一种重组单纯疱疹病毒及其用途的制作方法

一种重组单纯疱疹病毒及其用途
1.本分案申请是基于申请号为cn201810165563.4，申请日为2018年02月28日，发明名称为“一种重组单纯疱疹病毒及其用途”的原始中国专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及病毒学和肿瘤治疗领域。特别地，本发明提供了一种重组单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，hsv)，其能够特异性地在肿瘤细胞中以高水平复制并有效杀伤肿瘤细胞，但是在正常细胞中以低水平复制，从而本发明的重组单纯疱疹病毒不仅对肿瘤细胞具有高杀伤力，而且具有显著降低的副作用(特别是神经毒性)。进一步，本发明涉及了基于所述重组单纯疱疹病毒构建的病毒载体，包含所述重组单纯疱疹病毒或所述病毒载体的药物组合物，以及所述重组单纯疱疹病毒或所述病毒载体的用途。本发明的重组单纯疱疹病毒可以用于感染并杀伤肿瘤细胞，并且可以用于将基因药物递送至肿瘤细胞内，进行基因治疗。


背景技术：

3.放疗、化疗和靶向药物是目前广泛采用的肿瘤治疗方案，但是它们都存在着治疗不彻底、毒副作用大、容易产生抗药性、无法控制肿瘤复发和转移等诸多问题，肿瘤治疗效果不理想。因此，急需开发新型高效的肿瘤治疗方法。近年来，人们对肿瘤与免疫关系的认识大幅提高，肿瘤免疫治疗发展迅速，其中，使用溶瘤病毒(oncolytic virus，ov)的疗法作为一种新型的肿瘤免疫治疗方法备受瞩目(lichty b d,breitbach c j,stojdl d f,et al.going viral with cancer immunotherapy[j].nat rev cancer,2014,14(8):559-567)。溶瘤病毒是一类具有嗜肿瘤特性的病毒，其能够选择性地在肿瘤细胞中复制，而在正常细胞内的增殖则受到限制。溶瘤病毒能在肿瘤细胞中复制从而导致肿瘤细胞溶解和死亡，并且扩增的病毒能继续感染周围的肿瘤细胞，产生一种级联效应。此外，溶瘤病毒在裂解肿瘤细胞的过程中，还能够释放肿瘤抗原，刺激机体产生针对肿瘤抗体的特异性抗肿瘤免疫，进一步扩大溶瘤病毒的溶瘤效果。溶瘤病毒是目前恶性肿瘤治疗领域中最为热门的新型基因治疗药物。特别是在实体瘤的局部控制治疗上，溶瘤病毒的感染和增殖不仅会导致注射部位的肿瘤消融，而且肿瘤细胞的裂解会导致肿瘤抗原从肿瘤细胞中释放，从而诱导机体产生系统性的抗肿瘤免疫应答来对抗其它部位的肿瘤，这可能是机体系统性控制肿瘤扩散和转移的关键免疫应答(russell s j,peng k w,bell j c.oncolytic virotherapy[j].nat biotechnol,2012,30(7):658-670)。
[0004]
目前的溶瘤病毒按病毒种类划分可分为十余种，其中，溶瘤型i型单纯疱疹病毒(hsv-1)因所使用的病毒载体具有基因容量大、复制周期短、感染效率高、可插入多个治疗基因等优势，成为国内外基因工程肿瘤治疗药物的首选。
[0005]
hsv-1病毒属于疱疹病毒科，是一类有包膜的dna病毒，能引起人口唇、眼睛和面部皮肤的疱疹。据流行性研究统计，60％以上人群都感染过hsv-1病毒。hsv-1病毒的基因组由152kb的双股线性dna组成，包含相互连接的两个片段：长片段和短片段(macdonald s j,
malignant glioma:a proof of principle study[j].gene ther,2002,9(6):398-406)；g207，其是通过在r3616突变株中双敲除icp34.5/icp6基因获得的(markert j m,medlock m d,rabkin s d,et al.conditionally replicating herpes simplex virus mutant,g207 for the treatment of malignant glioma:results of a phase i trial[j].gene ther,2000,7(10):867-874；和markert j m,razdan s n,kuo h c,et al.a phase 1 trial of oncolytic hsv-1,g207,given in combination with radiation for recurrent gbm demonstrates safety and radiographic responses[j].mol ther,2014,22(5):1048-1055)；nv1020，其是通过在r7020突变株(来源于hsv-1f株)中删除单拷贝的icp34.5/icp0/icp4/ul56基因获得的(gutermann a,mayer e,von dehn-rothfelser k,et al.efficacy of oncolytic herpesvirus nv1020can be enhanced by combination with chemotherapeutics in colon carcinoma cells[j].hum