一种含二萜类化合物的角果木叶提取物及其制备方法和应用

1.本发明涉及天然药物化学技术领域，具体涉及一种含二萜类化合物的角果木叶提取物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.角果木(学名：ceriops tagal(perr.)c.b.rob.)是红树科角果木属植物。角果木叶为红树科植物角果木的叶，其全年均可采，鲜用或晒干，主要用于解毒截疟。
3.现有技术对于角果木叶中的有效成分研究不够深入，研究报道较少。本发明发明人虽然前期从角果木叶中分离得到了两个具有一定抗肿瘤活性的达玛烷型三萜cereotagalol c和cereotagalol d(详见xin wu,hongbo liao,xiaohui zhu,hongyu lu,xiaobin zeng,liao cui,xiaohua lv,yanqun li and chaohua zhang.two new dammarane triterpenes from the leaves of ceriops tagal,rec.nat.prod.10:5(2016)628-632.)；但是角果木叶中是否还存在其它抗肿瘤成分，本领域技术人员是不得而知的，还需要进一步深入研究。
4.因此，以角果木叶为原料，进一步从中开发出具有抗肿瘤作用的有效部位或进一步开发出具有肿瘤作用的有效成分具有重要的应用价值。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术对于角果木叶中的抗肿瘤成分研究不足，本发明首先提供了一种含二萜类化合物的角果木叶提取物的制备方法；研究表明，由本发明所述方法制备得到的角果木叶提取物富集了大量的抗肿瘤成分，其中包括二萜类化合物；由该方法富集得到的有效成分的集合具有十分优异的抗肿瘤作用。
6.本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
7.一种含二萜类化合物的角果木叶提取物的制备方法，其包含如下步骤：
8.(1)取干燥的角果木叶用有机溶剂进行提取，提取结束后将提取液浓缩干燥得角果木叶有机溶剂提取物；
9.(2)将角果木叶有机溶剂提取物加水混悬，然后加入乙酸乙酯进行萃取，得乙酸乙酯萃取物；
10.(3)将乙酸乙酯萃取物上硅胶柱，用混合有机溶剂进行梯度洗脱，即得所述的含二萜类化合物的角果木叶提取物。
11.优选地，步骤(1)中所述的有机溶剂为丙酮。
12.研究表明，采用何种有机溶剂对角果木叶进行提取，对于制备得到的角果木叶提取物是否具有优异的抗肿瘤作用起着重要的作用；发明人经大量实验研究表明，先采用丙酮对角果木叶进行提取，可以使得后续制备得到的角果木叶提取物具有优异的抗肿瘤作用。
13.优选地，步骤(1)中角果木叶和有机溶剂的用量比为1g:8～20ml。
14.进一步优选地，步骤(1)中角果木叶和有机溶剂的用量比为1g:10～15ml。
15.最优选地，步骤(1)中角果木叶和有机溶剂的用量比为1g:15ml。
16.优选地，步骤(1)中所述的提取是指加热回流提取。
17.优选地，步骤(2)中角果木叶有机溶剂提取物与水以及乙酸乙酯的用量比为1g:30～60ml:30～60ml。
18.研究表明，在本发明中萃取步骤对于制备得到的角果木叶提取物是否具有优异的抗肿瘤作用起着重要的作用，是不可缺少的步骤；然而不经萃取步骤制备得到的角果木叶提取物其并不具有优异的抗肿瘤作用。
19.最优选地，步骤(2)中角果木叶有机溶剂提取物与水的用量比为1g:50ml:50ml。
20.优选地，步骤(3)中用混合有机溶剂进行梯度洗脱的具体条件为：
21.先用体积比为95～97：5～3的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂，再用体积比为88～90:12～10的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为88～90:12～10的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的流份浓缩干燥后即得所述的含二萜类化合物的角果木叶提取物。
22.最优选地，步骤(3)中用混合有机溶剂进行梯度洗脱的具体条件为：
23.先用体积比为96：4的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂，再用体积比为89:11的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为89:11的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的流份浓缩干燥后即得所述的含二萜类化合物的角果木叶提取物。
24.研究表明，制备方法对于制备得到的角果木叶提取物是否能够富集到大量的抗肿瘤成分起着决定性作用。制备方法不同，得到的角果木叶提取物中有效成分的种类和含量是不同的。然而采用何种方法制备得到的角果木叶提取物中能够富集到大量的抗肿瘤成分本领域技术人员是不得而知的。
25.发明人经大量实验表明：将干燥的角果木叶先用丙酮提取，然后再用乙酸乙酯萃取，最后在本发明上述硅胶柱洗脱条件下制备得到的角果木叶提取物富集了大量的抗肿瘤成分，其中包括二萜类化合物，具有十分优异的抗肿瘤作用。
