用于组织快速裂解的声流体器件及自动化裂解与活检装置

1.本发明涉及生物技术领域，特别地涉及用于组织快速裂解的声流体器件及自动化裂解与活检装置。


背景技术：

2.将生物组织快速有效裂解为单细胞悬液不仅是生物科研实验中必不可少的一部分，也是医学临床领域中的关键问题。在生物实验中，常常会用到流式细胞仪对组织中的细胞进行鉴别、统计和参数分析，而决定流式细胞仪是否分析准确的关键因素在于输入的单细胞悬液质量，因此在组织裂解过程中科研人员会追求细胞产量高、裂解速度快、细胞损伤小、细胞活性强的裂解方式。在临床中，术中快速检测的需求日益增加，相关的研究也在逐步推进，在基于单细胞的检测手段中一个方便快速的样本前处理方法可以在保证细胞高活性和高分散性的前提下极大程度的缩短整体检测时间，提高检测效率。
3.目前传统方法多通过酶解法、物理机械法来对组织标本进行处理制备单细胞悬液，普遍存在消化时间过长或对组织机械损伤大且细胞分散效果差的问题。其中酶解法通过破坏组织间胶原纤维、细胞间的连接蛋白、多糖物质来裂解组织，较物理机械法大大减小了对细胞的物理损伤，但存在消化过程慢、酶影响细胞活性等问题。因此操作过程中经常伴随摇床使用，起到震荡混匀组织的目的，但消化过程普遍仍需要1h～2h(不同类型和大小的组织块会影响消化所用时间)，且对操作人员的技术有一定要求，耗时耗力，无法满足快速裂解制备单细胞的需要。
4.摇床酶解法的缺点如下：(1)摇床在消化中起到震荡混匀组织的作用，但整体消化时间仍过长，细胞长时间浸泡在酶溶液中很容易造成细胞活性降低甚至死亡的问题。(2)从操作步骤中可以看出，摇床酶解法操作步骤多、工作量大，很难短时间内完成，且所有步骤均需在无菌环境下手动操作，对操作者的熟练度和操作经验要求高，若不熟练很容易造成染菌、过度消化导致细胞活性下降等问题。
5.机械法是通过机械接触或液体产生的切割力对组织块进行切割和冲散，使细胞脱落和分离。主要方法有切割、筛网挤压、注射器或吸管吹打。机械法的缺点如下：机械法虽然操作步骤相较酶解法简单，但由于其原理是使用切割力强制打破组织内细胞间的连接，因此细胞在这一过程中极易死亡和破碎，细胞存活率远低于酶解法，需要大量的组织样本支撑才可以获取足够数量的活细胞。


技术实现要素：

6.为了弥补以上领域的不足，本发明的主要目的是提供用于组织快速裂解的声流体器件及自动化裂解与活检装置，有助于快速简单的将组织裂解为单细胞悬液，同时不损伤细胞，保证细胞的高活性和分散性，并支持快速细胞活检、癌细胞筛查。
7.本发明所提供的用于组织快速裂解的声流体器件，包括：声流体芯片100、pcb板200、管壳300、rf连接线400；其中，
8.所述声流体芯片100设置在所述pcb板200的正面，声流体芯片100的信号端和pcb板200正面的信号端相连，声流体芯片100的接地端和pcb板200的接地端相连；所述管壳300套在所述rf连接线400上；rf连接线400中靠近pcb板200的一端伸出两条线分别为信号线和地线，分别与pcb板200背面的信号端和接地端相连，形成功率传输的通路。
9.优选地，所述声流体芯片100为表面声波谐振器芯片、体声波谐振器芯片或压电陶瓷芯片。
10.进一步优选地，所述体声波谐振器芯片为固体装配型体声波谐振器芯片；所述固体装配型体声波谐振器的谐振频率范围是1ghz～10ghz，施加功率范围是0.1w～10w。谐振器压电层形状可为圆形、五边形、方形、三角形、多边形等。固体装配型体声波谐振器芯片长宽高尺寸为0.1mm*0.1mm*0.5mm～3cm*3cm*0.5mm。
