1.本发明涉及基因工程和蛋白质改造技术领域，具体涉及一种高比活淀粉酶突变体及其应用。
背景技术：
2.淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，具有酶制剂的专一性，其主要作用机理是将淀粉水解成麦芽糖、葡萄糖、糊精等。淀粉是植物生长期间，以淀粉粒形式贮存于细胞中的贮存多糖，存在于种子和块茎中，如小麦中含淀粉为70％、大米为80％。淀粉不是一个单一的分子，而是一个混合物，由两种不同类型的淀粉组成，分为直链淀粉和支链淀粉两大类；淀粉酶按水解淀粉不同位置可以划分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、γ-淀粉酶、异淀粉酶；按微生物来源可以划分为细菌淀粉酶、真菌淀粉酶、霉菌淀粉酶；按反应温度可以划分为可分为中温淀粉酶和高温淀粉酶，中温淀粉酶在70℃，高温淀粉酶在90～105℃。
3.α-淀粉酶是酶制剂中应用很广的产品，应用历史早，产量大，约占酶制剂市场25％的比例，主要应用于纺织物退浆、啤酒和酒精生产、淀粉加工、食品加工、发酵工业、医药行业以及石油开采工业等方面。α-淀粉酶以糖原或淀粉为底物，从分子内部切开α-1 ,4葡萄糖苷键，使底物水解成糊精和少量的葡萄糖和麦芽糖。目前在国内工业化生产上所使用的α-淀粉酶菌株大多数是野生菌株经过诱变得到的突变菌株。通常从自然界直接分离的α-淀粉酶野生型菌株产酶能力低下，不能满足工业生产的需要，因此如何获得具有较高产酶能力的菌株已成为当前解决淀粉酶制剂工业的关键。
4.随着基因工程技术的不断应用和发展，外源表达各类酶受到重视。重组蛋白表达系统主要有：大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、转基因植物或动物表达系统和体外翻译系统。但因为真核生物生长快、培养容易、遗传操作简单，同时具有对表达蛋白进行加工、修饰和折叠等特点，酵母表达系统越来越受到重视和利用。其中巴斯德毕赤酵母表达系统是发展起来的较为完善的、应用最广泛的表达系统之一。
5.本发明通过定向进化技术对中温淀粉基因进行了大量突变筛选，得到了一系列比活力大幅度提高的淀粉酶突变体。
技术实现要素：
6.本发明的目的是提供一种高比活淀粉酶突变体。所述突变体的比活力比野生型得到显著提高，有利于其在工业领域的广泛应用。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明一方面提供了一种淀粉酶，其氨基酸序列为seq id no:2。
8.本发明一方面提供了一种淀粉酶突变体，是氨基酸序列为seq id no:2的淀粉酶的第76位氨基酸由lys变为leu。
9.本发明还提供了一种淀粉酶突变体，是氨基酸序列为seq id no:2的淀粉酶的第224位氨基酸由gln变为ser。
10.本发明还提供了一种淀粉酶突变体，是氨基酸序列为seq id no:2的淀粉酶的第325位氨基酸由asp变为tyr。
11.本发明还涉及编码上述淀粉酶突变体的dna分子。
12.本发明还涉及包含上述dna分子的重组表达载体。
13.本发明还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
14.所述宿主细胞为毕赤酵母（pichia pastoris）。
15.将上述的质粒转入宿主细胞中，重组表达的淀粉酶突变体的比活力得到显著提升。
16.本发明还提供了上述淀粉酶突变体在饲料领域中的应用。
17.本发明以野生型中温淀粉酶zd7为基础，提供了包含k76l、q224s或d325y单个突变位点的突变体。在摇瓶水平下，表达野生型中温淀粉酶zd7的转化子中发酵上清液的比活力最高达到156u/mg；而表达淀粉酶单点突变体zd7-1、zd7-2、zd7-3的转化子中发酵上清液的比活力最高分别达到408 u/mg、480 u/mg、614u/mg，比野生型提高了161.5%-293.6%；其中，含d325y单点突变的突变体zd7-3，其比活力最高，取得了意料不到的技术效果。
18.综上，本发明提供的中温淀粉酶突变体的比活力得到显著提高，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域中的广泛应用。
具体实施方式
19.本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如molecμlar cloning：a laboratory manual，3nd ed. (sambrook, 2001)和current protocols in molecμlar biology (ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。例如，本发明可选用如下实验材料和试剂：菌株与载体：大肠杆菌dh5α本公司保藏，毕赤酵母gs115、载体ppic9k、ppicza、amp、g418、zeocin购自invitrogen公司。