gene ther,2006,17(12):1241-1253；和geevarghese s k,geller d a,de haan h a,et al.phase i/ii study of oncolytic herpes simplex virus nv1020 in patients with extensively pretreated refractory colorectal cancer metastatic to the liver[j].hum gene ther,2010,21(9):1119-1128)；以及t-vec，其是通过在临床hsv-1分离株js1中双敲除icp34.5/icp47基因获得的(liu b l,robinson m,han z q,et al.icp34.5 deleted herpes simplex virus with enhanced oncolytic,immune stimulating,and anti-tumour properties[j].gene ther,2003,10(4):292-303)。美国amgen公司的重组hsv-1病毒t-vec在治疗晚期黑色素瘤患者的ⅲ期临床试验中取得了突破，成为首个获得fda批准的溶瘤病毒类治疗药物。然而，数据表明，该项临床研究仅达到了持久反应率(drr)的主要终点，但未达到改善总生存期(os)的次要终点，尽管t-vec治疗组表现出强烈的有利趋势(andtbacka r h,kaufman h l,collichio f,et al.talimogene laherparepvec improves durable response rate in patients with advanced melanoma[j].j clin oncol,2015,33(25):2780-2788)。这主要是因为t-vec具有较强的毒副作用，其首次瘤内治疗剂量仅为106pfu病毒，这大大降低了肿瘤治疗的效果，并且导致患者错过了溶瘤治疗的最佳时机。
[0008]
尽管i型单纯疱疹病毒溶瘤疗法在近些年取得一定的成绩，但是对已进入肿瘤治疗临床研究的重组hsv-1病毒进行分析后发现，由于不同的溶瘤病毒具有不同的遗传学修饰、不同的溶瘤效果及安全性，因而它们所适用的肿瘤适应症及治疗肿瘤的效果也不尽相同(eager r m,nemunaitis j.clinical development directions in oncolytic viral therapy[j].cancer gene ther,2011,18(5):305-317)。总的来说，现有的溶瘤病毒均存在毒副作用大、安全性差及溶瘤病毒的治疗剂量明显受限等缺陷，这给肿瘤治疗研究带来严峻的挑战(liu t c,galanis e,kirn d.clinical trial results with oncolytic virotherapy:a century of promise,a decade of progress[j].nat clin pract oncol,2007,4(2):101-117)。溶瘤病毒的治疗效果与病毒给药剂量呈正相关。如果溶瘤病毒的特异性和安全性不高，那么溶瘤病毒的使用剂量必然需要降低，以避免给机体带来严重的副反应。这严重影响了溶瘤病毒的临床治疗效果，并且导致了一定的安全性隐患。以美国amgen公司的t-vec为例，药物毒性/副作用是限制t-vec临床效果的重要因素。尽管科学家们一直在进行各种尝试，但迄今为止，尚未发现既能够在肿瘤细胞中以高水平复制并杀
伤肿瘤细胞，又不会对正常细胞造成严重副作用的溶瘤病毒。因此，仍然需要开发新的溶瘤病毒，以实现溶瘤病毒疗法的低毒性和高有效性。
[0009]
为了克服现有技术中的重组单纯疱疹病毒在肿瘤基因治疗中的上述缺陷，本技术的发明人构建了一种全新的重组单纯疱疹病毒，其不仅能够在肿瘤细胞中以高水平复制，对肿瘤细胞具有高杀伤力，而且具有显著降低的副作用(特别是神经毒性)，因此，本发明的重组单纯疱疹病毒不仅维持了溶瘤病毒的高疗效，而且大大提高了溶瘤病毒的安全性。


技术实现要素：

[0010]
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
[0011]
如本文中所使用的，术语“重组hsv病毒”是指经改造的hsv病毒，其与野生型hsv病毒相比，包含人工引入的突变。应当理解的是，本发明的重组hsv病毒不受限于其生产方式。例如，本发明的重组hsv病毒可通过同源重组产生，也可通过培养感染了所述重组hsv病毒的宿主细胞而制备。
[0012]
如本文中所使用的，术语“病毒载体(viral vector)”是指，基于病毒基因组而构建获得的、能够携带外源核苷酸序列的一种核酸运载工具。通常而言，病毒载体能够在合适的宿主细胞中自我复制和/或表达其所包含的基因(内源的和外源的)。病毒载体可包含完整的野生型病毒的基因组，或者经突变或修饰的病毒基因组。然而，出于安全性的考虑，病毒载体一般优选包含经突变或修饰的病毒基因组。由于本发明的病毒载体衍生自hsv的病毒基因组，因此，本发明的病毒载体也可被称为hsv病毒载体。
