猪黑毛基因分子标记及黑色被毛杜洛克猪的制备和应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术及动物遗传育种领域，特别涉及一种猪黑毛基因分子标记及黑色被毛杜洛克猪的制备和应用。


背景技术：

2.动物毛色是一种较为复杂的遗传性状，其分子机制目前已基本明确，多种基因参与到动物被毛颜色(color)和花纹(pattern)的形成中。其中一个关键的位点是extension(e)，即黑素皮质素受体1(mc1r)基因。mc1r在真黑色素和褐黑色素合成调节中起关键性作用。显性的mc1r(如在中国黑猪中普遍存在的e
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基因型)可以促进真黑色素的合成，造成全黑的被毛表型；而功能失活的mc1r(如隐形的e基因位点)，相较于e
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具有多个造成错义突变的snp，因此造成了蛋白功能的缺陷。mc1r的失活促进褐黑色素的合成，造成动物黄或红色的被毛表型。当然另有一些其他基因位点也控制动物毛色，如i位点，其控制黑色素的迁移和分布，其多种不同基因型可以造成白色、白底黑斑、黑白花等等复杂毛色性状。同时i相较于e
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是显性的，因此在i存在的情况下，白毛掩盖黑毛表型，造成纯白或多种花色混杂的毛色性状。
3.而黑毛色猪在如今的国内市场认可度较高，由于本地土猪(大部分都为黑毛)一般具有较高的脂肪沉积，因此猪肉风味和品质较国外瘦肉型品种为佳，因此市场一般认为黑毛是高品质猪肉的代表性特征，也相应具有较高的售价。同时本土黑猪也具有体型偏小，生长较慢、产肉量不高的劣势。因为培育具有黑毛特征的瘦肉型猪种、或大体型猪种可以产生较高的市场价值，具有一定的产业和社会现实意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种杜洛克猪黑色被毛基因分子标记及在制备黑色被毛杜洛克猪、培育黑色被毛杜洛克猪新品系、猪的遗传改良等领域上的应用，以解决上述问题。
5.根据本发明的第一个方面，提供了一种杜洛克猪黑色被毛基因分子标记，该分子标记核苷酸序列如seq id no:5所示，所述的序列中包括4个与被毛颜色性状相关的snp位点：第1个snp位点用m显示碱基突变位置，其中m表示a/g突变；第2个snp位点用r显示碱基突变位置，其中r表示c/t突变；第3个snp位点用s显示碱基突变位置，其中s表示c/t突变；第4个snp位点用k和b显示碱基突变位置，其中k表示g/a突变、b表示a/g突变；当上述snp位点用于制备或筛选黑色被毛杜洛克猪时，需要其中至少1个snp位点产生等位替换。
6.根据本发明的第二个方面，提供了一种分子标记在制备黑色被毛杜洛克猪上的应用，该分子标记核苷酸序列如seq id no:5所示，所述的序列中包括4个与被毛颜色性状相关的snp位点：第1个snp位点用m显示碱基突变位置，其中m表示a/g突变；第2个snp位点用r显示碱基突变位置，其中r表示c/t突变；第3个snp位点用s显示碱基突变位置，其中s表示c/t突变；第4个snp位点用k和b显示碱基突变位置，其中k表示g/a突变、b表示a/g突变；当上述snp位点用于制备或筛选黑色被毛杜洛克猪时，需要其中至少1个snp位点产生等位替换。
7.在某些实施方式中，上述应用包括在制备黑色被毛杜洛克猪时，4个snp位点均产生等位替换：第1个snp位点为a替换g，第2个snp位点为c替换t，第3个snp位点为c替换t，第4个snp位点为g替换a和a替换g。
8.在某些实施方式中，上述应用还包括所述的等位替换包含至少3个snp单等位替换。
9.根据本发明的第三个方面，提供了一种黑色被毛杜洛克猪的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
