重组T细胞在体外构建细胞因子风暴模型中的应用

重组t细胞在体外构建细胞因子风暴模型中的应用
技术领域
1.本发明属于冠状病毒药物筛选技术领域，具体涉及重组t细胞在体外构建细胞因子风暴模型中的应用。


背景技术：

2.人类冠状病毒是一类带有囊膜的正义rna病毒，可引起人类高致病性疾病，临床症状表现为从轻微的普通感冒到急性呼吸窘迫综合症和死亡。过去二十年爆发的三种高致病性人类冠状病毒：严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸综合征冠状病毒(mers)和sars-cov-2，展现了人类冠状病毒的大流行潜力。sars-cov-2可以引起上、下呼吸道感染，常伴有发热、咳嗽和嗅觉和味觉丧失，而部分患者出现了更严重的症状，包括全身性炎症、组织损伤、急性呼吸窘迫综合征、血栓栓塞并发症、心脏损伤和/或细胞因子风暴，甚至导致死亡。
3.研究表明，sars-cov-2感染时首先会通过刺突糖蛋白(s蛋白)与上皮细胞表面的血管紧张素转换酶-2(ace-2)结合，随后宿主跨膜蛋白酶丝氨酸2(tmprss2)促进病毒进入细胞。病毒进入细胞后进行主动复制和释放，使宿主细胞发生凋亡并释放损伤相关的分子模式(damp)，包括atp、核酸和asc寡聚物等。大多数患者在感染这一步相对相似，但covid-19的严重程度很大程度上取决于宿主免疫反应的异质性。在健康的免疫反应中，可以通过先天性免疫反应和随后的适应性免疫反应，在病毒扩散之前消灭被感染的细胞。但在有缺陷的免疫反应中，病毒在肺泡上皮细胞的反复复制导致了细胞的程序性细胞死亡和il1β的分泌。邻近的上皮细胞、内皮细胞和巨噬细胞使用各种模式识别受体 (prr)来检测释放的病原体相关分子模式(pamp)和damp，启动先天性免疫反应，分泌大量促炎细胞因子和趋化因子，如白介素(il2、il6、il8、il17、ifnγ)、单核细胞趋化蛋白1(mcp1)和干扰素诱导蛋白10(ip-10)等。这些细胞因子又吸引单核细胞、巨噬细胞和t细胞到达感染部位，造成肺部免疫细胞的进一步积累，导致肺部淋巴细胞浸润气道以及淋巴细胞减少症。这些免疫细胞通过适应性免疫反应建立了一个促炎症反应的反馈回路，随后产生其他炎症细胞因子，包括il7、il10、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、巨噬细胞炎症蛋白1α(mip1α)、肿瘤坏死因子-α(tnfα)等，在人体内引起细胞因子风暴(crs)，最终损害肺组织，并且由此产生的细胞因子风暴会循环到其他器官，导致多器官损伤。
4.细胞因子风暴是在sars-cov-感染患者中观察到的关键病理特征之一，在严重的人类冠状病毒(cov)(如sars和mers)感染中很常见。covd-19危重患者中存在高水平的细胞因子。其中tnfα、il6和il1β主要由先天免疫细胞释放，可能是sars-cov-2 感染晚期患者中细胞因子释放综合征和严重全身炎症反应的主要驱动因素之一。而 ccl2/3/5、cxcl8/9/10、ifn-γ、tnfα、il1β、il1ra、il6、il7、il8、il12、il33、粒细胞/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(g-csf和gm-csf)、血管内皮生长因子a (vegfa)和血小板衍生生长因子亚基b(pdgfb)等趋化因子和细胞因子的升高，进一步导致严重的急性呼吸窘迫综合征(ards)和组织损伤。细胞因子风暴主要由巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、nk细胞、b细胞和t细胞
为主的多种免疫细胞的过度激活产生。虽然树突状细胞和巨噬细胞通过抗原递呈激活的sars-cov-2特异性t细胞可以在早期介导抗病毒应答，但sars-cov-2的免疫逃逸能力可能使t细胞难以产生有效的抗病毒应答，重要的是，t细胞介导的炎症和固有免疫细胞的持续激活可能是导致肺部病理和严重病例中出现的继发性并发症的因素。同时研究发现t细胞或b细胞激活很少的患者病情较轻，而cd4
+
t细胞和cd8
+
t细胞过度激活的患者病情更严重，也表明t细胞在介导covid-19患者炎症反应的作用。这些证据表明covid-19可能是一个免疫相关疾病，成为首个有强有力证据支持使用免疫疗法的严重急性传染病，因此通过免疫调控的治疗方法将对减轻炎症反应、改善患者的生存、降低死亡率有重要作用。
5.面对新冠病毒的全球大流行形势，科学家们一直在寻求开发预防、治疗sars-cov-2 感染的疫苗和有效药物，但目前还没有具体有效的治疗方法。除了疫苗研发外，主要的治疗药物包括抗病毒药物及免疫调节药物。抗病毒药物针对的是病毒感染进入细胞过程中的介导物，包括受体结合域(rbd)/血管紧张素转换酶2(ace2)、跨膜蛋白酶丝氨酸2 (tmprss2)、3c样蛋白酶(m
pro
