鉴定小菜蛾谷氨酸门控氯离子通道基因突变的方法及引物

本发明涉及生物，尤其涉及鉴定小菜蛾谷氨酸门控氯离子通道基因突变的方法及引物。

背景技术：

1、阿维菌素(avermectin,avms)是由链霉菌中灰色链霉菌streptomycesavermitilis发酵产生的具有杀螨、杀线虫和杀虫活性的十六元大环内酯化合物，以胃毒作用为主，兼具触杀作用。阿维菌素类杀虫剂会引起昆虫共济失调和麻痹，对防治小菜蛾具有显著的效果，目前已成为蔬菜生产上防治小菜蛾的主导药剂之一。

2、小菜蛾(diamondback moth，plutella xylostella)属鳞翅目菜蛾科，是一种分布广泛的世界性害虫，主要为害甘蓝、萝卜、白菜等十字花科类植物，具有生长周期短、世代重叠严重、繁殖能力强等特点，并且具有远距离迁飞能力，在气候条件较为适宜的情况下极易暴发成灾。

3、目前对小菜蛾的防治以化学手段为主。由于化学药剂长期、大量、不合理的使用，小菜蛾对有机磷、有机氯、氨基甲酸盐、拟除虫菊酯、苏云金芽孢杆菌等几乎所有种类的杀虫剂都产生了抗药性。其中部分田间小菜蛾对阿维菌素的抗性发展快速。

4、谷氨酸门控氯离子通道(glucls)是阿维菌素类杀虫剂的重要作用靶标。glucls最早在蝗虫肌肉中发现，在蝗虫的吞咽、运动以及感知中发挥着重要作用。阿维菌素类杀虫剂作用于glucls，可激活氯离子通道，引起向内的氯离子流，使神经膜超极化，抑制兴奋性动作电位的产生，最终引起昆虫死亡。靶标突变是造成小菜蛾对阿维菌素产生抗性的重要原因之一。曾有报道小菜蛾glucls第309位丙氨酸ala突变为缬氨酸val(a309v)与其对阿维菌素的抗性相关。

5、现有技术中，鉴定小菜蛾谷氨酸门控氯离子通道基因突变的方法非常少，缺少一种可以用于检测田间小菜蛾对阿维菌素抗性的新型分子标记。

技术实现思路

1、本发明提供鉴定小菜蛾谷氨酸门控氯离子通道基因突变的方法及引物，用以解决现有技术中缺少一种可以用于检测田间小菜蛾对阿维菌素抗性的新型分子标记的缺陷，实现田间小菜蛾对阿维菌素抗性的检测。

2、本发明提供与阿维菌素类杀虫剂抗性相关的蛋白突变体，所述蛋白突变体在谷氨酸门控氯离子通道蛋白的基础上，第263位的缬氨酸突变为异亮氨酸。

3、本发明还提供编码上述的蛋白突变体的核酸。

4、根据本发明所述的核酸，其核苷酸序列为如下任一种dna分子：

5、1).如seq id no.5所示序列；

6、2).与1)限定的dna序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的dna分子；

7、3)与1)或2)中的dna序列具有90％以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的dna分子。

8、本发明还提供一种谷氨酸门控氯离子通道基因，其核苷酸序列为如下任一种dna分子：

9、1).如seq id no.3所示序列；

10、2).与1)限定的dna序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的dna分子；

11、3).与1)或2)中的dna序列具有90％以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的dna分子。该序列为未突变前的小菜蛾谷氨酸门控氯离子通道基因突变点附近的基因片段。所述seq id no.3与seq id no.5的区别为第145位碱基不同，seq id no.3中为g，seq idno.5中为a。

12、以上均与阿维菌素类杀虫剂抗性相关。

13、在一些实施例中，上述2)中，为在严格条件下与1)限定的dna序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的dna分子。优选的，所述严格条件可为在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc、0.1％sds和1×ssc、0.1％sds各洗膜一次。

14、本发明还提供用于检测上述蛋白突变体的引物。

15、根据本发明所述的引物，其序列seq id no.1～2所示。所述引物可以用于扩增谷氨酸门控氯离子通道基因，判断该基因是否发生突变。该引物也可鉴定或辅助鉴定小菜蛾对阿维菌素类杀虫剂的抗性。

16、本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物。

17、本发明还提供一种鉴定谷氨酸门控氯离子通道基因v263i突变型的方法，使用上述引物，扩增待测昆虫的谷氨酸门控氯离子通道基因，对如seq id no.4所示序列中第787位核苷酸进行判定。seq id no.4为编码小菜蛾glucl受体的全长，用于定位和描述所述突变在受体中的位置(787位核苷酸)，对应在seq id no.3里是扩增片段的第145位。

18、根据本发明提供的鉴定谷氨酸门控氯离子通道基因v263i突变型的方法，扩增待测昆虫的谷氨酸门控氯离子通道基因，对如seq id no.4所示序列中第787位核苷酸的峰进行鉴定；

