一种构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法

本发明属于分子生物学，涉及一种构建可通过药物诱导cas9蛋白表达的模型猪的方法。

背景技术：

1、猪不仅是为人类提供食物的重要家畜，也是生物医学发现的理想模型，它们在免疫系统，解剖学，生理学，器官大小和新陈代谢方面与人类有许多相似之处。尽管基因修饰猪模型并不像啮齿动物模型那样被广泛使用，但迄今为止已经产生了越来越多的对农产品、异种移植和人类疾病模型至关重要的基因修饰猪。由于具有生殖系嵌合能力的猪胚胎干细胞尚未成功建系，目前基因修饰猪主要通过直接胚胎显微注射包含crispr的组分或应用crispr系统在体细胞中进行基因编辑，然后进行体细胞核移植(scnt)克隆，然而这两种方法繁琐，费力，低效且耗时。

2、有研究报道通过将spcas9和sgrna的表达载体直接递送到成年小鼠的特定组织中直接进行体内基因组编辑(platt et al.,2014,sanchez-rivera et al.,2014,xue etal.,2014,swiech et al.,2015,dow et al.,2015)，然而，总体编辑效率较低，为了克服这个问题，进一步构建了cre依赖性spcas9表达盒特异性插入rosa26基因座的小鼠模型，随后，将靶向目的基因的sgrna和cre引入特定的体内器官/组织/细胞，以此简便有效地进行体内基因组编辑。最近，组成型表达cas9的动物模型(例如rosa26-spcas9转基因猪)的产生显著降低了病毒载体的包装大小和需要递送的组分的数量，从而促进了体内基因编辑。然而，由不可控制的spcas9表达引起的基因组损伤(xu s x,kim j,tang q s,etal.2020.cas9 is a genome mutator by directly disrupting dna-pkdependentdnarepair pathway.protein&cell[j],11:352-365.)，脱靶效应(fu y f,fodenj a,khayter c,et al.2013.high-frequency off-target mutagenesis induced bycrispr-cas nucleases in human cells.nature biotechnology[j],31:822-+.)和免疫清除反应将阻碍具有该组成型spcas9表达系统的动物模型的应用，这对于基于cre重组酶系统的诱导型表达系统也是不可避免的，因为cre激活后存在可持续的组成型spcas9表达。此外，cre重组酶被证实对猪胚胎发育产生负面影响(whitworth k m,cecil r,benne j a,et al.2018.zygote injection ofrna encoding cre recombinase results inefficient removal ofloxp flanked neomycin cassettes in pigs.transgenicresearch[j],27:167-178.)并且在哺乳动物基因组中具有假重组位点的潜在遗传毒性。

3、综上所述，提供一种高效构建基因修饰模型猪的方法，对于疾病治疗和药物研发领域具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种构建可通过药物诱导cas9蛋白表达的模型猪的方法，构建可通过药物诱导cas9蛋白表达的模型猪，以期解决目前cas9蛋白在大动物猪上直接进行体内递送存在成本高、效率低、免疫原性大等问题，以及cas9蛋白的长期或持续性表达引起的脱靶、基因组损伤等问题。

2、为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种构建可通过药物诱导cas9蛋白表达的模型猪的方法，所述方法包括：

4、将rtta调控元件敲入猪细胞基因组rosa26位点，将cas9蛋白表达元件敲入猪细胞基因组hipp11位点，所述rtta调控元件含有rtta蛋白编码基因，所述cas9蛋白表达元件含有tre3g启动子和cas9蛋白编码基因，所述tre3g启动子启动cas9蛋白编码基因表达。

5、本发明通过将二元tet-on元件，rtta调控元件和tre3g控制的cas9蛋白表达元件分别敲入猪细胞基因组rosa26和hipp11位点，以此构建多西环素(doxcycline，dox)诱导cas9蛋白表达的(doxcycline induced cas9，dic)模型猪，其允许通过体外和体内简单的化学诱导实现灵活地时间控制猪中的cas9蛋白活性，只有在dox存在的情况下，rtta和dox才能结合到tre3g启动子，从而激活tre3g启动子启动cas9和红色荧光蛋白表达。利用这种模型猪，通过简单地将向导rna(grna)传递至猪胎儿成纤维细胞(pff)和/或特定组织中并在dox诱导后，可以实现体外和/或体内基因编辑(基因敲除或基因激活)和染色体工程。与啮齿类相比，免疫系统和人类更相似的猪，通过体内基因突变建立癌症动物模型具有明显优势。dic模型猪克服了cas9蛋白的体内递送难题，避免了组成型cas9表达的副作用，并消除了潜在的cre介导的遗传毒性，这将为猪条件性体内基因组和表观基因组编辑提供强大而灵活的平台，促进基因修饰猪模型在生物医药和农业方面的应用。