)、rna依赖的rna聚合酶(rdrp)等，通常在疾病早期使用。免疫调节药物通过调节免疫反应，缓解炎症反应、细胞因子风暴及继发的组织损伤和急性呼吸窘迫综合征等症状。旨在减轻疾病严重程度的治疗方法的研发也是全球最重要的优先事项。目前使用的免疫调节药物主要包括三类。第一类是以地塞米松为主的皮质类固醇，多项研究表明地塞米松能够降低患者死亡率，特别是对治疗期间病情加重的患者具有显著有益效果。但值得注意的是，皮质类固醇类药物由于广泛的、非特异的免疫抑制作用，可能在治疗早期对患者产生有害作用。第二类是激酶抑制剂，比如jak抑制剂巴瑞替尼(baricitinib)。研究表明baracitinib治疗组患者相较于安慰剂组恢复时间更短，并且baracitinib治疗能够降低患者死亡率，在需要高流量氧气或无创通气的亚组中效果更为明显。fda最近批准baracitinib用于紧急治疗covid-19。另外，一种胞质多酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(imatinib)也在荷兰一项针对400名covid-19住院患者的临床试验中发现具有较好的效果，但是这些发现需要后续试验来验证，并判断哪些患者可能受益于伊马替尼治疗。在研的其他激酶抑制剂包括bruton’s酪氨酸激酶抑制剂(如ibrutinib、 acalabrutinib、zanubrutinib)、磷脂酰肌醇-3激酶(pi3k)/雷帕霉素(mtor)抑制剂(如 duvelisib、temsirolimus)，以及jak抑制剂(如ruxolitinib、tofacitinib)。除了部分酪氨酸激酶抑制剂展现出的有益效果外，前期研究已表明酪氨酸激酶的多效性(可以阻断细胞因子信号通路和许多免疫效应因子通路)，以及大部分酪氨酸激酶抑制剂众所周知的临床安全性，说明酪氨酸激酶抑制剂是一个很有潜力的covid-19治疗方法。第三类是靶向细胞因子的药物，这类药物目前以抗il1和il6为主。il1和il6均可引起局部效应，如巨噬细胞激活、内皮渗漏和液体外渗，以及全身效应。但是有两项研究发现，il1抑制剂anakinra 的治疗并未产生显著的效果。而随后的进一步研究发现，anakinra对血浆高可溶性尿激酶纤溶酶原受体(supar)的患者有效，因此anakinra的应用需在supar含量指导下进行。另外，il1β阻断剂canakinumab在试验中也没有产生明显效果。相比之下，il6的阻断疗法似乎更有效。其中托珠单抗(tocilizumab)和salilumab在临床试验中都表现出降低死亡率、改善患者生存的作用。除il1-il6轴的促炎细胞因子外，其他促炎细胞因子也参与了covid-19介导的炎症。临床试验表明抗gm-csf抗体otilimab对70岁以上老人有显著效果，但需要注意的是这种年龄依赖性提示其对年轻病人可能产生副反应。另外抗tnf 疗法目前也在进行临床试验
(nct04705844)。针对covid-19的细胞因子靶向治疗策略似乎是一种有吸引力的方法，但考虑到covid-19介导的炎症反应具有复杂性，而细胞因子特异性靶向治疗效果较为单一，因此可能需要精确检测生物标志物的随机对照试验来帮助进一步确定哪些患者可能受益最多。除了以上三类免疫调节药物外，其他的免疫调控策略还包括抗补体疗法(如抗c5a抗体vilobelimab)、刺激抗病毒防御的干扰素(如ifnβ、 ifnγ)等。
6.covid-19的抗炎治疗方法虽然已有很大程度的发展，但是目前面临的一个主要困境是，尽管使用了地塞米松和il6阻断抗体等免疫治疗药物，但一些covid-19患者的治疗没有改善，仍然存在严重的炎性反应，同时也没有足够的随机对照试验来指导用药。另外宿主-病原体反应和由此产生的免疫环境是异质性的、动态的，这也表明并非每个患者都能从相同的免疫调节治疗策略中受益。因此有必要增加潜在的治疗选择，以应对患者未能产生反应的情况以及进一步缓解严重病例的症状。另外需要注意的是，目前使用的一些抗体疗法或联合疗法面临着价格昂贵的问题，难以保证所有患者获得平等的治疗机会。因此除了增加替代疗法和改善效果外，发现更便宜的替代药物，才能更好的完善covid-19 的治疗策略。


技术实现要素：

7.本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供重组t细胞在体外构建细胞因子风暴模型中的应用。
8.本发明的另一目的在于提供一种细胞因子风暴模型的体外构建方法。
9.本发明的再一目的在于提供上述体外构建方法所构建的细胞因子风暴模型在抗炎药物高通量体外筛选中的应用。
10.本发明的又一目的在于提供一种重组t细胞。
11.本发明的技术方案如下：
12.重组t细胞在体外构建细胞因子风暴模型中的应用，该重组t细胞的细胞膜表面修饰有如seq id no.01或seq id no.04所示的sars-cov-2s特异性嵌合抗原受体。
13.在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：
14.(1)制备表达新冠病毒表面s蛋白的293t细胞；
15.(2)将步骤(1)所得的293t细胞以1.8-2.2
×
104接种后，于36-38℃、4.5-5.5％co2培养箱中培养10-12h，再加入所述重组t细胞和单核细胞系thp-1细胞于36-38℃、 4.5-5.5％co2培养箱中共培养70-75h，其中，重组t细胞与培养后的293t细胞的效靶比为5-30：1，单核细胞系thp-1细胞与培养后的293t细胞的比例为2-50：1。
16.进一步优选的，所述重组t细胞与所述培养后的293t细胞的效靶比为5-10：1，所述单核细胞系thp-1细胞与所述培养后的293t细胞的比例为5-10：1。
17.本发明的另一技术方案如下：
18.一种细胞因子风暴模型的体外构建方法，包括如下步骤：
19.(1)制备表达新冠病毒表面s蛋白的293t细胞；
20.(2)将步骤(1)所得的293t细胞以1.8-2.2
×