10.1)设计杜洛克猪mc1r基因靶向切割crispr/cas9系统，识别切割位点为ggtgtccagcctctgcttcc，并构建grna表达载体mc1r-grna_cloning vector；
11.2)构建含有4个snp分子标记的donor供体质粒，该4个snp分子标记核苷酸序列如seq id no:5所示，所述的序列中包括4个与被毛颜色性状相关的snp位点：第1个snp位点用m显示碱基突变位置，其中m表示a/g突变；第2个snp位点用r显示碱基突变位置，其中r表示c/t突变；第3个snp位点用s显示碱基突变位置，其中s表示c/t突变；第4个snp位点用k和b显示碱基突变位置，其中k表示g/a突变、b表示a/g突变；当上述snp位点用于制备或筛选黑色被毛杜洛克猪时，需要其中至少1个snp位点产生等位替换；
12.3)将grna表达载体mc1r-grna_cloning vector、donor供体质粒及hcas9质粒共转染杜洛克猪成纤维细胞；
13.4)筛选在mc1r基因上如上所述的4个snp位点具有单等位或双等位突变型的阳性杜洛克猪成纤维细胞；
14.5)将步骤4)中筛选的阳性细胞作为核供体细胞进行体细胞克隆，制备成克隆猪，获得的阳性克隆猪即为可以表达黑色被毛基因的黑色被毛杜洛克猪。
15.在某些实施方式中，上述制备方法中grna表达载体mc1r-grna_cloning vector核苷酸序列如seq id no:2所示；donor供体质粒核苷酸序列如seq id no:3所示。
16.根据本发明第四个方面，提供了一种杜洛克猪黑色被毛基因，该基因核苷酸序列如seq id no:9所示，所述的序列含有4个snp位点的等位替换：第1个snp位点为a替换g，第2个snp位点为c替换t，第3个snp位点为c替换t，第4个snp位点为g替换a和a替换g。
17.根据本发明第五个方面，提供了一种黑色被毛杜洛克猪新品系的培育方法，该方法通过将制备获得的表达黑色被毛基因的黑毛杜洛克猪作为f0代种猪进行扩繁及配种，利用群体继代选育法培育黑色被毛杜洛克猪新品系。
18.根据本发明第六个方面，提供了猪的遗传改良方法，该方法包括如下步骤：
19.将制备获得的表达黑色被毛基因的黑毛杜洛克猪个体，作为父本或母本与同品种野生型杜洛克猪繁育f1代，并筛选f1代中4个snp位点双等位替换的纯合子个体与其他品种f0代纯合子家系父本或母本猪杂交获得f2代，组建新的育种群，达到在现有猪品种中既可以获得黑色被毛的优势基因型，还可以获得杜洛克猪的优势瘦肉性状基因型，实现现有猪品种遗传改良的目的。
20.本发明的有益效果：
21.1、获得了影响杜洛克猪被毛颜色的4个snp，尤其是通过点突变这4个snp位点，可以获得黑色被毛杜洛克猪。
22.2、当4个snp位点都发生特定突变，具体为第1个snp位点为a替换g，第2个snp位点
为c替换t，第3个snp位点为c替换t，第4个snp位点为g替换a和a替换g时，杜洛克猪则表现为黑色被毛。
23.3、本发明通过基因编辑的方式，可以精准地实现4个snp位点的突变替换，同时不改变猪的其他基因型和表型，这是传统杂交育种所无法实现的。同时，本发明通过基因编辑来改变snp基因型，获得特定基因型和表型改良的猪个体和群体，也是具有前瞻性和开创性的。
24.4、本发明通过基因编辑获得可以表达黑色被毛的snp基因型和表型，可以大大缩短育种时限，也可以避免传统杂交育种会导致的其他性状的改变，可以最大程度保留杜洛克猪的高瘦肉型等优势性状。
25.5、本发明通过基因编辑获得f0黑色被毛杜洛克猪，并用于种群繁育，可以获得既具有黑色被毛又具有高瘦肉率的新杜洛克猪品系。
26.6、本发明可以通过将获得f1代黑色被毛纯合子杜洛克猪与其他猪品种杂交，加速其他猪品种的遗传改良。
27.7、本基因编辑方式改变杜洛克猪被毛颜色的方法也可以应用于其他预期被毛颜色的改良，比如在预测e、i等毛色位点的显隐形关系的基础下，也可实现其他被毛颜色或花纹的改变，具有广泛的适用性。
附图说明
