一种检测单纯疱疹病毒II型的CDA引物组、试剂盒及其应用

本发明属于生物检测，具体涉及一种检测单纯疱疹病毒ii型的cda引物组、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、单纯疱疹病毒ii型(herpes simplex virus ii，hsv2)是一种双链dna病毒，属于人疱疹病毒α亚科，单纯疱疹病毒属，根据抗原性的不同，分为2个亚型，即hsv1和hsv2型。其中，单纯疱疹病毒二型(hsv2)，主要引起生殖器部位皮肤黏膜及新生儿的感染，主要通过性接触和母婴垂直传播。单纯疱疹病毒具有嗜感觉神经节而形成潜伏感染状态的特性。本病多呈散发或原有潜伏病毒感染的反复发作。单纯疱疹病毒ii型的经典检测方法为分离培养，经过2～3天培养后，观察细胞病变。而基于原位核酸杂交或pcr法检测标本中的hsvdna，敏感性和特异性均高。但rt-pcr方法需要在标准生化分析实验室，使用精密的实时荧光pcr仪，并需要试剂准备、标本制备和pcr扩增检测三个独立的试验区，并不适用于现场快速筛查。此外，免疫检测技术所制成的试纸条具有简便快捷的优势，但该方法误检率高、灵敏度低，难于检测处于潜伏期的hsv2携带者，可能造成疫情的扩散。因此，快速、灵敏、高特异性核酸标志物现场检测技术的研发，将对由单纯疱疹病毒ii型感染所导致的疾病提供快速有力的治疗手段。

2、基于闭合颈环介导的核酸恒温扩增技术(closed dumbbell mediatedisothermal amplification of nucleic acids，cda)是由中国科学院大学宁波生命与健康产业研究院开发的新方法(中国专利号：zl202110473121.8)，可替代日本lamp核酸扩增方法。该方法主要利用2种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如pcr等)相比，cda反应在恒温水浴箱内便可完成，对仪器设备的要求较低，且操作简单，非专业人士也可准确地完成，适合于基层医疗机构及地方检验检疫部门。并且，cda还可以缩短操作时间，提高检测效率，降低样品污染的机率，适用于单纯疱疹病毒ii型的快速诊断。此外，cda所用关键成环引物约为30bp，较lamp(40bp)短，这将节省检测成本。

技术实现思路

1、本发明的目的是，提供一种检测单纯疱疹病毒ii型的cda引物组、试剂盒及其应用。

2、本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

3、本发明通过对表1所述的4对引物组进行筛选，获得对单纯疱疹病毒ii型检测效果最优的引物组为hsv2-mf-2/hsv2-mr-2。

4、表1

5、 序列号 引物名称 核苷酸序列(5’-3’) seq id no.1 hsv2-mf-1 atcggccatcgccaaatacgccttagcagacc seq id no.2 hsv2-mr-1 cccaatcgatggctcggctgaatgtggta seq id no.3 hsv2-mf-2 cccgcgaaatatacgccttagcagacc seq id no.4 hsv2-mr-2 aagaaccttctggtaaacacgcttcac seq id no.5 hsv2-mf-3 ggccatcttaaaatacgccttagcaga seq id no.6 hsv2-mr-3 gatcccaatcatgtggtaaacacgctt seq id no.7 hsv2-mf-4 ctggtccaaaccaaatacgccttagca seq id no.8 hsv2-mr-4 ctgaccgaccctcggctgaatgtggta

6、本发明还提供一种检测单纯疱疹病毒ii型的试剂盒，所述试剂盒包括cda引物组hsv2-mf-2和hsv2-mr-2。

7、作为优选实施方案，所述cda引物组中的引物hsv2-mf和hsv2-mr在反应体系中的浓度均为1～2μm。

8、作为优选实施方案，所述试剂盒还包括bst聚合酶、cda反应缓冲液、超纯水、以及显色剂。

9、作为优选实施方案，所述显色剂选自sybr green i、eva green、羟基萘酚蓝或铬黑t。

10、作为优选实施方案，所述cda反应缓冲液包括tris-hcl、kcl、(nh4)2so4、mgso4和triton x-100。

11、作为优选实施方案，所述试剂盒反应体系的组成为：

12、2～50mm tris-hclph8.8

13、2～20mm kcl

14、2～20mm(nh4)2so4

15、2～20mm mgso4

16、0.1～0.5％tritonx-100

17、0.2～1m甜菜碱

18、1～1.6mm dntp

19、5～10u bst dna聚合酶

20、100～150μmol/l显色剂

21、1～2μm引物hsv2-mf-2

22、1～2μm引物hsv2-mr-2

23、反应溶剂为超纯水。

24、本发明还提供该试剂盒用于非疾病诊断目的的检测单纯疱疹病毒ii型的方法，包括以下步骤：

25、步骤1，将待检测核酸样本和试剂盒的反应体系混合，制得扩增反应液；

26、步骤2，将步骤1所得扩增反应液，于60～65℃反应20～80min，根据显色结果判断样品是否含有单纯疱疹病毒ii型。

27、本发明还提供所述的cda引物组在以非疾病诊断为目的的单纯疱疹病毒ii型检测中的应用。

28、本发明还提供上述试剂盒在以非疾病诊断为目的的单纯疱疹病毒ii型检测中的应用。

29、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

30、1，本发明提供的cda引物组针对单纯疱疹病毒ii型的特异保守区域human alphaherpesvirus 2 strain ms,complete genome(genbank:mk855052.1)，由2条引物组成，为序列内引物对(hsv2-mf-2/hsv2-mr-2)。本发明提供的引物组敏感性高、特异性强，由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中是否含有单纯疱疹病毒ii型。

31、2，由于本发明提供的引物组具有极高的特异性，cda扩增所需时间短，进一步缩短了检测时间，且操作简易。

32、3，本发明提供的方法或试剂盒无需昂贵的仪器、也无需复杂的操作就可完成相关检测，因此，本发明所提供的可视化试剂盒将为专业性不高的机场、海关、社区等地的现场检测提供极大便利，可实现对单纯疱疹病毒ii型快速准确的检测。