104接种后，于36-38℃、4.5-5.5％co2培养箱中培养10-12h，再加入所述重组t细胞和单核细胞系thp-1细胞于36-38℃、4.5-5.5％co2培养箱中共培养70-75h；
21.该重组t细胞的细胞膜表面修饰有如seq id no.01或seq id no.04所示的 sars-cov-2s特异性嵌合抗原受体。
22.在本发明的一个优选实施方案中，所述重组t细胞与所述培养后的293t细胞的效靶比为5-30∶1，所述单核细胞系thp-1细胞与所述培养后的293t细胞的比例为2-50∶1。
23.进一步优选的，所述重组t细胞与所述培养后的293t细胞的效靶比为5-10∶1，所述单核细胞系thp-1细胞与所述培养后的293t细胞的比例为5-10∶1。
24.本发明的再一技术方案如下：
25.上述体外构建方法所构建的细胞因子风暴模型在抗炎药物高通量体外筛选中的应用。
26.一种抗炎药物高通量体外筛选方法，采用上述体外构建方法所构建的细胞因子风暴模型。
27.在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：
28.(1)制备表达新冠病毒表面s蛋白的293t细胞；
29.(2)将步骤(1)所得的293t细胞以1.8-2.2
×
104接种后，于36-38℃、4.5-5.5％co2培养箱中培养10-12h，再加入所述重组t细胞、单核细胞系thp-1细胞以及待筛选的药物于36-38℃、4.5-5.5％co2培养箱中共培养70-75h，该药物的工作浓度为8-12μm；然后通过elisa检测主要细胞因子的分泌量，该主要细胞因子包括mip1α、sdf1α、il27、 il1β、il2、il4、il5、ip10、il6、il7、il8、il10、eotaxin、il12p70、il13、il17a、 il31、il1ra、rantes、ifnγ、gm-csf、tnfα、mip1β、ifnα、mcp1、il9、tnfβ、 groα/kc、il1α、il23、il15、il18、il21和il22；
30.(3)将自然t细胞以4.5-5.5
×
105接种后，加入待筛选的药物使其工作浓度为10μm，共培养70-75h后使用台盼蓝对细胞进行计数，计算t细胞的死亡率以判断该药物对t细胞的毒性；
31.(4)综合步骤(2)所得的分泌量和步骤(3)所得的毒性来筛选药物。
32.本发明的又一技术方案如下：
33.一种重组t细胞，其细胞膜表面修饰有如seq id no.01或seq id no.04所示的sars-cov-2s特异性嵌合抗原受体。
附图说明
34.图1为本发明实施例中的sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)特异性嵌合抗原受体fc-sars-cov-2s car或hinge-sars-cov-2 car的结构示意图。其中，sp(signal peptide) 1表示il2r来源的跨膜信号肽，rbdscfv表示针对s蛋白的受体结合区(rbd)的特异性单链抗体，igg1 fc和igg1 hinge表示两种igg1来源的铰链区，cd28 tm (transmembrane domain)表示cd28来源的跨膜结构区，cd28表示cd28来源的胞内共刺激信号域，cd3ζ表示cd3ζ来源的胞内信号域。
35.图2为本发明实施例2中使用egfp标记的s蛋白孵育后，利用流式检测实施例1中转染60h后的293t上表达的两种嵌合抗原受体与s蛋白结合的效率图。
36.图3为本发明实施例2中使用抗人igg1 fc或抗人igg(fab
′
)2流式抗体，利用流式检测实施例1中转染60h后的293t上所述嵌合抗原受体的表达效率图。
37.图4为本发明实施例3中所培养的人原代t淋巴细胞经过t细胞培养基富集培养后， t细胞表面标志物cd3和cd8的表达效率图。
38.图5为本发明实施例3中所制备的sars-cov-2s car-t细胞表面car的表达效率图。
39.图6为本发明实施例5中所检测的sars-cov-2s car-t(car-t)细胞与293t或 s-293t细胞共培养48h后表面激活标志物cd69和cd25的表达效率图。
40.图7为本发明实施例5中所检测的sars-cov-2s car-t(car-t)细胞与293t或 s-293t细胞共培养14天内的细胞生长曲线。
41.图8为本发明实施例5中所检测的sars-cov-2s car-t(car-t)细胞与293t或 s-293t细胞以不同效靶比共培养72h后细胞因子ifnγ、tnfα、il2、granzyme b、perforin、 gm-csf、il6和il10的分泌量。
42.图9为本发明实施例5中所检测的sars-cov-2s car-t(car-t)细胞在不同效靶比和不同时间下对293t或s-293t细胞的杀伤率。
43.图10为本发明实施例5中所检测的sars-cov-2s car-t(car-t)细胞以不同效靶比与gfp阳性的293t或s-293t细胞共培养96h后，gfp阳性细胞数量的变化情况。
44.图11为本发明实施例6中所检测的s-293t细胞刺激下，sars-cov-2s car-t (car-t)的增殖、激活相、ifnγ响应、细胞杀伤相关基因的变化情况。
45.图12为本发明实施例6中所检测的s-293t细胞刺激下，sars-cov-2s car-t (car-t)的初始t细胞相关基因及效应t细胞相关基因的变化情况。
46.图13为本发明实施例6中所检测的s-293t细胞刺激下，sars-cov-2s car-t (car-t)的耗竭表型相关的转录因子及免疫检查点的变化情况。