28.图1为mc1r的e等位基因型同源替换策略及载体设计图示以及4个snps点突变的基因型；
29.图2为mc1r基因替换的黑色被毛杜洛克猪及野生型红色杜洛克猪。
具体实施方式
30.下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
31.实施例1杜洛克猪黑毛基因修饰系统的构建
32.通过比较杜洛克(隐性e基因型)和本土黑猪(显性e
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基因型)的mc1r基因序列，发现了4个snp分子标记位点的错义突变：m95v(第1个位点)、p102l(第2个位点)、a164v(第3个位点)和a243t(第4个位点)，其基因序列如seq id no:5所示：no:5所示：该序列中框框表示4个snp位点，其中：第1个snp位点用m显示碱基突
变位置，其中m表示a/g突变；第2个snp位点用r显示碱基突变位置，其中r表示c/t突变；第3个snp位点用s显示碱基突变位置，其中s表示c/t突变；第4个snp位点用k和b显示碱基突变位置，其中k表示g/a突变、b表示a/g突变(第1个snp位点m表示的a/g突变中，a表示突变碱基，g表示野生型杜洛克猪原始碱基，其他第2-4个snp位点类同)。
33.1.设计了切割猪mc1r位点的crispr grna，切割位点在4个snp中间，保证同源重组的效率。设计的grna识别位点为(seq id no:1)ggtgtccagcctctgcttcc。合成该目标序列的互补单链dna，退火形成双链，连接入grna载体grna_cloning vector(该载体购买于品牌及货号：addgene#41819并做适当改造，将该载体u6启动子下方引入两个bbsi酶切位点，以便进行外源片段的连接)，形成grna表达载体mc1r-grna_cloning vector(seq id no:2)。
34.2.设计了可替换杜洛克猪e位点基因序列的并具有e
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基因型基因序列的donor供体质粒(seq id no:3)，其中该供体质粒中替换e位点的mc1r基因序列如seq id no:4所示，长度为2757bp序列：其覆盖全部的mc1r编码区，并且，其还覆盖了4个snp区域(m95v、p102l、a164v和a243t)(用突变碱基替换杜洛克猪原始碱基)，其还在两端各有1000bp左右的长度用作同源臂，以提高同源重组效率。采用人工合成方法获得上述替换e位点的mc1r基因的2757bp序列，同时为了防止重组后再次被crispr切割破坏基因的表达，另对供体质粒中的grna识别区域进行了突变，破坏grna同源性但是不改变氨基酸表达。供体质粒中对应的grna区域突变为(seq id no:6)ggtgtcctctctgtgttttctcg(小写字母为突变碱基)。最终将上述设计合成的donor供体质粒(序列如seq id no:3所示)，直接用质粒形式转染使用。具体基因替换示意图如图1所示。
35.实施例2表达阳性黑色被毛基因的杜洛克猪胎儿成纤维细胞的制备
36.采集杜洛克猪30天龄的胎儿成纤维细胞，进行原代培养并以电穿孔方式进行质粒转染。转染质粒为3种质粒混合物：mc1r-grna_cloning vector，donor供体质粒，hcas9质粒(购买品牌及货号：addgene#41815)。转染后以低密度分盘，24小时后施加500μg/ml g418进行筛选，富集可能的同源重组细胞。培养10天后，会形成合适大小的单细胞克隆，此时进行克隆挑取，并在48孔板逐个培养。待48孔细胞长满，取1/10量的细胞用10μl蛋白酶k进行裂解，以裂解产物直接作为模板进行pcr扩增，扩增覆盖供体及供体外的基因组序列，鉴定mc1r的突变情况，扩增引物序列为mc1r-genotyping-forward(seq id no:7)：cctgcactcgcccatgtactact和mc1r-genotyping-reverse(seq id no:8)：gccagaaagaggttgacgtt。