均显著(**p《0.01)或极显著(***p《0.001)增加。
81.具体对猪米色脂肪细胞诱导分化过程中添加不同浓度的bmp2 重组蛋白后的线粒体拷贝数进行检测(内参为β-globin)，结果参见图4中的e，从中可知：猪米色脂肪细胞诱导分化过程中添加25 ng/ml和50ng/ml的bmp2重组蛋白后线粒体拷贝数均显著(**p 《0.01)增加。
82.以上实验结果说明，添加10ng/ml，25ng/ml，50ng/ml的bmp2 重组蛋白可增加猪米色脂肪的分化效率，添加50ng/ml的bmp2重组蛋白可增强猪米色脂肪细胞的线粒体功能。
83.实施例4过表达bmp2基因对猪米色脂肪形成的影响
84.本实施例构建了bmp2过表达质粒，并使用qpcr检测过表达质粒转入细胞后诱导分化8天后的bmp2基因mrna的表达量(内参为18s)，结果参见图5中的a。从中可知，利用基因工程技术使得 bmp2基因过表达将近300倍。
85.bmp2过表达质粒构建过程如下：
86.1.以藏猪cdna为模板扩增bmp2基因cds区，将bmp2基因连接到已酶切的piggybac dual promoter转座子表达质粒pb513b-1 上，酶切位点为kpni和pmei；
87.2.将上述连接好的质粒，加入50μl大肠杆菌dh5α感受态细胞中，轻弹离心管底部混匀，冰上放置30min；
88.3.42℃热激30s，迅速插入冰中，静置2min，加到500μl lb 培养基中，37℃培养箱中200rpm/min震荡1h；
89.4.3000rpm离心2min，吸弃上清液，留100μl左右，重悬底部大肠杆菌沉淀；
90.5.涂板：将上述100μl菌液全部均匀涂到含氨苄抗性的平板上，放于37℃培养箱正置1h后倒放过夜培养；
91.6.挑菌：每个质粒挑10-15个菌落于5ml含有氨苄的lb液体培养基，37℃200rpm/min震荡5-6h，待菌液浑浊，取500μl菌液进行测序；
92.7.测序结果正确的质粒，接种到200ml的lb液体培养基中扩大培养12-16h，参照质粒提取试剂盒的说明书提质粒，并对质粒进行测序，序列正确的可用于转染细胞。
93.检测bmp2 mrna的表达量：
94.1.通过电转将上述bmp2过表达质粒转入藏猪原代细胞中；电转后6-8小时换加有嘌呤霉素的含10％胎牛血清的dmem培养基；
95.2.每天换液直到细胞长满后铺板并向猪米色脂肪细胞方向诱导分化8天后，提取rna并进行反转录后定量检测bmp2 mrna的表达量。
96.通过电转将上述获得的bmp2过表达质粒和对照质粒(pb513b) 分别转至实施例1中获得的猪前脂肪细胞获得过表达bmp2基因的猪前脂肪细胞及未过表达bmp2基因的前脂肪细胞，继而进行向米色脂肪细胞的诱导分化(具体方法参见实施例1)，诱导分化8天后检测脂肪形成及米色脂肪细胞标志基因的表达情况。
97.具体对过表达bmp2基因的猪前脂肪细胞及未过表达bmp2基因的前脂肪细胞向猪米色脂肪细胞诱导分化至第8天后的细胞进行油红o染色，结果参见图5中的b，其显示：过表达bmp2基因后米色脂肪细胞分化效率显著升高。
98.具体将过表达bmp2基因的猪前脂肪细胞及未过表达bmp2基因的前脂肪细胞向猪米色脂肪细胞诱导分化至第8天后的细胞的 rna进行提取并检测脂肪合成相关基因及米色脂肪标记基因的 mrna表达量，结果参见图5中的c-d(内参为18s)。其表明，脂肪细胞分化标记基因cebp
ɑ
，pparγ，fabp4，fasn，elovl6， acaca，ap2，scd，dgat1及米色脂肪细胞标记基因pgc1
ɑ
表达大部分显著(**p《0.01)增加，过表达bmp2基因可增加脂肪酸合成相关基因及米色脂肪细胞标记基因的mrna水平表达量。
99.以上实验结果说明，增加bmp2基因的表达可增加猪米色脂肪的分化效率，促进猪米色脂肪的形成。
100.实施例5干扰bmp2基因对猪米色脂肪形成的影响
101.本实施例利用rnai技术降低bmp2基因的表达，对其功能进行反向验证。
102.具体选取实施例1中分离培养的猪前脂肪细胞为实验对象，实验过程如下：待一个十厘米大皿的猪前脂肪细胞长满后，铺一个12孔细胞培养板，待细胞长到70-80％时进行sirna转染，其中6个孔使用rnaimax转染sirna-nc，另外6个孔转染sirna-bmp2，转染所用sirna为在序列seqidno.1和seqidno.2后面分别连接两个碱基t的两条sirna(在seqidno.1和seqidno.2后面分别+tt悬垂，可人为做出粘性末端，便于解链)；
103.转染方法为：
104.1.将细胞接种到12孔板中，待细胞长到70-80％进行转染；
105.2.向
①
管中加50μlopti-mem和3μlrnaimax，向
②
管加50μlopti-mem和10pmolsirna，此为12孔板一个孔的量；
106.3.将
②
管溶液倒入
①
管溶液中，混匀室温孵育5分钟；将混合液体加入细胞培养孔中，待细胞长满后，再接触抑制两天后(分化第0天)换成米色脂肪诱导分化培养液(参见实施例1)，换液的同时进行转染；分化第2天，4天，6天不进行转染直接换米色脂肪诱导分化培养液，共诱导分化8天(操作流程示意图参见图6中的a)。
107.具体转染sirna-bmp248h、72h后，本实施例对bmp2基因的mrna表达量进行检测(内参为18s)，结果参见图6中的b，其显示：使用sirna-bmp2能极显著(***p《0.001)降低bmp2基因的mrna表达量。
108.诱导分化8天后，本实施例采用油红o染色验证猪米色脂肪细胞诱导分化过程中敲降bmp2基因后米色脂肪细胞分化效率，细胞染色结果见图6中的c(左侧为油红o染色定性观察结果，右侧为油红o染色定量结果)，其显示敲降bmp2基因后，米色脂肪细胞分化效率降低。
109.从上述结果可知降低bmp2基因的表达后米色脂肪细胞的分化效率显著降低。
110.本实施例还对诱导分化8天后收集细胞样品进行rna提取，进一步检测脂肪分化和米色脂肪细胞标志基因的表达。
111.具体对脂肪细胞分化标记基因cebp
ɑ
，pparγ，fabp4，fasn，elovl6，acaca，ap2，scd，dgat2的mrna的表达水平进行了检测(内参为18s)，结果参见图6中的d。从中可知，猪米色脂肪细胞诱导分化过程中敲降bmp2基因会降低脂肪酸合成相关基因的mrna表达量。
112.本实施例还通过用seahorse系统检测诱导分化8天后米色脂肪细胞的ocr，具体对细胞耗氧量、基础呼吸和质子漏呼吸进行检测，结果见图6中的e，从中可知：敲降bmp2基因后，猪米色脂肪细胞基础呼吸及质子漏均有下降。
113.上述实验结果说明，降低bmp2基因的表达会降低猪米色脂肪的分化效率。
114.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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