20.实验试剂：dna聚合酶购自takara公司，t4连接酶、限制性内切酶购自fermentas公司，质粒提取试剂盒和胶纯化回收试剂盒购自omega公司，genemorph ii随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
21.培养基：lb培养基（大肠杆菌培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%nacl，ph7.0；lb+amp培养基：lb培养基加100μg/ml氨苄青霉素；ypd培养基（酵母培养基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；ypd+zeocin培养基：ypd培养基加100μg/ml zeocin；md培养基（酵母筛选培养基）：1.34% ynb，4
×
10-5
生物素，1%甘油、2%琼脂糖；bmgy培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34% ynb，4
×
10-5 %生物素，1%甘油；bmmy培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34% ynb，4
×
10-5 %生物素，0.5%甲醇，
本发明实施例中所述淀粉酶的酶活检测方法参照gb/t24401-2009。
22.下面结合具体实施方式，对本发明做进一步阐述。
23.实施例1 中温淀粉酶zd7的基因合成以中温淀粉酶基因（genbank号为wp_017474613.1）的氨基酸序列为基础，分析该中温淀粉酶的氨基酸序列，去除其自身的信号肽，再根据毕赤酵母的密码子偏好性，对其进行密码子优化，由华大基因公司进行全基因合成。申请人将合成的中温淀粉酶基因命名为zd7，全长1452bp，其核苷酸序列为seq id no:1，编码483个氨基酸，其编码的氨基酸序列为seq id no:2。
24.实施例2 高比活中温淀粉酶突变体的筛选为了提高中温淀粉酶zd7的比活力，申请人通过定向进化技术进行了大量突变的筛选。
25.设计pcr引物1(f)和引物1(r)：引物1(f)：gcgcgaattcgctaatttgaatggtacattgatgc（下划线为限制性内切酶ecor i识别位点）；引物1(r)：taaagcggccgcttatctttgaacataaatagaaaca（下划线为限制性内切酶not i识别位点）。
26.以中温淀粉酶zd7的基因片段为模板，利用上述引物用genemorph ii随机突变pcr试剂盒（博迈斯）进行pcr扩增；胶回收pcr产物，ecori、not i进行酶切处理后与经同样酶切后的pet21a载体连接，转化至大肠杆菌bl21(de3)中，涂布于lb+amp平板，37℃倒置培养；待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150 ul含有0.1mm iptg的lb+amp培养基，37℃、220 rpm培养6 h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有中温淀粉酶的大肠杆菌细胞裂解液；再将细胞裂解液离心，取上清液，分别进行淀粉酶活力测定和蛋白含量测定，计算不同突变子的比活力水平。
27.实验结果表明，有些突变对中温淀粉酶zd7的比活力没有影响，有些突变甚至使其比活力变得更低了。最终，申请人筛选到能显著提高中温淀粉酶zd7比活力的单点突变：k76l，q224s，d325y。
28.将含k76l单点突变的中温淀粉酶突变体命名为zd7-1；将含q224s单点突变的中温淀粉酶突变体命名为zd7-2；将含d325y单点突变的中温淀粉酶突变体命名为zd7-3。
29.突变体zd7-1、zd7-2、zd7-3的氨基酸序列分别为seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5。
30.参照上述氨基酸序列，分别合成所述突变体的编码核苷酸序列。
31.实施例3 中温淀粉酶在毕赤酵母中的表达1、重组质粒的构建将中温淀粉酶基因zd7及其突变体基因（zd7-1、zd7-2、zd7-3）分别用限制性内切酶ecor i和not i进行双酶切，将表达载体ppic9k使用同样的限制性内切酶进行双酶切，100 μl酶切体系如下：基因片段/载体40 μl、10
×
h buffer 10 μl、10
×
bsa 10 μl、ecor i 5 μl、not i 5 μl、ddh2o 30 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。
