甲醇耐受性蛋白及提高微生物的甲醇耐受性或利用率的方法

本发明属于生物技术及分子生物学领域，具体涉及一种甲醇耐受性蛋白，表达甲醇耐受性蛋白的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体，重组宿主细胞，甲醇耐受性或利用率提高的重组菌株，提高微生物的甲醇耐受性或利用率的方法，以及生产目标化合物的方法。

背景技术：

1、甲醇是煤炭化工、页岩气化工和工农业废弃物气化的初级平台产品，我国甲醇产能已达8000万吨/年，占国际总量50％以上，呈现过剩趋势。由于甲醇的价格低于常用碳源如葡萄糖的价格，利用甲醇生物转化生产大宗化学品即可以降低化学品生产的原料成本，又可解决甲醇过剩而造成的环境污染，是一种极有潜力的工业发酵原料。因此，近年来，越来越多的研究关注于开发能够利用甲醇进行生物转化生产大宗化学品。

2、已发现多条甲醇的生物转化途径，例如核酮糖单磷酸途径(ribulosemonophosphate pathway，r ump)，丝氨酸途径(serine pathway)和木酮糖单磷酸途径(xylulose monophosphate pathway，xump)等。目前，通过改造模式微生物，在模式微生物内构建甲醇代谢途径，实现对甲醇的转化和利用。大多数研究是通过在平台菌株如大肠杆菌(escherichia coli)和谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)中阻断甲醛氧化生成甲酸和二氧化碳的途径，减少碳损失，同时表达甲醇脱氢酶(mdh)、6-磷酸己酮糖合成酶(hps)和6-磷酸己酮糖异构酶(phi)，构建rump途径，赋予菌株生物转化甲醇的能力。但是，目前获得的工程菌株在甲醇作为唯一碳源的无机盐培养基中无法生长，仅可以在甲醇与另一辅助碳源存在的情况下生长[1-3]。

3、由于甲醇是一种有机溶剂，对微生物细胞具有一定的毒性，这是微生物不能利用甲醇作为唯一碳源生长的影响因素之一，因此，如何提高菌株对甲醇的耐受性，以便更高效地转化利用甲醇，是本领域亟需解决的重要问题。

4、引用文献：

5、[1]bennett,r.k.,gonzalez,j.e.,whitaker,w.b.,antoniewicz,m.r.,papoutsakis,e.t.,2018.expression of heterologous non-oxidative pentosephosphate pathway from bacillus methanolicus and phosphoglucose isomerasedeletion improves methanol assimilation and metabolite production by asynthetic escherichia coli methylotroph.metab.eng.45,75-85.

6、[2]witthoff,s.,schmitz,k.,niedenfuhr,s.,noh,k.,noack,s.,bott,m.,marienhagen,j.,2015.metabolic engineering of corynebacterium glutamicum formethanol metabolism.appl.environ.microbiol.81,2215-2225.

7、[3]tuyishime,p.,wang,y.,fan,l.,zhang,q.,li,q.,zheng,p.,sun,j.,ma,y.,2018.engineering corynebacterium glutamicum for methanol-dependent growth andglutamate production.metab.eng.49,220-231.

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、鉴于现有技术中存在的问题，例如，由于甲醇的细胞毒性，导致菌株对甲醇的耐受性低，无法高效转化利用甲醇。为此，本公开提供了一种甲醇耐受性蛋白，为包含如seq idno:2、seq id no:4或seq id no:6所示序列的蛋白的突变体。本公开发现，蛋白突变体能够显著提高菌株的甲醇耐受性，以及菌株对甲醇的转化利用率；使菌株能够高效生物转化甲醇，有利于实现以甲醇为底物原料的大规模发酵生产，具有重要的工业应用价值。