11.更优选地，所述固体装配型体声波谐振器的谐振频率为2.49ghz，施加功率为2w，谐振器压电层形状为五边形。
12.本发明使用的是smr芯片，但其实并非仅限于此，baw(bulk acoustic wave)谐振器(smr属于baw谐振器)，saw(surface acoustic wave resonator)，pzt(piezoelectric)等压电谐振器件均可实现此操作。
13.该封装方式下，smr芯片长宽高尺寸为0.1mm*0.1mm*0.5mm～3cm*3cm*0.5mm(阵列谐振器，增大处理面积)。一片芯片上的谐振器个数范围为1～100个。
14.该封装方式下，为适配芯片尺寸，pcb板长宽高尺寸为1mm*1mm*0.3mm～4cm*4cm*0.3mm。管壳(300)为圆柱形空心管，管内径为1～3mm，管外径为5～10mm，管长度为3cm～20cm。rf连接线(400)长度为3cm～20cm。
15.优选地，所述声流体芯片100封装固定在所述pcb板200的正面。
16.优选地，所述声流体芯片100的信号端和pcb板200正面的信号端通过中间的一根金线相连，所述声流体芯片100的接地端和pcb板200的接地端通过左右两根金线相连。
17.本发明还提供了用于组织快速裂解的自动化裂解与活检装置。
18.本发明所提供的用于组织快速裂解的自动化裂解与活检装置，包括箱体11，箱体11内分别设置4根竖管，依次为进液管12、进样管13、出样管14、废液管15，注液管1伸入进液管12内；进样管13的上端设置简易xy轴位移台3，xy轴位移台用于固定声流体器件4的上部，声流体器件4的下部伸入进样管13中；出液管5伸入出样管14内；废液管6伸入废液管15内；进液管12、进样管13、出样管14、废液管15底部通过横向弯管16连通，横向弯管16内分别设置滤膜7、滤膜8、滤膜9和滤膜10，其中滤膜7设置在进液管12和进样管13之间；滤膜8和滤膜9设置在进样管13、出样管14之间；滤膜10设置在出样管14和废液管15之间；所述箱体11内的底部在对应于所述声流体器件4的位置设置有裂解腔室17，在对应于所述出样管14的位置设置有观察腔室18。
19.优选地，所述注液管1、出液管5、废液管6的管径直径为1～10mm，用于注入酶溶液和培养液；所述进液管12、进样管13、出样管14、废液管15的管径直径为10mm～30mm；裂解腔室17为上底面直径5～30mm、下底面直径1～10mm、深度5～30mm的倒圆锥形腔室；观察腔室18为管径5～30mm、深度5～30mm的圆柱形腔室。
20.优选地，所述滤膜7、滤膜10为5～10μm滤膜，滤膜8为70～100μm滤膜，滤膜9为30～50μm滤膜。
21.本发明还提供了一种组织裂解方法。
22.本发明所提供的组织裂解方法，包括如下步骤：
23.(1)将待裂解组织放入所述的用于组织快速裂解的自动化裂解与活检装置的进样管中，位移台调整声流体器件位置至正对待裂解组织块；
24.(2)从注液管1通入酶溶液，将所述待裂解组织块和声流体器件浸没于溶液中；
25.(3)开启所述声流体器件，待所述组织块旋绕至声涡旋中加速酶解反应的进程，持续作用10～20min；
26.(4)过滤及置换酶溶液，从注液管1注入培养液的同时从废液管6吸出溶液，持续循环2～5min，原本的管腔内的酶溶液会被置换为细胞培养液；
27.(5)开启出液管5，吸出滤膜9、滤膜10之间的单细胞悬液。
28.本发明还提供了一种组织活检方法。
29.本发明所提供的组织活检方法，包括如下步骤：
