一种长片段基因质粒转化及提取方法

1.本发明属于分子生物技术领域，尤其涉及一种长片段基因质粒转化及提取方法。


背景技术：

2.目前，质粒是广泛存在于细菌、真菌等生物体，存在于染色体外可以携带遗传信息的的环状双链dna分子。目前被改造为分子生物学最常用的工具，在生命科学领域中用于研究基因功能，开发新型治疗药物等。质粒载体含有3个结构：复制子，抗性基因，多克隆位点。通过选择多克隆位点内的限制性内切酶切断质粒的双链dna，体外通过同源重组的方式引入外源性的基因，再将重组的质粒转化感受态细胞；摄取和容纳外来质粒dna的感受态细胞生长于抗性琼脂糖平板上，过夜生长后平板中会出现许多菌落，挑选单个菌落到对应抗生素的肉汤培养基中，经过37℃摇床摇菌后，获得大量的菌液；最后通过经典的sds碱裂解法裂解大肠杆菌细胞壁，释放宿主细胞的质粒，提取高纯度高质量的质粒，用于进行后续的酶切、转染等操作。
3.目前常用的感受态细胞是dh5α菌株，使用puc19常见质粒dna进行检测检测，发现其转化效率≥108cfu/μg，可满足于搭载小片段基因的质粒扩增。对于长片段常使用xl10菌株制备的化学转化超级感受态细胞，转化效率同样超过108cfu/μg。感受态细胞从起始复制子开始启动复制，生产大量的质粒，但对于超过10000bp的片段，因其远远超过载体的长度，复制难度极大。采用dh5α菌株和xl10菌株时，宿主细胞细胞为了维持载体的大量复制，在压力选择下会切割基因片段，使得片段无法完整转化，而影响质粒的完整性。因此降低载体的复制对于质粒dna的完整复制非常重要。
4.转化感受态细胞后还需要提取宿主细胞产生的质粒，因此得到高浓度、高质量的质粒对于后续的功能基因的研究至关重要。经典的质粒提取方法采用sds碱裂解法，主要由三种溶液组成：溶液p1(葡萄糖、tris-cl、edta、rnase)，溶液p2(naoh、sds)，溶液p3(醋酸钾、盐酸胍)。大肠杆菌在naoh强碱性的条件下破坏细胞壁，配合sds使蛋白质和染色体dna变性，将质粒dna释放到上清中，随后加入醋酸中和上清的ph值，并且钾离子置换sds中的钠使蛋白质和染色体dna发生沉淀。通过内毒素清除剂清除质粒dna的内毒素，再加入异丙醇抽提质粒dna，最后二氧化硅吸附柱特异性地吸附质粒dna。尽管质粒dna较小，短时间处于强碱的环境中不易被破坏，但需要在5分钟内加入醋酸中和以保护质粒dna。长片段的质粒dna在强碱环境中更易发生断裂，所以控制提取过程中的条件非常重要。
5.目前长片段(≥10000bp)基因质粒采用普通的dh5a，xl10等感受态细胞转化易导致片段丢失，且质粒提取后浓度较低，无法用于后续的细胞转染。
6.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
7.(1)现有技术中，由于常用的dh5a，xl10等感受态细胞转化易导致超过10000bp的片段丢失，压力选择下宿主细胞常会切割基因片段，使得片段无法完整转化，从而影响质粒的完整性。
8.(2)现有技术中，常规提取质粒步骤并未重视三种溶液的比例达到控制提取环境
中的ph值的目的，否则导致质粒提取浓度较低，无法获得足量质粒用于后续细胞的转染。


技术实现要素：

9.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种长片段基因质粒转化及提取方法。
10.本发明是根据感受态细胞的特异性降低质粒载体的复制，实现长片段基因的完整复制，并且在提取质粒过程中注意各试剂比例加入以控制ph值获得大量的质粒。通过epi400感受态细胞和摇菌过程中添加诱导剂实现长片段基因片段的完整转化，并且在质粒提取过程中限定试剂的比例加入以控制ph值而发明一种长片段基因质粒转化及提取方法，所述长片段基因质粒转化及提取方法包括以下步骤：
11.步骤一，将长片段基因的质粒加入到epi400感受态细胞中，冰上静置，热激，再次冰上静置，加入无抗生素的肉汤培养基，利用摇床摇菌；该步骤可以将质粒最大量的转化epi400。
12.步骤二，将摇好的菌液置于离心机内，离心，弃上清，用移液器重悬菌液；用玻璃三角棒涂布菌液于质粒相应抗性的平板上，孵箱过夜生长；该步骤是让感受态细胞在适宜的条件下生长。
13.步骤三，第二天从孵箱中取出，挑一个单克隆入一个与质粒相应抗性的肉汤培养基，加入200x的copycutterinductionsolution，利用摇床摇菌；该步骤可以将epi400转化的质粒恢复至正常产量。