26.在此，发明人需要重点指出的是，上述硅胶柱洗脱条件对于能否富集得到大量的抗肿瘤成分起着十分重要的作用，将干燥的角果木叶先用丙酮提取，然后再用乙酸乙酯萃取，只有在本发明上述硅胶柱洗脱条件下制备得到的角果木叶提取物才具备优异的抗肿瘤作用，而在其它硅胶柱洗脱条件下制备得到的角果木叶提取物远远不及在本发明所述硅胶柱洗脱条件下制备得到的角果木叶提取物，甚至不具备抗肿瘤作用。
27.由本发明所述方法制备得到的角果木叶提取物富集了大量的抗肿瘤成分，其中包括二萜类化合物；由该方法富集得到的有效成分的集合具有十分优异的抗肿瘤作用。
28.优选地，制备得到的含二萜类化合物的角果木叶提取物中含有式ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、
ⅴ
所示结构的二萜类化合物；
29.30.发明人进一步从上述角果木叶提取物中分离得到了上述5种二萜类化合物，说明本发明中所述的角果木叶提取物含有二萜类成分。上述5中二萜类化合物的核磁图谱见说明书附图。
31.本发明还提供了一种上述含二萜类化合物的角果木叶提取物的制备方法制备得到的含二萜类化合物的角果木叶提取物。
32.本发明还提供了一种含二萜类化合物的角果木叶提取物在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用。
33.优异效果：本发明首先提供了一种全新的含二萜类化合物的角果木叶提取物的制备方法；研究表明，由本发明所述方法制备得到的角果木叶提取物富集了大量的抗肿瘤成分，其中包括二萜类化合物；由该方法制备得到的含二萜类化合物的角果木叶提取物具有十分优异的抗肿瘤作用。
附图说明
34.图1为式ⅰ所示结构的二萜类化合物的1h-nmr图谱。
35.图2为式ⅰ所示结构的二萜类化合物的13c-nmr图谱。
36.图3为式ⅱ所示结构的二萜类化合物的1h-nmr图谱。
37.图4为式ⅱ所示结构的二萜类化合物的13c-nmr图谱。
38.图5为式ⅲ所示结构的二萜类化合物的1h-nmr图谱。
39.图6为式ⅲ所示结构的二萜类化合物的13c-nmr图谱。
40.图7为式ⅳ所示结构的二萜类化合物的1h-nmr图谱。
41.图8为式ⅳ所示结构的二萜类化合物的13c-nmr图谱。
42.图9为式
ⅴ
所示结构的二萜类化合物的1h-nmr图谱。
43.图10为式
ⅴ
所示结构的二萜类化合物的13c-nmr图谱。
具体实施方式
44.以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
45.实施例1含二萜类化合物的角果木叶提取物的制备
46.(1)取干燥的角果木叶用丙酮进行加热回流提取2h，提取结束后将提取液浓缩干燥得角果木叶丙酮提取物；其中，角果木叶和丙酮的用量比为1g:15ml；
47.(2)将角果木叶丙酮提取物加水混悬，然后加入乙酸乙酯进行萃取，将萃取液浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取物；其中，角果木叶丙酮提取物与水以及乙酸乙酯的用量比为1g:30ml:30ml；
48.(3)将乙酸乙酯萃取物上硅胶柱(硅胶中的硅胶填料的为200-300目的硅胶，其用量为乙酸乙酯萃取物重量的30倍)，先用3倍柱体积的体积比为96:4的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂，再用5倍柱体积的体积比为89:11的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为89:11的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的流份浓缩干燥后即得所述的含二萜类化合物的角果木叶提取物。
49.实施例2含二萜类化合物的角果木叶提取物的制备
50.(1)取干燥的角果木叶用丙酮进行加热回流提取1h，提取结束后将提取液浓缩干燥得角果木叶丙酮提取物；其中，角果木叶和丙酮的用量比为1g:20ml；
51.(3)将角果木叶丙酮提取物加水混悬，然后加入乙酸乙酯进行萃取，将萃取液浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取物；其中，角果木叶丙酮提取物与水以及乙酸乙酯的用量比为1g:50ml:50ml；
52.(3)将乙酸乙酯萃取物上硅胶柱(硅胶中的硅胶填料的为200-300目的硅胶，其用量为乙酸乙酯萃取物重量的30倍)，先用3倍柱体积的体积比为95:5的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂，再用5倍柱体积的体积比为88:12的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为88:12的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的流份浓缩干燥后即得所述的含二萜类化合物的角果木叶提取物。
53.实施例3含二萜类化合物的角果木叶提取物的制备
54.(1)取干燥的角果木叶用丙酮进行加热回流提取1.5h，提取结束后将提取液浓缩干燥得角果木叶丙酮提取物；其中，角果木叶和丙酮的用量比为1g:8ml；
55.(2)将角果木叶丙酮提取物加水混悬，然后加入乙酸乙酯进行萃取，将萃取液浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取物；其中，角果木叶丙酮提取物与水以及乙酸乙酯的用量比为1g:60ml:60ml；