47.图14为本发明实施例7中所检测的s-293t细胞刺激下，sars-cov-2s car-t (car-t)细胞表面cd8、cd62l、ccr7的表达率。
48.图15为本发明实施例7中所检测的s-293t细胞刺激下，sars-cov-2s car-t (car-t)细胞表面cd45ro、cd45ra、cd62l的表达率。
49.图16为本发明实施例7中所检测的s-293t细胞刺激下，sars-cov-2s car-t (car-t)细胞表面pdl、tim3、lag3的表达率。
50.图17为本发明实施例7中所检测的s-293t细胞刺激下，sars-cov-2s car-t (car-t)细胞中cd4、cd25、foxp3的表达率。
51.图18为本发明实施例9中s-293t与加入不同比例(0∶1、2∶1、10∶1)的thp-1细胞后，同时在sars-cov-2s car-t细胞(s-293t∶car-t＝10∶1)共培养下，通过elisa 检测的细胞上清中ifnγ和il6的分泌量。
52.图19为本发明实施例9中sars-cov-2s car-t与s-293t以10∶1的效靶比共培养下，同时加入不同比例(thp-1∶s-293t＝0∶1，2∶1或10∶1)的thp-1细胞后，所检测的细胞上清中34种细胞因子、趋化因子的分泌量。
53.图20为本发明实施例10中s-293t、sars-cov-2s car-t、thp-1共培养下，分别加入1049种fda批准药物后，所检测的细胞上清中il8分泌量的热图。
54.图21为本发明实施例10中s-293t、sars-cov-2s car-t、thp-1共培养下，分别加入通过il8分泌抑制筛选出的fda批准药物后，所检测的细胞上清中ifnγ分泌量的热图。
55.图22为本发明实施例10中从fda批准药物中筛选出的能抑制il8和ifnγ分泌的药
物，对t细胞的毒性作用。
56.图23为本发明实施例10中进行抗炎药物高通量筛选的流程图。
57.图24为本发明实施例11中s-293t、sars-cov-2s car-t、thp-1共培养下，分别加入4中筛选药物(#1 felodipine、#2 fasudil、#3 imatinib、#4 caspofungi)后，所检测的细胞上清中34种细胞因子、趋化因子的分泌量的热图。
58.图25为本发明实施例12中sars-cov-2s car-t与s-293t在5∶1的效靶比共培养下，分别加入4中筛选药物(#1 felodipine、#2 fasudil、#3 imatinib、#4 caspofungi)后， sars-cov-2s car-t在不同时间下的杀伤作用。
59.图26为本发明实施例13中使用黄金地鼠进行sars-cov-2病毒攻毒及药物治疗以评价felodipine、imatinib、caspofungi、fasudil体内作用的实验策略图。
60.图27为本发明实施例13中对照组及felodipine、imatinib、caspofungi、fasudil治疗组的黄金地鼠的体重变化曲线图及各时间点下的显著性分析表。
61.图28为本发明实施例13中对照组及felodipine、imatinib、caspofungi、fasudil治疗组的黄金地鼠的生存曲线图。
62.图29为本发明实施例13中对照组及felodipine、imatinib、caspofungi、fasudil治疗组的黄金地鼠在终点(第7天)的肺组织照片。
63.图30为本发明实施例13中对照组及felodipine、imatinib、caspofungi、fasudil治疗组的黄金地鼠的肺组织切片的he染色结果图(以未攻毒黄金地鼠的肺组织作为阴性对照)。
64.图31为本发明实施例13中对照组及felodipine、imatinib、caspofungi、fasudil治疗组的黄金地鼠的肺组织切片的he染色病理评分柱状图(以未攻毒黄金地鼠的肺组织作为阴性对照)。
65.图32为本发明实施例13中通过rt-qpcr检测的对照组及felodipine、imatinib、 caspofungi、fasudil治疗组的黄金地鼠肺组织中炎症因子基因的表达热图(以未攻毒黄金地鼠的肺组织作为阴性对照)。
66.图33为本发明实施例13中通过elisa检测的对照组及felodipine、imatinib、 caspofungi、fasudil治疗组的黄金地鼠肺组织中代表性炎症因子的表达图(以未攻毒黄金地鼠的肺组织作为阴性对照)。
具体实施方式
67.以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
68.实施例1
69.本实施例为sars-cov-2s car重组慢病毒的包装和制备方法。
70.在转染前两天，将293t以2.5
×
106铺于10cm板中，使用8ml完全培养基dmem+ 10％fbs进行培养。转染前2-4h，将293t培养基更换为7ml完全培养基rmpi 1640+ 10％fbs。转染时将84μlpei溶解于600μl基础培养基rmpi 1640中，静置2min；接着将42μg质粒溶解于600μl基础培养基rpmi 1640中，其中基于pcdh载体的 sars-cov-2s car重组转移载体(结构如图1所示，fc-sars-cov-2s car对应的重组转移载体的核苷酸序列如seq id no.03，hinge-sars-cov-2 car对应的重组转移载体的核苷酸序列如seq id no.06所示)、pspax和pmd2g