14.步骤四，取出菌液并置于30％甘油中，冰箱保存，后续再次摇菌时需要划单线，挑单克隆入培养基摇菌；该步骤可以最大限度的保存且恢复菌种活力。
15.步骤五，提取质粒时采用sds碱裂解法裂解菌液，将菌液重复离心收集在离心管中，离心加入溶液p1重悬菌液，再加入溶液p2，轻柔颠倒混匀，静置；加入溶液p3后，控制ph值在6.5，上清液离心后加入内毒素清除剂冰浴离心，吸取上清后异丙醇沉淀dna；该步骤可以提取高质量的质粒
16.步骤六，将上清液过6层或8层硅胶膜柱子，用含有tris-hcl的体积75％的无水乙醇洗涤；空柱离心，用无酶水洗脱，静置，离心，重复一次。该步骤利用硅胶膜柱子特异性吸附dna的能力，达到纯化质粒的目的
17.进一步，所述步骤一中，取1μl长片段基因的质粒加入到100μl的epi400感受态细胞中，冰上静置30分钟，42℃热激45秒，冰上静置2分钟。
18.进一步，所述步骤一中，加入900μl无抗生素的肉汤培养基，摇床温度设定为37℃，速度208rpm，摇菌1小时。
19.进一步，所述步骤二中，将摇好的菌液放在离心机内，速度5000rpm离心5分钟，弃950μl的上清，37℃孵箱生长15小时30分钟。
20.进一步，所述步骤三中，挑单克隆入20ml与质粒相应抗性的lb培养基，加入copycutter induction solution 100μl，37℃摇床208rpm摇菌15小时30分钟。
21.进一步，所述步骤四中，取500μl菌液加到500μl的30％甘油中，在-20℃冰箱内放置1天后，放入-80℃冰箱长期保存。
22.进一步，所述步骤四中，使用时，利用接种针沾取菌液，在质粒相应抗性的平板上划单线，37℃孵箱生长15小时30分钟，第二天挑单克隆菌摇菌。
23.进一步，所述步骤五中，提取质粒时，将20ml菌液分成2份，每管收集10ml菌液，采用重复离心的方式，12000rpm离心1分钟收集在2ml离心管中，去除上清液。
24.进一步，所述步骤五中，加入溶液p1250μl重悬菌液，再加入溶液p2250μl，轻柔颠倒混匀7次，静置4分钟，加入250μl溶液p3后，轻柔颠倒混匀7次，同时检测上清的ph值，上清液ph值应控制在6.5，12000rpm离心10分钟后吸取上清，加入0.1倍体积的内毒素清除剂，置于冰上孵育10分钟，期间颠倒混匀，再置于42℃金属浴孵育30秒，12000rpm离心10分钟，吸取上清，上清液加入0.5倍异丙醇沉淀dna。
25.进一步，所述步骤六中，将所有上清液分别过1个6层或者8层的硅胶膜柱子，用含有tris-hcl的体积75％的无水乙醇洗涤2次，12000rpm离心1分钟，弃去下层液体，空柱12000rpm离心2分钟，用35μlph＝7的无酶水洗脱，静置1分钟，12000rpm离心1分钟，再重复一次，收集下层离心的质粒，即为纯化后的质粒。
26.结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
27.第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
28.本发明利用感受态细胞epi400将质粒完整转化，能够保证长片段基因的完整性。本发明运用经典的碱裂解法提取质粒，且注意各试剂比例加入以控制ph值达到充分裂解提高质粒浓度的目的，可以确保质粒的完整性的同时提高质粒的产量。
29.本发明使用epi400感受态细胞，其中删除了控制质粒拷贝数的pcnb基因，可以显著降低质粒的拷贝数，这样可以达到完整复制长片段dna片段的目的；配合copycutter诱导液(200x)使用，可以提高质粒拷贝数而至正常状态，同时不会影响基因dna的完整性。
30.本发明在提取质粒过程中把试剂p1-p2-p3的体积限定为250ul-250ul-250ul，同时测量局部环境的ph值，发现ph值为6.5，这一条件控制后可以充分裂解以提高质粒浓度。
31.第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：本发明能完整转化长片段基因质粒及提取高浓度的质粒。
32.第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
33.(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：