6、优选地，所述rtta调控元件敲入rosa26位点的第一个内含子中。

7、优选地，所述rtta蛋白编码基因的核酸序列包括seq id no.1所示的序列。

8、优选地，所述cas9蛋白编码基因包括spcas9蛋白编码基因。

9、优选地，所述spcas9蛋白编码基因的核酸序列包括seq id no.2所示的序列。

10、优选地，所述tre3g启动子的核酸序列包括seq id no.3所示的序列。

11、优选地，所述rtta调控元件还含有药物筛选标记基因。

12、优选地，所述药物筛选标记基因包括neo基因。

13、优选地，所述neo基因的核酸序列包括seq id no.4所示的序列。

14、优选地，所述rtta调控元件的核酸序列包括seq id no.5所示的序列。

15、优选地，所述cas9蛋白表达元件还含有药物筛选标记基因。

16、优选地，所述药物筛选标记基因包括puro基因。

17、优选地，所述puro基因的核酸序列包括seq id no.6所示的序列。

18、本发明中，所述药物筛选标记基因可以为本领域通用的进行遗传改造后筛选的标记基因，如抗性基因等，不作特殊限制。

19、本发明中，所述rtta调控元件和cas9蛋白表达元件中的药物筛选标记基因不同，以便于进行遗传改造后筛选。

20、优选地，所述cas9蛋白表达元件还含有报告基因。

21、本发明中，所述报告基因可以为本领域通用的表达产物易被检测、且易于与内源性背景蛋白区别的基因，例如荧光蛋白基因等，不作特殊限制。

22、优选地，所述报告基因包括tdtomato基因。

23、优选地，所述tdtomato基因的核酸序列包括seq id no.7所示的序列。

24、优选地，所述cas9蛋白表达元件的核酸序列包括seq id no.8所示的序列。

25、seq id no.1：

26、atgtctagactggacaagagcaaagtcataaactctgctctggaattactcaatggagtcggtatcgaaggcctgacgacaaggaaactcgctcaaaagctgggagttgagcagcctaccctgtactggcacgtgaagaacaagcgggccctgctcgatgccctgccaatcgagatgctggacaggcatcatacccactcctgccccctggaaggcgagtcatggcaagactttctgcggaacaacgccaagtcataccgctgtgctctcctctcacatcgcgacggggctaaagtgcatctcggcacccgcccaacagagaaacagtacgaaaccctggaaaatcagctcgcgttcctgtgtcagcaaggcttctccctggagaacgcactgtacgctctgtccgccgtgggccactttacactgggctgcgtattggaggaacaggagcatcaagtagcaaaagaggaaagagagacacctaccaccgattctatgcccccacttctgaaacaagcaattgagctgttcgaccggcagggagccgaacctgccttccttttcggcctggaactaatcatatgtggcctggagaaacagctaaagtgcgaaagcggcgggccgaccgacgcccttgacgattttgacttagacatgctcccagccgatgcccttgacgactttgaccttgatatgctgcctgctgacgctcttgacgattttgaccttgacatgctccccgggtaa。

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29、seq id no.3：

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31、seq id no.4：

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33、seq id no.5：

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35、seq id no.6：

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37、seq id no.7：

38、atggtgagcaagggcgaggaggtcatcaaagagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggagggctccatgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggcggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtccccccagttcatgtacggctccaaggcgtacgtgaagcaccccgccgacatccccgattacaagaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggtctggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcacgctgatctacaaggtgaagatgcgcggcaccaacttcccccccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaagggcgagatccaccaggccctgaagctgaaggacggcggccactacctggtggagttcaagaccatctacatggccaagaagcccgtgcaactgcccggctactactacgtggacaccaagctggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgagcgctccgagggccgccaccacctgttcctggggcatggcaccggcagcaccggcagcggcagctccggcaccgcctcctccgaggacaacaacatggccgtcatcaaagagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggagggctccatgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggcggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtccccccagttcatgtacggctccaaggcgtacgtgaagcaccccgccgacatccccgattacaagaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggtctggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcacgctgatctacaaggtgaagatgcgcggcaccaacttcccccccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaagggcgagatccaccaggccctgaagctgaaggacggcggccactacctggtggagttcaagaccatctacatggccaagaagcccgtgcaactgcccggctactactacgtggacaccaagctggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgagcgctccgagggccgccaccacctgttcctgtacggcatggacgagctgtacaagtag。