的比例为4∶3∶1，随后将pei溶液加入质粒溶液中，立即震荡8s，静置8min后加入293t细胞中。转染12h后，将293t 培养基更换为12ml完全培养基dmem+10％fbs。转染60h后收取细胞上清，3500rpm 离心5min，获得上清用0.22μm滤膜过滤，随后用millipore超滤离心管浓缩20-40倍得到慢病毒。使用abm公司生产的qpcr lentivirus titration(titer)kit测定慢病毒滴度，滴度可以达到1
×
109iu/ml-1
×
10
10 iu/ml。随后分装放置于-80℃保存。同时，收集转染60h后的293t细胞，通过实施例2中的检测方法鉴定car的表达及抗原结合的能力。
71.实施例2
72.本实施例为sars-cov-2s car的抗原结合能力和表达能力检测方法。
73.收取实施例1中转染60h后的293t细胞，1000rpm离心5min弃去上清，pbs清洗 2次，随后以1
×
106个/ml加入pbs悬浮细胞，加入egfp标记的s蛋白或抗人igg1 fc 抗体，4℃避光孵育40min后pbs洗涤、重悬，最后使用流式细胞仪检测分别检测与s 蛋白的结合效率以及car的表达水平。结合效率结果如图2所示，fc-sars-cov-2s car (氨基酸序列如seq id no.01所示，核苷酸序列如seq id no.02所示)与s蛋白的结合效率为62％，而hinge-sars-cov-2 car(氨基酸序列如seq id no.04所示，核苷酸序列如seq id no.05所示)与s蛋白的结合效率相对较低，为51％。car在293t上的表达水平如图3所示，达到99.8％。
74.实施例3
75.本实施例为本发明所述sars-cov-2s car-t细胞的制备方法。
76.(1)人原代t淋巴细胞的分离和培养：用人外周血淋巴细胞分离液ficoll(天津灏洋公司生产)分离获得淋巴细胞，用含10％fbs及cd3、cd28抗体及细胞因子的x-vivo (lonza公司生产)培养基作为t细胞培养基，调整细胞密度为1
×
106个/ml进行培养，刺激培养72h后通过流式检测cd3和cd8的表达并进行后续实验。流式检测结果如图4 所示，分离培养的细胞cd3阳性率达99.9％，表明成功从外周血中获得t细胞，同时其中55％为cd8阳性t细胞。
77.(2)慢病毒感染人原代t细胞：将培养的人原代t淋巴细胞以每孔2
×
105个细胞接种到24孔板中，以moi为100-400，加入实施例1中制备的对应fc-sars-cov-2s car 的慢病毒混合均匀，在板式离心机中800
×
g、32℃离心50-60min，进行感染，随后在 37℃、5％co2培养箱中培养12h后，取出细胞后1000rpm离心弃去上清，每孔用500μl 新鲜t细胞培养基悬浮后加入24孔板中或再次感染(加入步骤(1)中制备的慢病毒混合均匀，在板式离心机中800
×
g、32℃离心50-60min，进行感染，随后在37℃、5％co2 培养箱中培养12h后，取出细胞后1000rpm离心弃去上清，每孔用500μl新鲜t细胞培养基悬浮后加入24孔板中)，后续以隔天换液的方式培养4-7天。
78.(3)检测car表达水平：收取car-t细胞，1000rpm离心5min弃去上清，pbs 清洗2次，随后以1
×
106个/ml加入pbs悬浮细胞，加入抗人igg1 fc抗体混匀，4℃避光孵育40min后pbs洗涤、重悬，最后使用流式细胞仪检测。结果如图5所示，制备的 fc-sars-cov-2s car-t细胞表面car表达效率为37.2％。
79.实施例4
80.本实施例为本发明中表达s蛋白的293t细胞(s-293t)的制备方法。
81.将新冠毒株s基因克隆到pcag-egfp载体中，构建s基因表达载体pcag-s-egfp。转染前24h，将293t以1
×
106每孔铺于六孔板中。转染时将5μl转染试剂lipofectamine
tm 3000
(thermo fisher公司生产)加入125μl基础培养基rmpi 1640中进行稀释；另外将 2.5μg pcag-s-egfp质粒及5μl p3000
tm
试剂(thermo fisher公司生产)加入125μl基础培养基rpmi 1640中进行稀释，随后将稀释的质粒/p3000
tm
试剂加入稀释的 lipofectamine
tm 3000试剂中混合，室温孵育10-15min后加入293t细胞中。转染24h后，将细胞消化并进行后续实验。
82.实施例5
83.本实施例为本发明所述sars-cov-2s car-t的体外活性验证。
84.(1)抗原刺激活化作用：将实施例3中所制备的sars-cov-2s car-t细胞(所用 car结构为fc-sars-cov-2 car)分别与实施例4中所制备的s-293t细胞或293t以 2∶1的效靶比共培养48h。使用流式检测共培养后的sars-cov-2s car-t表面的激活标志物cd69和cd25的表达。
85.图6的流式结果显示，与293t细胞共培养后，cd3阳性的sars-cov-2s car-t细胞表面不表达c69和cd25；与s-293t细胞共培养后，cd3阳性的sars-cov-2s car-t 细胞表面cd69和cd25的表达率可以达到33％以上。表明sars-cov-2s car-t细胞能识别结合s-293t细胞表面表达的s蛋白，产生抗原特异性刺激活化的作用。