19、若为单峰g，则为gg基因型,若为双峰g/a，则为ga基因型；若为单峰a，则为aa基因型。

20、在一些实施例中，一种鉴定小菜蛾针对v263i突变的基因型的方法，包括以下步骤：以待测小菜蛾的基因组dna为模板，用如序列seq id no.1、seq id no.2所示的单链dna分子进行普通pcr扩增，凝胶电泳检测可在500bp位置得到一条明亮的dna条带，对单一的dna条带进行测序，根据dna峰图检测5’末端第787位核苷酸是gg基因型、ga基因型还是aa基因型。若第787位核苷酸为单峰g，则为gg基因型,待测小菜蛾疑似对阿维菌素类杀虫剂敏感；若第787位核苷酸为双峰g/a，则为ga基因型,待测小菜蛾疑似对阿维菌素类杀虫剂抗性；若第787位核苷酸为单峰a，则为aa基因型，待测小菜蛾疑似对阿维菌素类杀虫剂抗性。

21、本发明还提供一种鉴定昆虫对阿维菌素类杀虫剂的抗性的方法，扩增待测昆虫的谷氨酸门控氯离子通道基因，对如seq id no.4所示序列中第787位核苷酸进行鉴定；

22、若为gg基因型，待测昆虫对阿维菌素类杀虫剂敏感；若为ga基因型，待测昆虫对阿维菌素类杀虫剂抗性；若为aa基因型，待测昆虫对阿维菌素类杀虫剂抗性。

23、根据本发明所述鉴定昆虫对阿维菌素类杀虫剂的抗性的方法，扩增待测昆虫的谷氨酸门控氯离子通道基因，对如seq id no.4所示序列中第787位核苷酸的峰进行鉴定；

24、若为单峰g，待测昆虫疑似对阿维菌素类杀虫剂敏感；若为双峰g/a，待测昆虫疑似对阿维菌素类杀虫剂抗性；若为单峰a，待测昆虫疑似对阿维菌素类杀虫剂抗性。

25、在一些实施例中，一种辅助鉴定小菜蛾对阿维菌素类杀虫剂的抗性的方法，包括以下步骤：以待测小菜蛾的基因组dna为模板，用如序列seq id no.1、seq id no.2所示的单链dna分子进行普通pcr扩增，凝胶电泳检测可在500bp位置得到一条明亮的dna条带，对单一的dna条带进行测序，根据dna峰图检测5’末端第787位核苷酸是gg基因型、ga基因型还是aa基因型。若第787位核苷酸为单峰g，则为gg基因型,待测小菜蛾疑似对阿维菌素类杀虫剂敏感；若第787位核苷酸为双峰g/a，则为ga基因型,待测小菜蛾疑似对阿维菌素类杀虫剂抗性；若第787位核苷酸为单峰a，则为aa基因型，待测小菜蛾疑似对阿维菌素类杀虫剂抗性。

26、本发明还提供上述蛋白突变体、上述核酸、上述引物、上述试剂盒、上述方法在以下任一种中的应用：

27、1).鉴定谷氨酸门控氯离子通道基因是否发生突变；

28、2).鉴定昆虫的谷氨酸门控氯离子通道蛋白的表型；

29、3).鉴定或辅助鉴定昆虫对阿维菌素类杀虫剂的抗性。

30、根据上述应用，所述昆虫为鳞翅目害虫，优选为菜蛾科昆虫，进一步优选为菜蛾属昆虫，再优选为小菜蛾。

31、根据上述应用，所述阿维菌素类杀虫剂包括阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐中的一种或多种。

32、根据本发明提供的应用，可用于鉴定小菜蛾是否发生了谷氨酸门控氯离子通道基因的v263i突变。所述谷氨酸门控氯离子通道基因的v263i突变指的是谷氨酸门控氯离子通道基因的开放阅读框自5’末端第787位核苷酸由g突变为a(所述小菜蛾的谷氨酸门控氯离子通道基因的开放阅读框为如序列seq id no.4所示自5’末端第1至1344位核苷酸所示的dna分子)。

33、本发明的有益效果：

34、(1)发明人发现小菜蛾glucls存在一个新的突变v263i，将该突变引入敏感种群可导致其以阿维菌素产生100多倍的高水平抗性，因而可以作为一个新的分子标记用于检测，检测结果对于指导合理用药、延缓抗性发展具有重要意义。

35、(2)本发明提供的引物、试剂盒及方法，可以鉴定小菜蛾阿维菌素抗性相关谷氨酸门控氯离子通道的v263i是否发生突变，可用于检测小菜蛾对阿维菌素类杀虫剂的抗性。

36、(3)谷氨酸门控氯离子通道基因5’末端第787位核苷酸aa基因型的小菜蛾对阿维菌素杀虫剂(阿维菌素类杀虫剂)的抗性高于ga基因型的小菜蛾和gg基因型的小菜蛾。本发明所述应用和方法可用于鉴定小菜蛾对阿维菌素杀虫剂(阿维菌素类杀虫剂)的抗性。

37、(4)本发明提供的引物及试剂盒能够有效鉴定出小菜蛾阿维菌素抗性相关谷氨酸门控氯离子通道是否发生v263i突变，从而判断小菜蛾对阿维菌素类杀虫剂的抗性或敏感性，具有快速有效、灵敏度高的优点，对于监测小菜蛾田间种群对阿维菌素类杀虫剂的抗性基因频率和抗性发展水平，及时调整小菜蛾防治策略，指导合理用药、延缓抗性发展具有重要意义。