39、seq id no.8：

40、ttactccctatcagtgatagagaacgtatgaagagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgcagactttactccctatcagtgatagagaacgtataaggagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaccagtttactccctatcagtgatagagaacgtatctacagtttactccctatcagtgatagagaacgtatatccagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgaggtaggcgtgtacggtgggcgcctataaaagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagcaattccacaacacttttgtcttatacttgctagcgtcgacaagcttatggactataaggaccacgacggagactacaaggatcatgatattgattacaaagacgatgacgataagatggccccaaagaagaagcggaaggtcggtatccacggagtcccagcagccgacaagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacagcatcaagaagaacctgatcggagccctgctgttcgacagcggcgaaacagccgaggccacccggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatctgcaagagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagactggaagagtccttcctggtggaagaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgagaaagaaactggtggacagcaccgacaaggccgacctgcggctgatctatctggccctggcccacatgatcaagttccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgccagactgagcaagagcagacggctggaaaatctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggcaacctgattgccctgagcctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggatgccaaactgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccagatcggcgaccagtacgccgacctgtttctggccgccaagaacctgtccgacgccatcctgctgagcgacatcctgagagtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatgatcaagagatacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagcagctgcctgagaagtacaaagagattttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggctacattgacggcggagccagccaggaagagttctacaagttcatcaagcccatcctggaaaagatggacggcaccgaggaactgctcgtgaagctgaacagagaggacctgctgcggaagcagcggaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgccattctgcggcggcaggaagatttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaagatcctgaccttccgcatcccctactacgtgggccctctggccaggggaaacagcagattcgcctggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcaccccctggaacttcgaggaagtggtggacaagggcgcttccgcccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacctgcccaacgagaaggtgctgcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtataacgagctgaccaaagtgaaatacgtgaccgagggaatgagaaagcccgccttcctgagcggcgagcagaaaaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaaccggaaagtgaccgtgaagcagctgaaagaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtggaaatctccggcgtggaagatcggttcaacgcctccctgggcacataccacgatctgctgaaaattatcaaggacaaggacttcctggacaatgaggaaaacgaggacattctggaagatatcgtgctgaccctgacactgtttgaggacagagagatgatcgaggaacggctgaaaacctatgcccacctgttcgacgacaaagtgatgaagcagctgaagcggcggagatacaccggctggggcaggctgagccggaagctgatcaacggcatccgggacaagcagtccggcaagacaatcctggatttcctgaagtccgacggcttcgccaacagaaacttcatgcagctgatccacgacgacagcctgacctttaaagaggacatccagaaagcccaggtgtccggccagggcgatagcctgcacgagcacattgccaatctggccggcagccccgccattaagaagggcatcctgcagacagtgaaggtggtggacgagctcgtgaaagtgatgggccggcacaagcccgagaacatcgtgatcgaaatggccagagagaaccagaccacccagaagggacagaagaacagccgcgagagaatgaagcggatcgaagagggcatcaaagagctgggcagccagatcctgaaagaacaccccgtggaaaacacccagctgcagaacgagaagctgtacctgtactacctgcagaatgggcgggatatgtacgtggaccaggaactggacatcaaccggctgtccgactacgatgtggaccatatcgtgcctcagagctttctgaaggacgactccatcgacaacaaggtgctgaccagaagcgacaagaaccggggcaagagcgacaacgtgccctccgaagaggtcgtgaagaagatgaagaactactggcggcagctgctgaacgccaagctgattacccagagaaagttcgacaatctgaccaaggccgagagaggcggcctgagcgaactggataaggccggcttcatcaagagacagctggtggaaacccggcagatcacaaagcacgtggcacagatcctggactcccggatgaacactaagtacgacgagaatgacaagctgatccgggaagtgaaagtgatcaccctgaagtccaagctggtgtccgatttccggaaggatttccagttttacaaagtgcgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctgaacgccgtcgtgggaaccgccctgatcaaaaagtaccctaagctggaaagcgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcggaagatgatcgccaagagcgagcaggaaatcggcaaggctaccgccaagtacttcttctacagcaacatcatgaactttttcaagaccgagattaccctggccaacggcgagatccggaagcggcctctgatcgagacaaacggcgaaaccggggagatcgtgtgggataagggccgggattttgccaccgtgcggaaagtgctgagcatgccccaagtgaatatcgtgaaaaagaccgaggtgcagacaggcggcttcagcaaagagtctatcctgcccaagaggaacagcgataagctgatcgccagaaagaaggactgggaccctaagaagtacggcggcttcgacagccccaccgtggcctattctgtgctggtggtggccaaagtggaaaagggcaagtccaagaaactgaagagtgtgaaagagctgctggggatcaccatcatggaaagaagcagcttcgagaagaatcccatcgactttctggaagccaagggctacaaagaagtgaaaaaggacctgatcatcaagctgcctaagtactccctgttcgagctggaaaacggccggaagagaatgctggcctctgccggcgaactgcagaagggaaacgaactggccctgccctccaaatatgtgaacttcctgtacctggccagccactatgagaagctgaagggctcccccgaggataatgagcagaaacagctgtttgtggaacagcacaagcactacctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttctccaagagagtgatcctggccgacgctaatctggacaaagtgctgtccgcctacaacaagcaccgggataagcccatcagagagcaggccgagaatatcatccacctgtttaccctgaccaatctgggagcccctgccgccttcaagtactttgacaccaccatcgaccggaagaggtacaccagcaccaaagaggtgctggacgccaccctgatccaccagagcatcaccggcctgtacgagacacggatcgacctgtctcagctgggaggcgacaagcgtcctgctgctactaagaaagctggtcaagctaagaaaaagaaaggatccgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctcgggccccaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggaggtcatcaaagagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggagggctccatgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggcggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtccccccagttcatgtacggctccaaggcgtacgtgaagcaccccgccgacatccccgattacaagaagctgtccttccccgagggcttcaagtggg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41、优选地，所述敲入的方法包括crispr/cpf1方法。