86.(2)细胞增殖能力：将实施例3中所制备的sars-cov-2s car-t细胞(所用car 结构为fc-sars-cov-2 car)分别与293t或实施例4中所制备的s-293t细胞以2：1的效靶比共培养，分别在第2、4、6、8、10、12天下取出悬浮的t细胞，使用台盼蓝对细胞进行计数。结果如图7所示，sars-cov-2s car-t细胞在与s-293t细胞共培养后，细胞增殖速率显著增高。
87.(3)细胞因子分泌能力：将实施例3中所制备的sars-cov-2s car-t细胞(所用 car结构为fc-sars-cov-2 car)分别与293t或实施例4中所制备的s-293t细胞按如下效靶比共培养：1∶1、3∶1、6∶1、10∶1、20∶1、30∶1，共培养72h后，使用elisa检测分泌到细胞上清中的细胞因子ifnγ、tnfα、il2、granzyme b、perforin、gm-csf、il6 和il10的水平。结果如图8所示，sars-cov-2s car-t细胞在与s-293t细胞共培养后，细胞因子分泌水平显著增高，且均呈现出效靶比梯度的依赖性，即效靶比越高，细胞因子分泌量越高；在sars-cov-2s car-t细胞的最高剂量下，ifn、perforin、granzymeb和 gm-csf的分泌量高达10000-20000pg/ml。
88.(4)靶细胞杀伤作用：基于xcelligence多功能实时无标记细胞分析系统(rtca) 检测细胞杀伤的实验中，将293t或实施例4中所制备的s-293t细胞以1
×
104个/孔铺于 e-plate 16板(agilent公司生产)中，培养24h后，分别加入实施例3中所制备的 sars-cov-2s car-t细胞(所用car结构为fc-sars-cov-2 car)与293t或s-293t 细胞按1∶1、3∶1、6∶1、10∶1、20∶1、30∶1的效靶比共培养。使用xcelligence多功能实时无标记细胞分析仪实时动态监测贴壁的s-293t细胞的细胞指数至96h。细胞杀伤率按以下公式进行计算：
89.基于gfp荧光检测细胞杀伤的实验中，将293t或实施例4中所制备的s-293t细胞 (表达绿色荧光蛋白egfp)以2
×
104个/孔铺于96孔板中，培养24h后，分别加入实施例3中所制备的sars-cov-2s car-t细胞(所用car结构为fc-sars-cov-2 car)与 293t或s-293t细胞按1∶1、3∶1、6∶1、10∶1、20∶1、30∶1的效靶比共培养96h。使用高内涵成像系统(operetta cls equipment)扫描荧光图像，随后用columbus分析系统对gfp 阳性293t或s-293t细胞进行定量分析。
90.图9和图10分别显示了rtca检测的细胞杀伤以及gfp阳性的293t或s-293t细胞的
数量。当效靶比超过10：1后，所述sars-cov-2s car-t对表达s蛋白的s-293t细胞的杀伤率或gfp阳性细胞降低的数量开始显著增高，且随效靶比增加而增强，达到30：1 时，杀伤率接近80％，说明sars-cov-2s car-t细胞产生了抗原特异性杀伤作用。
91.本实施例说明本发明所述sars-cov-2s car-t细胞在体外与表达s蛋白的s-293t 细胞共培养后能够特异性激活、增殖、分泌大量细胞因子，并产生杀伤作用。
92.实施例6
93.本实施例鉴定了本发明所述sars-cov-2s car-t在s-293t细胞抗原特异性刺激下的特征基因变化。
94.用6孔板以4
×
105每孔接种实施例4中所制备的s-293t细胞或293t细胞，37℃、 5％co2培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，以1.2
×
106(即效靶比为3：1)每孔加入实施例3中所制备的sars-cov-2s car-t(所用car结构为fc-sars-cov-2 car)细胞，共孵育48h；分离悬浮的sars-cov-2s car-t，用eastep super total rna extraction kit (promega公司生产)提取总rna，随后通过rt-qpcr检测标志性基因。
95.结果如图11-13所示。图11显示在s-293t细胞刺激下，sars-cov-2s car-t上增殖相关基因(il2等)、激活相关基因(nfat5等)、ifnγ响应相关基因(ifng等)、细胞杀伤相关基因(faslg等)表达上调。图12显示，在s-293t细胞刺激下，sars-cov-2scar-t上初始t细胞相关代表性基因(actn1、foxp1、tcf7等)表达下调，而效应t 细胞相关代表性基因(gzma、tbx21、eomes等)表达上调。图13显示，s-293t细胞刺激下，sars-cov-2s car-t上耗竭表型相关的转录因子(irf4、batf等)及免疫检查点分子(lag3、pd1等)表达升高。
96.实施例7
97.本实施例检测了本发明所述sars-cov-2s car-t在s-293t细胞抗原特异性刺激下的亚群和表型变化。
98.用6孔板以4
×
105每孔接种实施例4中所制备的s-293t细胞或293t细胞，37℃、5％co2培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，以8
×