pcr产物大小为1627bp。以mc1r-genotyping-forward为测序引物对pcr产物进行测序，在4个snp具有单等位或双等位突变型的细胞为正确突变细胞克隆。对鉴定正确的细胞克隆进行扩大培养，传代至24或12孔板中长满至汇合，冻存备用，即为阳性的mc1r基因编辑猪成纤维细胞，该阳性细胞中含有的在m95v、p102l、a164v和a243t四个snp位点进行突变改造后的mc1r基因序列为seq id no:9所示。
37.实施例3黑色被毛杜洛克猪的制备
38.1、卵母细胞的分离及成熟
39.从屠宰场购买获得猪卵巢，放入37℃含体积浓度为1％的青-链霉素的生理盐水中，2h内运回实验室。用10ml注射器从卵泡中抽取卵泡液置于50ml离心管中，37℃水浴静置30min，去上清；加入tl-hepes重悬沉淀，再静置15min，重复一次。将重悬液放入60mm平皿中，在体视镜下，用手吸管挑选卵丘包裹2层以上，致密且胞质均匀的卵丘细胞—卵母细胞
复合体，用成熟培养基洗涤3遍，转入事先在培养箱中平衡4h的培养液滴内(每500μl液滴放入50枚卵丘细胞—卵母细胞复合体)，用胚胎级矿物油覆盖，38.5℃，体积浓度5％co2条件下培养42h。成熟后，用含0.5％透明质酸酶的dpbs脱卵丘，在显微镜下挑选出含有第一极体的卵母细胞，作为体细胞核移植的受体备用。
40.2、体细胞核移植
41.将阳性的mc1r基因编辑猪成纤维细胞和体外成熟的含有第一极体的卵母细胞，同时转入含有多个显微操作液滴的60mm平皿中，将平皿放置在显微操作仪的热台上，将卵母细胞去核，然后在其卵周隙注入供体细胞1个，电击融合后组成重组胚。
42.3、胚胎移植
43.重组胚培养过夜后，取出用于胚胎移植。代孕母猪选用当天自然发情的经产母猪。通过外科手术，将胚胎植入输卵管深部，每头猪移植200～250枚重组胚。胚胎移植后，对未返情的代孕母猪于24天后进行首次超声波妊娠检测，检测出怀孕的代孕母猪之后，每周定时检测一次，监测至预产期前两周。经过约114天妊娠周期后，通过自然分娩或剖腹产获得克隆猪。出生克隆猪的汇总表如表1所示。
[0044][0045]
实施例4黑毛杜洛克克隆猪基因型和表型的鉴定
[0046]
出生的克隆猪根据毛色判断是否基因编辑成功，成功进行mc1r基因修饰的克隆猪具有全身均一深黑色的被毛，如图2所示。采集克隆猪的耳部皮肤，抽提基因组dna。用实施例2中的引物扩增mc1r位点，鉴定mc1r基因型的变化。经测序，发现所有黑毛克隆猪均具有4个snps替换的基因型，即e
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/e的mc1r基因型(如表2所示)，其中部分黑猪为4snps单等位替换；部分黑猪为3snps单等位替换，1snp双等位替换。该结果充分说明了e
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相较于e的显性上位效应。
[0047][0048]
实施例5黑色被毛杜洛克猪新品系的构建
[0049]
将实施例4中经检验为阳性的黑色被毛克隆猪作为种猪，待性成熟后，进行配种，根据孟德尔遗传定律，出生的f1代小猪中将有75％的为深黑色，其中25％为双等位替换，50％为单等位替换基因型。将其中4snps双等位替换的黑毛f1代猪作为种猪，与后代野生型杜洛克猪配种，出生的f2代杜洛克猪将全部为4snps单等位替换的黑毛基因型猪，由此可以大大缩短杜洛克猪群体毛色的改善，可以高效的获得黑毛杜洛克猪群体，也可以快速建立黑毛瘦肉型杜洛克猪品系。
[0050]
实施例6一种猪的遗传改良方法
[0051]
将实施例5中获得的4snps双等位替换的黑毛f1代猪与其他品种f0代纯合子家系父本或母本猪杂交获得f2代，在f2代中既可以获得黑色被毛的优势基因型，还可以获得杜洛克猪的优势瘦肉性状基因型，可以同时改良其他猪种的2个优势性状。