34.本发明可以使长片段基因质粒完整转化，预期可以获得完整的长片段基因，有助于在分子层面研究功能基因的机制。在质粒提取过程中注意各试剂比例加入以控制ph值以及选用硅胶模柱子吸附质粒dna可以得到高质量的dna，提高质粒dna提取效率。
35.(2)本发明的技术方案解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：
36.长片段基因质粒在转化过程中容易导致基因片段的丢失，因此本发明利用epi400感受态细胞可以实现质粒的完整转化；长片段质粒提取过程难度大，传统的sds碱裂解法的ph值不确定，导致ph值变化剧烈，那么控制提取环境的ph值可以提升质粒的提取效率，本发明可以使长片段基因质粒完整转化并且提取高浓度的质粒。
附图说明
37.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
38.图1是本发明实施例提供的长片段基因质粒转化及提取方法流程图；
39.图2是本发明实施例提供的质粒图谱；
40.图3是本发明实施例提供的利用载体的通用引物双向测序结果示意图；
41.图4是本发明实施例提供的提取出的质粒经过1％凝胶电泳结果示意图；
42.图5是本发明实施例提供的经蛋白印记法得到的显影条带示意图。
具体实施方式
43.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
44.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种长片段基因质粒转化及提取方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
45.一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
46.如图1所示，本发明实施例提供的长片段基因质粒转化及提取方法包括以下步骤：
47.s101，将长片段基因的质粒加入到epi400感受态细胞中，冰上静置，热激，再次冰上静置，加入无抗生素的肉汤培养基，利用摇床摇菌；
48.s102，将摇好的菌液置于离心机内，离心，弃上清，用移液器重悬菌液；用玻璃三角棒涂布菌液于质粒相应抗性的平板上，孵箱生长；
49.s103，第二天从孵箱中取出，挑一个单克隆入一个与质粒相应抗性的lb培养基，加入200x的copycutter induction solution，利用摇床摇菌；
50.s104，取出菌液并置于30％甘油中，冰箱保存；提取质粒时采用sds碱裂解法裂解菌液，将菌液重复离心收集在离心管中，离心；
51.s105，加入溶液p1重悬菌液，再加入溶液p2，轻柔颠倒混匀，静置；加入溶液p3后，控制ph值，上清液离心后加入内毒素清除剂，离心吸取上清再加入异丙醇沉淀dna；
52.s106，将上清液过硅胶膜柱子，用含有tris-hcl的体积75％的无水乙醇洗涤；空柱离心，用无酶水洗脱，静置，离心。
53.实施例1
54.本发明所要解决的技术问题是能完整转化长片段基因质粒及提取高浓度的质粒。
55.1.长片段基因的质粒取1μl加入到100μl的epi400感受态细胞中，冰上静置30分钟，42℃热激45秒，冰上静置2分钟，加入900μl无抗生素的肉汤培养基，摇床温度设定为37℃，速度208rpm，摇菌1小时，然后将摇好的菌液放在离心机内，速度5000rpm离心5分钟，弃950μl的上清，用移液器重悬菌液，然后用玻璃三角棒涂布菌液于质粒相应抗性的平板上，37℃孵箱生长15小时30分钟。
56.2.第二天从孵箱中取出，挑一个单克隆入一个20ml与质粒相应抗性的lb培养基，加入copycutter induction solution(200x)100μl，37℃摇床208rpm摇菌15小时30分钟。时间到后取出菌液，取500μl菌液加到500μl的30％甘油中，在-20℃冰箱内放置1天，然后放入-80℃冰箱长期保存。下一次用时用接种针沾取一些菌液，在质粒相应抗性的平板上划单线，37℃孵箱生长15小时30分钟，第二天挑单克隆菌摇菌即可。