105每孔加入实施例3中所制备的 sars-cov-2s car-t(所用car结构为fc-sars-cov-2 car)或ctlt细胞，共孵育 48h；收集s-293t刺激/未刺激的sars-cov-2s car-t或ctlt细胞，1000rpm离心5min，用pbs清洗2次，随后用pbs将细胞稀释为1
×
106个/ml，加入不同荧光标记的抗体对 t细胞膜表面标志物进行染色，4℃避光孵育40min后pbs洗涤；进一步地，细胞固定、通透、缓冲液清洗后，加入荧光抗体对胞内标志物进行染色，4℃避光孵育40min后pbs 洗涤，最后使用流式细胞仪检测。其中cd3的染色用于标记car-t细胞，cd8、cd62l、 ccr7、cd45ra、cd45ro的染色用于鉴定不同t细胞亚群，cd4、cd25、foxp3用于检测treg细胞，pd1、tim3、lag3用于检测耗竭性t细胞。
99.结果如图14至17所示，s-293t细胞刺激后，sars-cov-2s car-t细胞的亚群、表型发生明显变化，而ctlt几乎没有变化。其中，图14显示，刺激后的sars-cov-2s car-t 细胞中cd62l阳性细胞显著减少，而ccr7阳性细胞增加，表明cd62-ccr7+的中间记忆t细胞(t
im
)(一类病毒相关记忆t细胞)显著增加；图15显示，刺激后增加的cd62l 阴性sars-cov-2s car-t细胞中有76％是cd45ro+cd45ra-的中央记忆t细胞(t
cm
)， 24％是cd45ro+cd45ra+的干细胞记忆t细胞(t
scm
)；图16显示，刺激后sars-cov-2scar-t细胞表面耗竭标志物pd1、tim3、lag3的表达均升高；图17显示，刺激后 sars-cov-2s car-t细胞中cd25+foxp3+的调节性t细胞显著增加。
100.本实施例联合实施例6的rt-qpcr检测，说明s-293t细胞刺激后，sars-cov-2scar-t细胞表现出与covid-19病人中病毒特异性t细胞相似的特征，具体表现为初始 t细胞减少、t
cm
和t
scm
增加、调节性t细胞增加，以及耗竭相关标志物表达升高等。
101.实施例8
102.本实施例构建了基于sars-cov-2s car-t细胞的细胞因子风暴模型。
103.(1)单核细胞系thp-1细胞添加比例的摸索：将实施例4中所制备的s-293t细胞以2
×
104接种于96孔板中，37℃、5％co2培养箱中培养12h，随后以与s-293t 10∶1的效靶比加入sars-cov-2s car-t(所用car结构为fc-sars-cov-2 car)细胞，同时分别以相对于s-293t的不同比例(2∶1、10∶1、50∶1)加入thp-1，共培养72h后收集细胞上清，通过elisa检测ifnγ和il6的分泌量。结果如图18所示，s-293t与thp-1共培养时几乎不分泌ifnγ和il6分泌量；在s-293t、thp-1的共培养下，sars-cov-2 car-t 的ifnγ和il6分泌量显著增高，当thp-1细胞以相对于s-293t细胞10∶1的比例加入后， ifnγ和il6分泌量最高。
104.(2)共培养上清的多细胞因子检测：收集s-293t与sars-cov-2s car-t(10∶1)，以及同时加入thp-1(0∶1，2∶1或10∶1)共培养72h后的细胞上清，12000rpm离心10min 后，使用procartaplex hu cytokine/chemokine panel(invitrogen公司生产)对34种细胞因子、趋化因子的分泌量进行检测。结果如图19所示，s-293t、sars-cov-2 car-t (s-293t：car-t＝10：1)、thp-1(s-293t：thp-1＝10：1)共培养下的细胞因子和趋化因子分泌量最多，分泌的主要细胞因子和趋化因子包括il8(cxcl8)、il1b、il4、il5、 ifnγ、il13、gm-csf、rantes(ccl5)、il6、il22、tnfβ、ip-10(cxcl10)、mip-1β (ccl4)、tnfα、il18、mip-1α(ccl3)及sdf1α(cxcl12)，均超过1000pg/ml，其中il8的分泌量最高。
105.本实施例通过s-293t对sars-cov-2s car-t的刺激活化协同单核细胞thp-1构建了一个sars-cov-2病毒s蛋白特异性的细胞因子风暴模型。
106.实施例9
107.本实施例为通过本发明所述的细胞因子风暴模型进行抗炎药物高通量筛选的方法。
108.(1)基于eilsia法的高通量筛选：将实施例4中所制备的s-293t细胞以2
×
104接种于96孔板中，37℃、5％co2培养箱中培养贴壁后，以5∶1的效靶比加入sars-cov-2scar-t(所用car结构为fc-sars-cov-2 car)细胞，并以相对于s-293t 5∶1的比例加入thp-1细胞，同时加入fda批准药库(mce公司生产)中的药物使其工作浓度为10μm，共培养72h后收集细胞上清，通过elisa检测主要细胞因子ifnγ和il8的分泌量。
109.(2)t细胞毒性评价：将t细胞以5
×
105接种于24孔板中，同时加入fda批准药库(mce公司生产)中的药物使其工作浓度为10μm，共培养72h后使用台盼蓝对细胞进行计数，计算t细胞的死亡率以判断药物对t细胞的毒性。
110.结果如图20和21所示。对1049个fda批准药物进行筛选后，有39个药物可以显著降低模型中il8和ifnγ的分泌量。图22显示，筛选出的39个药物中有4个药物 (felodipine、imatinib、caspofungi、fasudil)对t细胞的副作用极低(毒性小于30％)。本实施例表明通过图23所示筛选流程，从1049个fda批准药物中成功筛选出了4种药物用于进一步评价。