42、优选地，所述猪细胞包括猪胎儿成纤维细胞。

43、本发明中，探索诱导dic模型猪猪胰腺内cas9高表达的给药方式，发现按照20～100mg/kg/d(天)的剂量，通过口服加上隔天腹腔注射dox的生理盐水溶液，即可实现cas9蛋白在胰腺不同部位的高表达，并且未观察到由dox引起的不良反应。

44、第二方面，本发明提供第一方面所述的构建可通过药物诱导cas9蛋白表达的模型猪的方法在对猪进行基因编辑中的应用。

45、第三方面，本发明提供一种对猪进行基因编辑的方法，所述方法包括；

46、利用第一方面所述的构建可通过药物诱导cas9蛋白表达的模型猪的方法方法构建模型猪，将基因编辑元件导入所述模型猪的细胞中进行基因编辑。

47、优选地，所述基因编辑元件包括向导rna和/或外源基因表达盒。

48、本发明中，所述向导rna可以是任意靶向目的基因的向导rna，不作特殊限制。

49、本发明中，可通过向导rna对目的基因进行敲除，亦可通过含有ms2环的deadsgrna激活或增强靶基因的mrna转录，从而增加表达水平。

50、本发明中，基于第一方面所述的构建可通过药物诱导cas9蛋白表达的模型猪的方法方法构建的dic模型猪，通过简单地将向导rna传递至dic模型猪胎儿成纤维细胞(pff)和/或特定组织中并在dox诱导后，可以实现体外和/或体内基因编辑(基因敲除或基因激活)和染色体工程。

51、本发明一具体实施例中，应用dic模型猪，通过递送tp53 sgrna，lkb1 sgrna和krasg12d突变体至胰腺内，进行dox诱导后，构建了原发和转移性胰腺导管腺癌(pdac)猪模型。

52、第四方面，本发明提供由第一方面所述的构建可通过药物诱导cas9蛋白表达的模型猪的方法或第三方面所述的对猪进行基因编辑的方法构建的模型猪在药物实验和药物筛选中的应用。

53、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

54、(1)本发明设计构建可通过药物诱导cas9蛋白表达的模型猪的方法，获得的dic模型猪可以实现一猪多用，是猪体内简便高效的基因修饰操作的实施基础，dic猪具有可稳定传代的遗传元件，已形成种系，利于推广应用；

55、(2)利用dic模型猪，单或多基因的遗传干扰，包括基因敲除和基因表达激活，均可以通过简单地递送工程化的向导rna或与转录激活蛋白组合来实现，亦适用于cas9蛋白的毒性作用和线性追踪研究；

56、(3)本发明还实现了成体猪的体内基因编辑，从而快速建立了由肿瘤抑制基因tp53和lkb1敲除，以及活化的原癌基因krasg12d表达，驱动的原发恶性pdac猪模型。