[0013]
如本文中所使用的，表述“不表达功能性目的蛋白”是指，当病毒或病毒载体或病毒基因组感染细胞后，所述病毒或病毒载体或病毒基因组不能产生或表达具有生物学功能活性的目的蛋白。例如，所述病毒或病毒载体或病毒基因组可以因基因缺失而完全不产生或表达所述目的蛋白，或者因功能丧失性突变而产生或表达不具有生物学功能活性的目的蛋白。
[0014]
如本文中所使用的，术语“功能丧失性突变”是指这样的突变，其导致突变基因所编码和表达的蛋白丧失了其生物学功能活性。功能丧失性突变包括但不限于，错义突变，无义突变，移码突变，碱基缺失，碱基置换，碱基添加，以及其任何组合(例如，基因片段的缺失或置换或添加)，只要包含该功能丧失性突变的基因不能产生或表达具有生物学功能活性的蛋白即可。
[0015]
如本文中所使用的，术语“必需基因”是指维持hsv病毒生存和复制所不可或缺的基因。此类必需基因的具体实例包括但不限于，icp27基因(参见例如genbank no.afe62883.1)，icp4基因(参见例如genbank no.afe62888.1)，vp5基因(参见例如genbank no.afe62846.1)，gl基因(参见例如genbank no.afe62828.1)，gh基因(参见例如genbank no.afe62849.1)，gd基因(参见例如genbank no.afe62894.1)，gk基因(参见例如genbank no.afe62882.1)，gb基因(参见例如genbank no.afe62855.1)，gn基因(参见例如genbank no.afe62878.1)，ul5基因(参见例如genbank no.afe62832.1)，ul6基因(参见例
如genbank no.afe62833.1)，ul8基因(参见例如genbank no.afe62835.1)，ul9基因(参见例如genbank no.afe62836.1)，ul12基因(参见例如genbank no.afe62839.1)，ul25基因(参见例如genbank no.afe62852.1)，ul26基因(参见例如genbank no.afe62853.1)，ul28基因(参见例如genbank no.afe62856.1)，ul29基因(参见例如genbank no.afe62857.1)，ul30基因(参见例如genbank no.afe62858.1)，ul33基因(参见例如genbank no.afe62861.1)，ul36基因(参见例如genbank no.afe62864.1)，ul38基因(参见例如genbank no.afe62866.1)，ul42基因(参见例如genbank no.afe62870.1)，ul48基因(参见例如genbank no.afe62876.1)，ul52基因(参见例如genbank no.afe62881.1)。有关hsv病毒的必需基因的详细描述，还可参见例如，roizman b,knipe dm.herpes simplex viruses and their replication.in:knipe d m,howley p m,editors.fields virology.2
nd ed.vol 2.philadelphia,pa:lippincot,williams and wilkins,2001:2399-2460；subak-sharpe j h,dargan d j.hsv molecular biology:general aspects of herpes simplex virus molecular biology.virus genes,1998,16(3):239-251。
[0016]
如本文中所使用的，术语“非必需基因”是指这样的基因，其不是维持hsv病毒生存和复制所必需的。一般情况下，可对hsv病毒基因组中的此类基因进行敲除(缺失)或突变，而不影响hsv病毒的生存和复制能力。此类必需基因的具体实例包括但不限于，ul3基因(参见例如genbank no.afe62830.1)，ul4基因(参见例如genbank no.afe62831.1)，ul14基因(参见例如genbank no.afe62841.1)，ul16基因(参见例如genbank no.afe62843.1)，ul21基因(参见例如genbank no.afe62848.1)，ul24基因(参见例如genbank no.afe62851.1)，ul31基因(参见例如genbank no.afe62859.1)，ul32基因(参见例如genbank no.afe62860.1)，us3基因(参见例如genbank no.afe62891.1)，ul51基因(参见例如genbank no.afe62880.1)，ul55基因(参见例如genbank no.afe62884.1)，ul56基因(参见例如genbank no.afe62885.1)，us2基因(参见例如genbank no.afe62890.1)，us12基因(参见例如genbank no.afe62901.1；即，icp47基因)，和lat基因(参见例如genbank no.jq673480.1)。有关hsv病毒的非必需基因的详细描述，还可参见例如，roizman b,knipe dm.herpes simplex viruses and their replication.in:knipe d m,howley p m,editors.fields virology.2