30.(1)将待裂解组织放入所述的用于组织快速裂解的自动化裂解与活检装置的进样管中，位移台调整声流体器件位置至正对待裂解组织块；
31.(2)从注液管1通入酶溶液和荧光特异性抗体的混合溶液，将所述待裂解组织块和声流体器件浸没于溶液中；
32.(3)开启所述声流体器件，待所述组织块旋绕至声涡旋中加速酶解反应和抗原抗体结合，持续作用10～20min；
33.(4)过滤及置换酶溶液和荧光特异性抗体的混合溶液，从注液管1注入培养液的同时从废液管6吸出溶液，持续循环2～5min，原本的管腔内的混合溶液会被置换为细胞培养液；
34.(5)结合倒置荧光显微镜通过观察腔室18观察单细胞形态与荧光染色结果，通过有无荧光及荧光的强度判断是否有目标种类细胞及细胞的占比。
35.本发明有以下有益效果：
36.1、本发明利用声流体器件加速酶解反应的进程，缩短了组织裂解的时间，保证了细胞的高活性、高分散性，解决了传统方法裂解时间长、细胞活性差、细胞死亡率高、细胞获取率低等问题。
37.2、本发明设计了操作简便的自动化与活检装置，减少了人工操作，降低了操作难度，大大简化操作步骤。缩短了制备单细胞悬液的时间，减小了操作不规范导致的污染等问题。适合用在科研实验中需要快速获取单细胞悬液和临床中需要快速细胞活检或癌细胞筛查的应用中。
附图说明
38.为了说明而非限制的目的，现在将根据本发明的优选实施例、特别是参考附图来描述本发明，其中：
39.图1为本发明的用于组织快速裂解的声流体器件示意图；其中，100-声流体芯片，200-pcb板，300-管壳，400-rf连接线。
40.图2为smr芯片的层叠结构示意图。
41.图3为smr消化原理图。
42.图4为本发明的用于组织快速裂解的自动化裂解与活检装置示意图；其中，1-注液管，2-管口盖，3-xy轴位移台，4-声流体器件，5-出液管，6-废液管，7-滤膜，8-滤膜，9-滤膜，10-滤膜，11-箱体，12-进液管，13-进样管，14-出样管，15-废液管，16-横向弯管，17-裂解腔室，18-观察腔室。
43.图5为本发明的用于组织快速裂解的自动化裂解与活检装置三维图。
44.图6为两种裂解方式后原代细胞培养情况，其中a为摇床组裂解出的细胞，b为smr组裂解出的细胞。
45.图7为分别用摇床和裂解装置处理后细胞数量和细胞增长率。
46.图8为5种不同处理条件下分别对30mg肾肿瘤组织进行裂解的结果。
47.图9为倒置荧光显微镜下观察腔室18中两个不同位置处荧光染色结果。
具体实施方式
48.参考图1，示出了本发明的用于组织快速裂解的声流体器件。其中100为smr芯片，尺寸(长、宽、高)0.8mm*0.5mm*0.5mm。200为薄pcb板，尺寸(长、宽、高)3mm*3mm*0.3mm。100和200之间通过3根金线连接，smr的信号端与pcb板正面信号端相连(中间一根金线)，接地端也相连(左右两根金线)。300为管壳，材质为铜的空心圆柱，内径2mm，外径3mm。400为rf连接线，线直径1.3mm，端部伸出两条线分别为信号线与地线。管壳300套在rf连接线400上，rf连接线400中靠近pcb板200的端部伸出两条线，分别与pcb板200背面的两个焊点(信号端和接地端)对应用焊锡进行焊接。该封装形成了smr芯片的信号功率传输通路，rf连接线400连接信号发生器即可驱动smr器件工作。
49.薄pcb板在该声流体器件中起到转接作用，一侧连接smr芯片(金线连接)，另一侧连接rf线(焊锡连接)，因为smr芯片尺寸小、其上的电极也小，无法直接连接rf线去施加功率。
50.smr芯片通过ab胶粘接至pcb板上指定位置，两者连接稳固。