32.将双酶切后的中温淀粉酶基因片段分别与表达载体ppic9k连接，连接体系如下：
表达载体ppic9k双酶切产物5 μl、中温淀粉酶基因双酶切产物3 μl、10
×
t
4 ligase buffer 1 μl、t
4 ligase 1 μl。22 ℃连接过夜，转化到大肠杆菌dh5α，挑取转化子测序验证。将测序验证正确的转化子转接到lb+amp液体培养基中，37℃过夜培养，提取质粒，即为重组酵母表达质粒。
33.2、转化与筛选将上述构建的重组酵母表达质粒分别用sal i进行线性化，线性化产物用柱纯化试剂盒纯化后，通过电穿孔法转化毕赤酵母gs115，涂布md平板。在md平板上生长出的菌落即为重组表达中温淀粉酶zd7或其突变体的毕赤酵母工程菌株，然后涂布含不同浓度遗传霉素g418的ypd平板上筛选多拷贝的转化子。
34.3、摇瓶发酵验证挑取单个多拷贝转化子分别接入bmgy培养基中，30℃、220rpm振荡培养24小时后，再转入bmmy培养基中，30℃、220rpm振荡培养，每24h添加0.5%的甲醇。诱导表达4d后，离心去除菌体，将上清液分别进行中温淀粉酶活力测定和蛋白含量测定，计算比活力。
35.结果显示，在摇瓶水平下，表达野生型中温淀粉酶zd7的转化子中发酵上清液的比活力最高达到156u/mg；而表达淀粉酶单点突变体zd7-1、zd7-2、zd7-3的转化子中发酵上清液的比活力最高分别达到408 u/mg、480 u/mg、614 u/mg，比野生型提高了161.5%-293.6%；其中，含d325y单点突变的突变体zd7-3，其比活力最高，取得了意料不到的技术效果。
36.（一）淀粉酶酶活检测方法参考gb/t24401-2009方法。
37.（二）考马斯亮蓝法检测蛋白含量1、试剂（1）考马斯亮蓝g-250染色液：取考马斯亮蓝g-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升，常温可使用1个月；（2）标准蛋白溶液：用牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度，配制成1 mg/ml的蛋白质标准溶液；（3）标准原液的配制：在分析天平上精确称取0.05g结晶牛血清蛋白，于小烧杯中，加入少量蒸馏水溶解后转入50ml容量瓶中，烧杯内残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，最后用蒸馏水定容至刻度。配制成标准原液，其中牛血清蛋白浓度为1000μg/ml。
38.2、标准曲线的绘制。
39.（1）分别取6支试管，编号，按下表加入试剂，混匀。管号123456样品（ml）00.10.20.30.40.5水（ml）2.01.91.81.71.61.5蛋白质含量（mg/ml）00.050.10.150.20.25
40.准确吸取2.5ml 考马斯亮蓝溶液于6支干净试管中，准确吸取上述各管溶液0.1ml，对应放于各自编号的试管中，涡旋混匀，室温放置5min后，以1号试管调零，测定在595nm处比色，记录吸光值。
41.（2）绘制标准曲线：记录1-6管所读吸光值，以蛋白质含量（μg）为横坐标，以吸光度
为纵坐标，绘出标准曲线。注意，由于考马斯亮蓝染色能力强，比色杯一定要洗干净。不可用石英杯测定。
42.3、样品的测定样品的准备：（1）液体样品：将待测样品稀释至蛋白含量0.1-0.3mg/ml，控制除去空白后的吸光值（减去空白以后）在0.2-0.4之间；（2）固体样品：准确称取1.0000g样品于100ml三角瓶中，用移液枪加入20ml去离子水，磁力搅拌10min，4000rpm离心10min，取上清进一步稀释测定蛋白含量，稀释方法参见液体样品。
43.样品检测：取干净试管，加入到含有2.5ml考马斯亮蓝溶液，然后加入待测样品，涡旋震荡摇匀，室温放置5min，以标准曲线空白作对照，用1cm光径的微量比色杯在595nm测定吸光度，根据标曲求得蛋白含量。
44.4、蛋白含量计算蛋白含量=x
×
稀释倍数
×
标样折算系数。
45.x：根据标曲求出的蛋白含量（mg/ml）；标样折算值：标样为47mg/ml，根据实测值折算一个系数。
46.（三）比活力的计算
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比活力 (specific activity)”是指：单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用u/mg蛋白质来表示。一般来说，酶的比活力越高，酶越纯。
47.比活力计算公式：比活力（u/mg）=酶活（u/ml）/ 蛋白含量（mg/ml）。
48.综上，本发明提供的k76l，q224s，d325y三个突变位点能显著提高中温淀粉酶zd7的比活力，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域的广泛应用。