57.3.提取质粒时采用sds碱裂解法裂解菌液，将20ml菌液分两管收集，重复离心收集在2ml离心管中，离心条件是12000rpm离心1分钟。加入溶液p1250μl重悬菌液，再加入溶液p2250μl，轻柔颠倒混匀7次，静置4分钟，加入250μl溶液p3后，ph值控制在6.5，上清液12000rpm离心10分钟后加入0.1倍体积的内毒素清除剂，置于冰上孵育10分钟，期间颠倒混匀，再置于42℃金属浴孵育30秒，12000rpm离心10分钟，吸取上清，再加入0.5倍异丙醇沉淀dna，将上清液分别过1个6层或者8层的硅胶膜柱子，用含有tris-hcl的体积75％的无水乙醇洗涤2次，最后空柱离心12000rpm2分钟，用35μl的ph＝7的无酶水洗脱，静置1分钟，12000rpm离心1分钟，再重复一次。
58.实施例2
59.1.本发明将以质粒pcmv-cubn作为实例说明，pcmv为质粒载体，搭载的长片段基因是cubn(10869bp)，质粒图谱见图2。
60.2.取1μl质粒pcmv-cubn加入到100μl的epi400感受态细胞中，冰上静置30分钟，42℃热激45秒，冰上静置2分钟，加入900μl无抗生素的肉汤培养基，摇床温度设定为37℃，速度208rpm，摇菌1小时，然后将摇好的菌液放在离心机内，速度5000rpm离心5分钟，弃950μl的上清，用移液器重悬菌液，然后用玻璃三角棒涂布菌液于质粒相应抗性的平板上，37℃孵箱生长15小时30分钟。
61.3.第二天从孵箱中取出，挑一个单克隆入一个20ml与质粒相应抗性的lb培养基，加入copycutter induction solution(200x)100μl，37℃摇床208rpm摇菌15小时30分钟。时间到后取出菌液，取500μl菌液加到500μl的30％甘油中，在-20℃冰箱内放置1天，然后放入-80℃冰箱长期保存。下一次用时用接种针沾取一些菌液，在质粒相应抗性的平板上划单线，37℃孵箱生长15小时30分钟，第二天挑单克隆菌摇菌即可。
62.4.提取质粒时采用sds碱裂解法裂解菌液，将20ml菌液分成2份，每管收集10ml重复离心的菌液，离心条件是12000rpm离心1分钟。加入溶液p1 250μl重悬菌液，再加入溶液p2 250μl，轻柔颠倒混匀7次，静置4分钟，加入250μl溶液p3后，ph值控制在6.5，上清液12000rpm离心10分钟后加入0.1倍体积的内毒素清除剂，置于冰上孵育10分钟，期间颠倒混匀，再置于42℃金属浴孵育1分钟，12000rpm离心10分钟，吸取上清，再加入0.5倍异丙醇沉淀dna，将所有上清液过1个6层或者8层的硅胶膜柱子，用含有tris-hcl的体积75％的无水乙醇洗涤2次，最后空柱离心12000rpm2分钟，用35μl的ph＝7的无酶水洗脱，静置1分钟，12000rpm离心1分钟，再重复一次。
63.二、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
64.5.提取好的质粒送基因公司测序，利用载体的通用引物cmv-f和m13r双向测序，序列比对成功，见图3。
65.6.同时将提取的质粒经nanodropone测浓度，浓度均超过1000ng/μl，且a260/a280的比值均为1.9，纯度好。
66.7.提取出来的质粒经过1％凝胶电泳，选用15000bp大小的分子标记物，分子标记物的上样量为20ng/2μl，样品取2μl上样电泳，从亮度可以判定其浓度超过1000ng/μl。
67.8.质粒转染hek293t细胞，转染48小时后收取细胞蛋白，经过经典的蛋白印迹方法，用该基因的特殊蛋白抗体检测发现其大小为400kda，判定细胞完整产生了其蛋白，证明其质粒的完整性。
68.提取出来的两个质粒上机测量浓度见表1，均超过1000ng/μl，且a260/a280的比值均为1.9，纯度评价可以。
69.表1质粒上机测量浓度
70.样品名称核酸(ng/ula260/a280a260/a230a260a280核酸系数基线矫正基线吸光度样品11326.3221.9112.67826.52613.88450340-0.028样品21664.891.9292.70133.29817.264503400.113
71.图2是本方案涉及的质粒载体是pcmv，连接的长片段dna为基因cubn(10869bp)，质粒dna全长为14392bp。
72.图3是提取出来的质粒送基因公司测序，利用载体的通用引物cmv-f和m13r双向测序，序列比对成功。
73.图4是提取出来的质粒经过1％凝胶电泳，选用15000bp大小的marker，上样量为20ng/2μl，样品取2μl上样电泳。
74.图5是经蛋白印记法得到的显影条带，大小400kda。
75.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。