51.smr地-pcb地-rf线地相连。smr信号-pcb信号-rf信号相连。
52.rf线材质较软，容易弯曲，会导致结构不稳定器件位置调整困难等问题，因此加工硬质管壳套在rf线上，稳固连接。
53.先将管壳300套在rf连接线400上，并在管壳300和rf连接线400连接末端(smr接头处)使用ab胶进行粘接。
54.rf连接线400端部两根线分别为信号线和地线，薄pcb板200背面两个焊点对应smr芯片的信号端和接地端，焊接目的为导通这一通路。图1上的六边形及后面的螺纹是smr接头，属于rf连接线的一部分。
55.该封装形成了smr芯片的信号功率传输通路，通过pcb板和rf连接线的连接导通方式，使信号发生器的正弦波信号得以传输至芯片，驱动其工作。信号发生器驱动其工作的具体原理为：压电材料基于逆压电效应，将作用于电极上的以特定频率变化的正弦电压(信号发生器提供的ghz正弦信号)转化为压电薄膜aln的机械形变。这种交变电信号导致的周期性的形变会在压电薄膜aln内产生一种沿膜厚度方向传播的体声波，即特超声波。因使用了布拉格反射层结构，特超声波分别在上电极与空气接触处和下电极与布拉格反射层界面处发生全反射，从而产生与原传播方向相反的声波，进一步叠加形成驻波，发生谐振。而特超
声波在液体中传播时，会引发声流体效应，声流体效应即为体声波在液体中传播衰减而引发的一种非线性的流体效应。从表现上看会形成向前喷射的射流及回旋形成的涡流。
56.该封装目的为：(1)设计为插入式器件，减小封装尺寸，可以深入管道或腔体中进行工作。(2)方便夹持，配合位移台可完成精密操控。
57.rf连接线作用为传输功率，其一端为sma接头，可与信号发生器伸出的sma接头传输线相连。
58.smr芯片的层叠结构如图2所示，由硅基底、mo和sio2形成的布拉格反射层、底电极mo、压电层aln、顶电极mo和金电极构成。
59.如图3所示，本发明的声流体器件中的smr芯片(千兆赫兹体声波谐振器)可以产生的强射流力和强剪切力对新鲜组织进行裂解，利用千兆赫兹超声波产生的声压场推动酶溶液形成声流体涡旋，将组织块旋转捕捉在涡旋中，进行层层的间质消化和细胞剥离。射流力冲击组织块，加速了酶在固液介质间的扩散，增大组织的表面积，加快了间质的水解速度。剪切力快速将水解后产物剥离出组织表面，暴露出更深层的间质，提供更多酶的结合位点。同时，声流体涡旋还可增加荧光抗体与细胞膜表面抗原的碰撞几率，促进抗原抗体结合，加快免疫荧光染色的进程。使用本发明的声流体器件对组织标本进行处理，与传统裂解方法相比大大加快了裂解速率，可以将组织快速裂解为单细胞悬液，并且能够保持细胞活性。且声流体器件可同时加速组织裂解与抗原抗体染色过程，仅需10～30min即可将组织块制备为免疫荧光染色过的单细胞悬液，推动了面向临床应用的液体活检、癌细胞检测的发展。
60.参考图4和图5，示出了本发明的用于组织快速裂解的自动化裂解与活检装置。1为注液管，管径1～10mm，用于注入酶溶液和培养液。2为管口盖，用于固定注液管1并防止杂物落入装置内，下端为胶塞，密封管道。3为简易xy轴位移台，用于调整4(smr器件)的位置，便于对准组织块，采用透明树脂3d打印制成。4为上述声流体器件，即smr器件。5为出液管，用于在裂解结束后抽出单细胞悬液。6为废液管，用于吸出多余废液和置换酶溶液。注液管1、出液管5、废液管6均连接蠕动泵用于注入或抽出液体。7、8、9、10均为滤膜，用于过滤细胞，常见细胞尺寸一般在10～20μm。滤膜7、滤膜10为5～10μm滤膜，滤膜8为70～100μm滤膜，滤膜9为30～50μm滤膜。