111.实施例10
112.本实施例评价了实施例9中筛选的4种药物(felodipine、imatinib、caspofungi、
fasudil) 在细胞因子风暴模型中的抗炎作用。
113.将实施例4中所制备的s-293t细胞以2
×
104接种于96孔板中，37℃、5％co2培养箱中培养贴壁后，以10∶1的效靶比加入sars-cov-2s car-t(所用car结构为 fc-sars-cov-2 car)细胞，并以相对于s-293t细胞10∶1的比例加入thp-1细胞，同时分布加入felodipine、imatinib、caspofungi、fasudil使其工作浓度为10μm，共培养72 h后；收集细胞上清，使用procartaplex hu cytokine/chemokine pane1(invitrogen公司生产)对34种细胞因子、趋化因子的分泌量进行检测。
114.结果如图24所示，实施例10中筛选的药物felodipine、imatinib、caspofungi和fasudil 除了抑制il8和ifnγ的分泌外，对其他细胞因子也产了广谱的抑制作用。
115.实施例11
116.本实施例评价了实施例9中筛选的4种药物(felodipine、imatinib、caspofungi、fasudil) 对于sars-cov-2s car-t杀伤作用的影响。
117.将实施例4中所制备的s-293t细胞以2
×
104接种于e-plate 16板(agilent公司生产) 中，并连接实时无标记细胞分析仪观察细胞生长情况，待细胞生长至接种数量的1.2倍时，以5∶1的效靶比加入sars-cov-2s car-t(所用car结构为fc-sars-cov-2 car)细胞，同时分别加入felodipine、imatinib、caspofungi、fasudil使其工作浓度为10μm，共培养48h后，结束观察，分析数据计算其实时杀伤效率。
118.结果如图25所示，实施例9中筛选的药物felodipine、imatinib、caspofungi和fasudil 显著增强s-293t细胞刺激下sars-cov-2s car-t细胞的杀伤作用，其中felodipine和 caspofungin的作用最强。
119.实施例12
120.本实施例验证了实施例9中筛选的药物felodipine、imatinib、caspofungi和fasudil 在体内对sars-cov-2感染及引起的炎症反应的作用。
121.使用8-14周龄的黄金地鼠，用异氟醚麻醉后，鼻注射100μlpbs稀释的1
×
104pfu 剂量的sars-cov-2病毒；将黄金地鼠以每组6只分为对照组(untreated)、felodipine组、 imatinib组、fasudil组、caspofungin组5组；分别在第1、2、3、4天分别用15mg/kg 剂量的药物进行治疗，其中felodipine、fasudil和caspofungin使用腹腔给药，imatinib 通过灌胃给药；观察至对照组黄金地鼠死亡(第7天)，每天通过电子天平测定黄金地鼠的体重(实验策略如图26所示)。第7天处死治疗组黄金地鼠，获得肺组织观察肺部病变情况并拍照，随后通过甲醇固定、脱水、石蜡包埋、切片获得肺组织切片，用于he染色检测病理情况，根据各肺叶上肺泡间隔增厚及实变、出血、渗出、肺水肿及粘液、炎症细胞的趋化和浸润的情况进行全面病理评分；另外肺组织用eastep super total rnaextraction kit(promega公司生产)提取总rna，随后通过rt-qpcr及elisa检测细胞因子基因。
122.结果如图27至33所示。图27和图28显示，黄金地鼠在感染后1至6天平均体重持续下降，最终下降超过20％，并且7天内全部死亡；而felodipine、imatinib、fasudil和 caspofungin的治疗下体重下降明显减轻，在第7天，平均体重下降分别为5.2％、2.5％、 2.1％和11％，并且4个治疗组的黄金地鼠全部存活。图29显示了第7天各组的肺组织照片，对照组黄金地鼠观察到了严重的肺部病变(包括实变、多灶性和弥漫性充血)，而 felodipine、imatinib、fasudil治疗后，没有观察到严重的肺部病变情况，caspofungin的
治疗也对肺部病变有所改善。相对应地，图30和图31显示了肺组织he染色结果和全面病理评分，也证明felodipine、imatinib、fasudil显著减轻肺部病变，caspofungin效果稍差。图32和图33的rt-qpcr及elisa结果显示，felodipine、imatinib、fasudil和 caspofungin治疗组肺组织中检测的炎症因子基因表达相较于对照组显著下调。
123.本实施例表明felodipine、imatinib、fasudil和caspofungin在体内对sars-cov-2感染具有保护作用及抗炎作用，其中felodipine、imatinib、fasudil的保护作用相对更强。
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以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。