3、用于解决问题的方案

4、本公开提供了如下技术方案。

5、(1)一种甲醇耐受性蛋白，其中，所述甲醇耐受性蛋白包含如下(i)-(iv)中任一项所示的序列：

6、(i)如seq id no:2所示氨基酸序列的突变体序列，所述突变体序列在对应seq idno:2所示序列的第167位突变为非甘氨酸(g)的其它氨基酸；

7、(ii)如seq id no:4所示氨基酸序列的突变体序列，所述突变体序列在对应seqid no:4所示序列的第222位突变为非亮氨酸(l)的其它氨基酸；

8、(iii)如seq id no:6所示氨基酸序列的突变体序列，所述突变体序列在对应seqid no:6所示序列的第6位突变为非苏氨酸(t)的其它氨基酸；

9、(iv)与(i)～(iii)任一项所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，且不包含如seq id no:2、seq id no:4或seq id no:6所示序列的突变体序列；

10、并且，包含如(i)-(iv)任一项所示序列的甲醇耐受性蛋白具有提高微生物的甲醇耐受性的蛋白活性。

11、(2)根据(1)所述的甲醇耐受性蛋白，其中，所述(i)所示的突变体序列对应seq idno:2所示序列，包含如下的突变的氨基酸：第167位的氨基酸由甘氨酸(g)突变为精氨酸(r)；或者

12、所述(ii)所示的突变体序列对应seq id no:4所示序列，包含如下的突变的氨基酸：第222位的氨基酸由亮氨酸(l)突变为苯丙氨酸(f)；或者，

13、所述(iii)所示的突变体序列对应seq id no:6所示序列，包含如下的突变的氨基酸：第6位的氨基酸由苏氨酸(t)突变为异亮氨酸(i)。

14、在一种具体的实施方式中，所述甲醇耐受性蛋白包含如seq id no:7-9任一序列所示的氨基酸序列。

15、(3)一种多核苷酸，其编码如(1)-(2)任一项所述的甲醇耐受性蛋白。

16、(4)一种核酸构建体，其中，所述核酸构建体包含(3)所述的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接；所述调控序列用于指导所述甲醇耐受性蛋白在宿主细胞中的表达。

17、(5)一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含(3)所述的多核苷酸，或(4)所述的核酸构建体。

18、(6)一种重组微生物宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含(1)-(2)任一项所述的甲醇耐受性蛋白，(3)所述的多核苷酸，(4)所述的核酸构建体，或者(5)所述的重组表达载体。

19、(7)根据(6)所述的重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞来源于埃希氏杆菌属(escherichia)、欧文氏菌属(erwinia)、沙雷氏菌属(serratia)、普罗维登斯菌属(providencia)、肠道菌属(enterobacteria)、沙门氏菌属(salmonella)、链霉菌属(streptomyces)、假单胞菌属(pseudomonas)、短杆菌属(brevibacterium)或棒状杆菌属(corynebacterium)的微生物。

20、在一种具体的实施方式中，所述宿主细胞来源于大肠杆菌(escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)或枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)。

21、在一种具体的实施方式中，所述宿主细胞来源于谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)。

22、(8)根据(1)-(2)任一项所述的甲醇耐受性蛋白，根据(3)所述的多核苷酸，根据(4)所述的核酸构建体或根据(5)所述的重组表达载体在如下(a)-(c)至少一项中的用途：

23、(a)提高微生物的甲醇耐受性，或制备用于提高微生物的甲醇耐受性的试剂或试剂盒；

24、(b)提高微生物的甲醇利用率，或制备用于提高微生物的甲醇利用率的试剂或试剂盒；

25、(c)制备生物转化甲醇的微生物，或制备用于制备生物转化甲醇的微生物的试剂或试剂盒。

26、(9)一种甲醇耐受性或利用率提高的重组菌株，其中，所述重组菌株包含(1)-(2)任一项所述的甲醇耐受性蛋白，根据(3)所述的多核苷酸，根据(4)所述的核酸构建体或根据(5)所述的重组表达载体。