滤膜7、滤膜8将组织块限制在一定范围内进行裂解，裂解后的单细胞无法通过滤膜7、滤膜10，但可以通过滤膜8、滤膜9，滤膜8、滤膜9也限制了细胞团簇的通过，因此单细胞会存在滤膜9、滤膜10之间。11为装置箱体，其中的管道通路如图所示，管径均为15mm。箱体材料为pmma。箱体上设置了4个开口，管道通路均包含在箱体内。17为上底面直径5～30mm、下底面直径1～10mm、深度5～30mm的倒圆锥形裂解腔室。，将组织块放入腔室内，声流体器件移动对准、伸入腔室内对组织块进行快速裂解。18为管径5～30mm、深度5～30mm的圆柱形观察腔室。单细胞悬液位于出样管14后，可结合倒置显微镜从观察腔室底面对细胞形态和荧光染色进行在线观察。
61.简易xy轴位移台通过夹持的方式对器件进行固定，位移台有一个夹持孔，将器件穿过该孔，转动螺丝将孔紧固缩小，夹持住器件的末端(远离smr芯片端)。
62.如图4所示，本发明的用于组织快速裂解的自动化裂解与活检装置，包括箱体11，箱体11内分别设置4根竖管，依次为进液管12、进样管13、出样管14、废液管15，注液管1伸入进液管12内；进样管13的上端设置简易xy轴位移台3，xy轴位移台用于固定声流体器件4的上部，声流体器件4的下部伸入进样管13中；出液管5伸入出样管14内；废液管6伸入废液管
15内；进液管12、进样管13、出样管14、废液管15底部通过横向弯管16连通，横向弯管16内分别设置滤膜7、滤膜8、滤膜9和滤膜10，其中滤膜7设置在进液管12和进样管13之间；滤膜8和滤膜9设置在进样管13、出样管14之间；滤膜10设置在出样管14和废液管15之间。箱体11内的底部在对应于声流体器件4的位置设置有裂解腔室17，在对应于所述出样管14的位置设置有观察腔室18。
63.实施例1、组织快速裂解
64.本发明的用于组织快速裂解的自动化裂解与活检装置的操作流程如下：
65.①
清洗：使用青霉素(浓度400u/ml)、链霉素(浓度0.4mg/ml)的dmem培养液浸泡组织15min，在培养液下用手术刀将新鲜肾肿瘤组织块切碎为大小1mm*1mm的小块，用d-hanks浸泡清洗组织2～3次。新鲜肾肿瘤组织的来源为医科大学第二医院提供的人肾肿瘤，大小约为5*5*5mm的小块，质量约为100mg。
66.②
消化：
67.1、将组织块从进样管13放入裂解腔室17，位移台调整smr器件位置至正对组织块，距离1cm以内。
68.具体为：通过进样管13上面的开口将组织块放入进样管13，先将组织块放入，再将声流体器件夹持在位移台上，伸入进样管13调整位置进行处理。
69.2、从注液管1通入适量酶溶液，将组织块和smr器件浸没于溶液中。
70.3、开启smr器件，信号发生器输出2.49ghz的正弦信号，功率调整至2w，待组织块旋绕至声涡旋中加速酶解反应的进程，持续作用15min。
71.4、过滤及置换酶溶液，从注液管1注入培养液的同时从废液管6吸出溶液，细胞会顺着流体方向通过滤膜8和滤膜9两层滤膜(滤除未消化完全的组织及细胞团簇)，细胞碎片会随着流体通过滤膜10并随着废液被吸出。持续循环3min，原本的管腔内的酶溶液会被置换为细胞培养液。
72.5、开启出液管5，吸出滤膜9、滤膜10之间的单细胞悬液。
73.对照实验：
74.摇床酶解法，具体方法如下：
75.①
灭菌：使用青霉素(浓度400u/ml)链霉素(浓度0.4mg/ml)的dmem培养液浸泡组织15min。
76.②
剪切：在培养液下用锋利的手术刀将新鲜肾肿瘤组织块切碎为大小1mm*1mm的小块。
77.③