56.(3)将乙酸乙酯萃取物上硅胶柱(硅胶中的硅胶填料的为200-300目的硅胶，其用量为乙酸乙酯萃取物重量的30倍)，先用3倍柱体积的体积比为97:3的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂，再用5倍柱体积的体积比为90:10的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为90:10的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的流份浓缩干燥后即得所述的含二萜类化合物的角果木叶提取物。
57.对比例1含二萜类化合物的角果木叶提取物的制备
58.(1)取干燥的角果木叶用体积分数为95％的乙醇进行加热回流提取2h，提取结束后将提取液浓缩干燥得角果木叶乙醇提取物；其中，角果木叶和乙醇的用量比为1g:15ml；
59.(2)将角果木叶乙醇提取物加水混悬，然后加入乙酸乙酯进行萃取，将萃取液浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取物；其中，角果木叶乙醇提取物与水以及乙酸乙酯的用量比为1g:30ml:30ml；
60.(3)将乙酸乙酯萃取物上硅胶柱(硅胶中的硅胶填料的为200-300目的硅胶，其用量为乙酸乙酯萃取物重量的30倍)，先用3倍柱体积的体积比为96:4的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂，再用5倍柱体积的体积比为89:11的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为89:11的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的流份浓缩干燥后即得所述的含二萜类化合物的角果木叶提取物。
61.对比例1与实施例1的区别在于，对比例1步骤(1)中采用了体积分数为95％的乙醇进行提取，然后再经乙酸乙酯萃取和硅胶柱层析制备含二萜类化合物的角果木叶提取物。而实施例1步骤(1)中则是采用丙酮进行提取，然后再经乙酸乙酯萃取和硅胶柱层析制备含二萜类化合物的角果木叶提取物。
62.对比例2含二萜类化合物的角果木叶提取物的制备
63.(1)取干燥的角果木叶用丙酮进行加热回流提取2h，提取结束后将提取液浓缩干燥得角果木叶丙酮提取物；其中，角果木叶和丙酮的用量比为1g:15ml；
64.(2)将丙酮提取物上硅胶柱(硅胶中的硅胶填料的为200-300目的硅胶，其用量为丙酮提取物重量的30倍)，先用3倍柱体积的体积比为96:4的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂，再用5倍柱体积的体积比为89:11的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为89:11的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的流份浓缩干燥后即得所述的含二萜类化合物的角果木叶提取物。
65.对比例2与实施例1的区别在于，对比例2直接将丙酮提取物上硅胶柱制备含二萜类化合物的角果木叶提取物，不经过萃取步骤。而实施例1则是将丙酮提取物先经萃取得到乙酸乙酯萃取物，然后再上硅胶柱制备含二萜类化合物的角果木叶提取物。
66.对比例3含二萜类化合物的角果木叶提取物的制备
67.(1)取干燥的角果木叶用丙酮进行加热回流提取2h，提取结束后将提取液浓缩干燥得角果木叶丙酮提取物；其中，角果木叶和丙酮的用量比为1g:15ml；
68.(2)将角果木叶丙酮提取物加水混悬，然后加入乙酸乙酯进行萃取，将萃取液浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取物；其中，角果木叶丙酮提取物与水以及乙酸乙酯的用量比为1g:30ml:30ml；
69.(3)将乙酸乙酯萃取物上硅胶柱(硅胶中的硅胶填料的为200-300目的硅胶，其用量为乙酸乙酯萃取物重量的30倍)，先用3倍柱体积的体积比为99:1的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂，再用5倍柱体积的体积比为95:5的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为95:5的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的流份浓缩干燥后即得所述的含二萜类化合物的角果木叶提取物。
70.对比例3与实施例1的区别在于，硅胶柱的洗脱条件不同；对比例3将制备得到的乙酸乙酯萃取物先用体积比为99:1的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂，再用体积比为95:5的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱。而实施例1则是先用体积比为96:4的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂，再用体积比为89:11的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱。