27、在一种具体的实施方式中，所述菌株选自大肠杆菌(escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)或枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)。

28、在一种具体的实施方式中，所述菌株为谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)。

29、(10)根据(6)-(7)任一项所述的重组宿主细胞，或根据(9)所述的重组菌株在生物转化甲醇，或生物转化甲醇以生产目标化合物中的用途。

30、(11)一种提高微生物的甲醇耐受性或利用率的方法，其中，所述方法包括向微生物的细胞内引入如(1)-(2)任一项所述的甲醇耐受性蛋白，根据(3)所述的多核苷酸，根据(4)所述的核酸构建体或根据(5)所述的重组表达载体的步骤。

31、在一种具体的实施方式中，所述微生物来源于埃希氏杆菌属(escherichia)、欧文氏菌属(erwinia)、沙雷氏菌属(serratia)、普罗维登斯菌属(providencia)、肠道菌属(enterobacteria)、沙门氏菌属(salmonella)、链霉菌属(streptomyces)、假单胞菌属(pseudomonas)、短杆菌属(brevibacterium)或棒状杆菌属(corynebacterium)。

32、在一种具体的实施方式中，所述微生物为大肠杆菌(escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)或枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)。

33、在一种具体的实施方式中，所述微生物为谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)。

34、(12)一种生产目标化合物的方法，其包括使用根据(6)-(7)任一项所述的重组宿主细胞，或根据(9)所述的重组菌株进行发酵反应，以生产目标化合物的步骤；其中，所述发酵反应的底物包含甲醇。

35、在一种具体的实施方式中，所述目标化合物包括氨基酸、有机酸中的至少一种。

36、在一种具体的实施方式中，所述氨基酸包括如下的一种或两种以上的组合：赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、5-氨基乙酰丙酸或上述任一种的氨基酸的衍生物。

37、在一种具体的实施方式中，所述有机酸包括如下的一种或两种以上的组合：柠檬酸、琥珀酸、乳酸、醋酸、丁酸、棕榈酸、草酸、草酰乙酸、酒石酸、丙酸、己烯酸、癸酸、辛酸、戊酸、苹果酸或上述的任一种的有机酸的衍生物。

38、在一种具体的实施方式中，所述方法还包括分离或纯化所述目标化合物的步骤。

39、发明的效果

40、在一些实施方式中，本公开提供的甲醇耐受性蛋白，为包含seq id no:2所示序列(cgl1823蛋白)、seq id no:4所示序列(cgl1931蛋白)、或seq id no:6所示序列(cgl1931蛋白)的蛋白突变体。本公开发现，蛋白突变体能够显著提高菌株的甲醇耐受性和利用率。以利用cgl1823蛋白突变体构建的工程菌株为例，其可高效率转化利用甲醇，有利于实现以甲醇为底物原料的大规模发酵生产。

41、在一些实施方式中，本公开提供的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体，能够表达甲醇耐受性蛋白，用于构建甲醇耐受性和利用率提高的菌株，实现甲醇的高效转化、利用。

42、在一些实施方式中，本公开提供的重组宿主细胞或重组菌株，具有高的甲醇耐受性和利用率，能够利用包含甲醇的底物进行发酵反应，通过甲醇的高效生物转化，为目标化合物的生产提供碳源及能源。

43、在一些实施方式中，本公开提供的提高微生物的甲醇耐受性或利用率的方法，通过向微生物的细胞内转入本公开中的甲醇耐受性蛋白，多核苷酸、核酸构建体或重组表达载体，使微生物能够耐受高浓度甲醇，并且对甲醇的利用率提高，解决了由于甲醇毒性导致无法高效转化利用甲醇的问题。

44、在一些实施方式中，本公开提供的生产目标化合物的方法，以本公开中的重组菌株或重组宿主细胞进行发酵反应，能够有效提高对底物中甲醇的转化利用率，具有大规模工业化生产的前景。