清洗：用d-hanks或pbs等缓冲液浸泡清洗组织2～3次。
78.④
消化：在离心管中加入酶溶液(类型和浓度视组织类型而定)，将组织块放入离心管中，用摇床在37
°
恒温下对组织进行震荡混匀处理，摇床消化时间按照标准操作1～2小时进行消化(根据组织消化情况决定消化时间，组织呈蓬松絮状时即可)。
79.⑤
离心：处理结束后进行离心力为200g时间为5min的快速离心，离心后吸取上方的酶溶液，置换为培养液。整个离心流程重复三次，确保酶溶液完全去除。
80.⑥
过滤：用适量培养基反复吹打使细胞充分散开，用细胞滤网过滤细胞，去除未消化完全的组织和大块杂质。
81.仅用酶的对照实验，具体方法如下：
82.①
灭菌：使用青霉素(浓度400u/ml)链霉素(浓度0.4mg/ml)的dmem培养液浸泡组织15min。
83.②
剪切：在培养液下用锋利的手术刀将新鲜肿瘤组织块切碎为大小1mm*1mm的小块。
84.③
清洗：用d-hanks或pbs等缓冲液浸泡清洗组织2～3次。
85.④
消化：在离心管中加入酶溶液(类型和浓度视组织类型而定)，将组织块放入离心管中，在37
°
恒温下静置消化1～2小时。
86.无酶+摇床的对照实验，具体方法如下：
87.①
灭菌：使用青霉素(浓度400u/ml)链霉素(浓度0.4mg/ml)的dmem培养液浸泡组织15min。
88.②
剪切：在培养液下用锋利的手术刀将新鲜肿瘤组织块切碎为大小1mm*1mm的小块。
89.③
清洗：用d-hanks或pbs等缓冲液浸泡清洗组织2～3次。
90.④
消化：在离心管中加入细胞培养液(根据组织类型而定)，将组织块放入离心管中，用摇床在37
°
恒温下对组织进行震荡混匀处理1～2小时。
91.无酶+声流体裂解装置的对照实验，具体方法如下：
92.①
清洗：使用青霉素(浓度400u/ml)、链霉素(浓度0.4mg/ml)的dmem培养液浸泡组织15min，在培养液下用手术刀将新鲜肿瘤组织块切碎为大小1mm*1mm的小块，用d-hanks浸泡清洗组织2～3次。
93.②
消化：
94.1、将组织块从进样管13放入裂解腔室17，位移台调整smr器件位置至正对组织块，距离1cm以内。
95.具体为：通过进样管13上面的开口将组织块放入进样管13，先将组织块放入，再将声流体器件夹持在位移台上，伸入进样管13调整位置进行处理。
96.2、从注液管1通入适量细胞培养液，将组织块和smr器件浸没于溶液中。
97.3、开启smr器件，信号发生器输出2.49ghz的正弦信号，功率调整至2w，持续作用15min。
98.用传统摇床酶解法和本发明的自动化裂解与活检装置分别对同一来源、同样大小质量的新鲜肾肿瘤组织进行裂解，结果如图6所示，实验验证了本发明的自动化裂解与活检装置裂解出的的单细胞悬液已成功完成原代培养，仅需15min裂解下细胞的数量就达到了摇床组1h15min才能裂解出的量，且根据同一位点处细胞11天生长情况照片的处理结果(两组都随机选取5个位点进行1-11天的拍摄)来看，其每天的细胞总数略高于摇床组，细胞的分裂速度基本持平。本发明的自动化裂解与活检装置在保证细胞活性的前提下相对传统方法提高了4～5倍的裂解速度，展现了其在组织快速裂解制备单细胞悬液应用上的可行性。
99.图7左图显示了，分别用摇床和裂解装置处理后细胞数量随天数的变化结果，统计来源为图6中的拍照结果，拍照视野范围为2500*1900μm，培养瓶底部随机选取5个位置，记录每天每组的细胞数量，取5点的均值为最终结果。可以看出对相同质量的组织，裂解装置处理后的细胞数量更多。图7右图显示了每隔两天的周期细胞的增长率，裂解装置组和摇床组在各周期的增长速率几乎持平，证明裂解装置相较传统解离方法并没有降低细胞的活性