71.对比例4含二萜类化合物的角果木叶提取物的制备
72.(1)取干燥的角果木叶用丙酮进行加热回流提取2h，提取结束后将提取液浓缩干燥得角果木叶丙酮提取物；其中，角果木叶和丙酮的用量比为1g:15ml；
73.(2)将角果木叶丙酮提取物加水混悬，然后加入乙酸乙酯进行萃取，将萃取液浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取物；其中，角果木叶丙酮提取物与水以及乙酸乙酯的用量比为1g:30ml:30ml；
74.(3)将乙酸乙酯萃取物上硅胶柱(硅胶中的硅胶填料的为200-300目的硅胶，其用量为乙酸乙酯萃取物重量的30倍)，先用3倍柱体积的体积比为90:10的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂，再用5倍柱体积的体积比为85:15的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为85:15的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的流份浓缩干燥后即得所述的含二萜类化合物的角果木叶提取物。
75.对比例4与实施例1的区别在于，硅胶柱的洗脱条件不同；对比例4将制备得到的乙酸乙酯萃取物先用体积比为90:10的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂，再用体积比为85:15的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱。而实施例1则是先用体积比为96:4的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱除杂，再用体积比为89:11
的氯仿和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱。
76.实验例含二萜类化合物的角果木叶提取物抗肝癌活性测试
77.取人肝癌细胞bel-7404于rpmi 1640培养基中培养，癌细胞以1.5
×
104每孔加入96孔板中，放入培养箱中，在37℃含5％co2的条件下培养24小时，接着吸去培养基。然后实验组加入含有0.01～100μg/ml待测提取物的rpmi 1640培养基，空白组加入不含提取物的等量的rpmi 1640培养基；加入培养基后继续培养48h；接着加入mtt(浓度为5mg/ml)，培养4h后，吸去上清液，加入100μl dmso，在暗处放置15min后用酶标仪于570nm下测定吸光值。根据吸光值计算细胞存活情况，每个处理设6个重复孔。
78.细胞存活率(％)＝δod
药物处理组
/δod
空白组
×
100；再根据剂量效应曲线计算细胞半抑制浓度(ic
50
)，实验结果见表1。
79.测试的提取物为实施例1～3以及对比例1～4制备得到的含二萜类化合物的角果木叶提取物。
80.表1.含二萜类化合物的角果木叶提取物抗肝癌活性测试结果
[0081][0082][0083]
从表1数据中可以看出，实施例1～3制备得到的含二萜类化合物的角果木叶提取物其对肝癌细胞的ic
50
小于2.29μg/ml，其中实施例1最佳为1.35μg/ml；这说明：将干燥的角果木叶先用丙酮提取，然后再用乙酸乙酯萃取，最后在本发明所述硅胶柱洗脱条件下制备得到的角果木叶提取物富集了大量的肝癌成分，具有十分优异的抗肝癌作用。
[0084]
从表1数据中还可以看出，对比例1制备得到的含二萜类化合物的角果木叶提取物其对肝癌细胞的ic
50
为19.38μg/ml，远远大于实施例1的1.35μg/ml；这表明实施例1制备得到的含二萜类化合物的角果木叶提取物其效果远远优于对比例1。这说明：将干燥的角果木叶先用丙酮提取，然后再用乙酸乙酯萃取，最后在本发明上述硅胶柱洗脱条件下制备得到的角果木叶提取物其抗肝癌作用要远远好于先用乙醇提取，然后再用乙酸乙酯萃取，最后在本发明上述硅胶柱洗脱条件下制备得到的角果木叶提取物。
[0085]
从表1数据中还可以看出，对比例2制备得到的含二萜类化合物的角果木叶提取物其对肝癌细胞的ic
50
为22.43μg/ml，远远大于实施例1的1.35μg/ml；这表明实施例1制备得到的含二萜类化合物的角果木叶提取物其效果远远优于对比例2。这说明：必须将干燥的角
果木叶先用丙酮提取，然后再用乙酸乙酯萃取，最后在本发明上述硅胶柱洗脱条件下制备得到的角果木叶提取物才具有十分优异的抗肝癌作用。而将干燥的角果木叶用丙酮提取后，不经乙酸乙酯萃取，直接在本发明上述硅胶柱洗脱条件下制备得到的角果木叶提取物并不具有十分优异的抗肝癌作用。
[0086]
从表1数据中还可以看出，对比例3和4制备得到的含二萜类化合物的角果木叶提取物其对肝癌细胞的ic
50
分别为46.79和35.12μg/ml，远远大于实施例1的1.35μg/ml；这表明实施例1制备得到的含二萜类化合物的角果木叶提取物其效果远远优于对比例3和4。这说明：本发明所述硅胶柱洗脱条件对于能否富集得到大量的抗肿瘤成分起着十分重要的作用，将干燥的角果木叶先用丙酮提取，然后再用乙酸乙酯萃取后，只有在本发明上述硅胶柱洗脱条件下制备得到的角果木叶提取物才具备优异的抗肝癌作用，而在其它硅胶柱洗脱条件下制备得到的角果木叶提取物远远不及在本发明所述硅胶柱洗脱条件下制备得到的角果木叶提取物。