也没有抑制其正常分裂，但却有明显的裂解速度优势。
100.图8为5种不同处理条件下分别对30mg肾肿瘤组织进行裂解，处理过程中每隔一段时间对溶液采样50ul，钙黄绿素染色后进行拍照计数，统计不同消化时间裂解出的单细胞数量。后对数据进行统计分析、曲线拟合，绘制不同处理条件下细胞数量随处理时间的变化曲线和裂解速率随处理时间的变化曲线。从图8可见，本发明的自动化裂解装置可以加速酶对组织块的消化过程，裂解效率远远大于其他方式。
101.实施例2、组织活检
102.本发明的用于组织活检的自动化裂解与活检装置的操作流程如下：
103.①
清洗：使用青霉素(浓度400u/ml)链霉素(浓度0.4mg/ml)的dmem培养液浸泡组织15min，在培养液下用手术刀将新鲜肾肿瘤组织块切碎为大小1mm*1mm的小块，用d-hanks浸泡清洗组织2～3次。新鲜肾肿瘤组织的来源为医科大学第二医院提供的人肾肿瘤，大小约为5*5*5mm的小块，质量约为100mg。
104.②
消化：
105.1、将组织块从进样管13放入裂解腔室17，位移台调整smr器件位置至正对组织块，距离1cm以内。
106.2、从注液管1通入适量酶溶液和荧光特异性抗体的混合溶液，将组织块和smr器件浸没于溶液中。荧光特异性抗体为偶联了pe荧光基团的ca9抗体，抗体品牌abcam。
107.3、开启smr器件，信号发生器输出2.49ghz的正弦信号，功率调整至2w，待组织块旋绕至声涡旋中加速酶解反应和抗体抗原结合的进程，持续作用15min。
108.4、过滤及置换酶溶液，从注液管1注入培养液的同时从废液管6吸出溶液，细胞会顺着流体方向通过滤膜8和滤膜9两层滤膜(滤除未消化完全的组织及细胞团簇)，细胞碎片会随着流体通过滤膜10并随着废液被吸出。持续循环3min，原本的管腔内的酶溶液会被置换为细胞培养液。
109.5、结合倒置荧光显微镜通过观察腔室18观察单细胞形态与荧光染色结果，通过有无荧光及荧光的强度判断是否有目标种类细胞及细胞的大致占比。
110.图9为倒置荧光显微镜下观察腔室18中两个不同位置处荧光染色结果，钙黄绿素标记出所有的活细胞，带pe荧光的ca9抗体标记出在透明肾癌细胞中呈现高表达的ca9蛋白。从图中可以看出，细胞被充分的分散为单细胞，ca9高表达的透明肾癌细胞被充分的染色，荧光强度远远高于其他细胞，可以被轻松的分辨，证明smr器件可以同时充分加速酶解和抗原抗体结合过程，15min的处理时间即可完成单细胞制备和荧光抗体的充分染色。根据图中两个位置的影像结果判断，可以初步给出该组织的癌细胞类型为透明肾癌细胞，通过图片计数统计出其中癌细胞占比约为4％，可推测出该处组织恶性程度并不高。
111.图片计数的具体操作为，显微镜下拍摄观察腔室18中5个不同位置的细胞图像，并将图片导入imagej。首先进行rgb三色通道的分离，接着对不同通道的图像进行二值化处理，最后使用imagej内置的计数插件对细胞数量进行统计。rgb三个不同的色道的统计结果表示分别发出红、绿、蓝三种荧光的细胞数量。例如针对此次实验r通道统计结果为所有发出红色荧光的细胞的数量，即因ca9高表达而呈现出pe红色荧光的透明肾癌细胞的数量。
112.上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何
在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。