nd ed.vol 2.philadelphia,pa:lippincot,williams and wilkins,2001:2399-2460；subak-sharpe j h,dargan d j.hsv molecular biology:general aspects of herpes simplex virus molecular biology.virus genes,1998,16(3):239-251。
[0017]
如本文中所使用的，术语“icp0蛋白”是指hsv病毒的infected cell protein0，其由rl2基因编码，并且为hsv病毒的立即早期基因产物之一。icp0蛋白的氨基酸序列是已知的，并可参见例如公共数据库ncbi(afe62827.1)。
[0018]
如本文中所使用的，术语“icp34.5蛋白”是指hsv病毒的infected cell protein34.5，其由rl1基因编码，并且为hsv病毒的立即早期基因产物之一。icp34.5蛋白的氨基酸序列是已知的，并可参见例如公共数据库ncbi(afe62826.1)。
[0019]
如本文中所使用的，术语“icp27蛋白”是指hsv病毒的infected cell protein27，其由ul54基因编码。icp27蛋白的氨基酸序列是已知的，并可参见例如公共数据库ncbi(afe62883.1)。
[0020]
如本文中所使用的，术语“icp4蛋白”是指hsv病毒的infected cell protein4，其由rs1基因编码。icp4蛋白的氨基酸序列是已知的，并可参见例如公共数据库ncbi(afe62888.1)。
[0021]
如本文中所使用的，术语“vp5蛋白”是指hsv病毒的主要衣壳蛋白，其由ul19基因编码。vp5蛋白的氨基酸序列是已知的，并可参见例如公共数据库ncbi(afe62846.1)。
[0022]
如本文中所使用的，术语“icp0基因”是指hsv病毒基因组中编码icp0蛋白的核苷酸序列。如本文中所使用的，术语“icp34.5基因”是指hsv病毒基因组中编码icp34.5蛋白的核苷酸序列。如本文中所使用的，术语“icp27基因”是指hsv病毒基因组中编码icp27蛋白的核苷酸序列。如本文中所使用的，术语“icp4基因”是指hsv病毒基因组中编码icp4蛋白的核苷酸序列。如本文中所使用的，术语“vp5基因”是指hsv病毒基因组中编码vp5蛋白的核苷酸序列。
[0023]
如本文中所使用的，术语“外源核苷酸序列”是指，人工引入的核苷酸序列，其相对于原始序列而言是外来的。外源核苷酸序列包括但不限于，未在所述病毒基因组中发现的任何基因。然而，在某些情况下，优选地，外源核苷酸序列编码具有治疗用途的多肽，例如免疫调节多肽、细胞因子、趋化因子、抗体和细胞毒性肽。
[0024]
如本文中所使用的，术语“免疫调节多肽”是指，能调节免疫细胞功能的多肽，其实例包括但不限于，cd40l、ox40l、可诱导共刺激分子(icos)、ftl3l、light、cd137l、cd70、4-1bb、gitr、和cd28(参见例如，khalil d n,smith e l,brentjens r j,et al.the future of cancer treatment:immunomodulation,cars and combination immunotherapy[j].nat rev clin oncol,2016,13(5):273-290)。
[0025]
如本文中所使用的，术语“细胞因子”具有本领域技术人员公知的含义。然而，在本发明的方法中，当使用本发明的重组病毒来治疗肿瘤时，特别优选地，所述细胞因子为能够用于肿瘤治疗的细胞因子。“细胞因子”的实例包括但不限于，白介素(例如il-2、il-12和il-15)、干扰素(例如ifnα、ifnβ、ifnγ)、肿瘤坏死因子(例如tnfα)、集落刺激因子(例如gm-csf)，及其任何组合(参见例如，ardolino m,hsu j,raulet d h.cytokine treatment in cancer immunotherapy[j].oncotarget,2015,6(23):19346-19347)。
[0026]
如本文中所使用的，术语“趋化因子”具有本领域技术人员公知的含义。然而，在本发明的方法中，当使用本发明的重组病毒来治疗肿瘤时，特别优选地，所述细胞因子为能够用于肿瘤治疗的趋化因子。“趋化因子”的实例包括但不限于，ccl2、rantes、ccl7、ccl9、ccl10、ccl12、ccl15、ccl19、ccl21、ccl20、xcl-1，及其任何组合(homey b,muller a,zlotnik a.chemokines:agents for the immunotherapy of cancer？[j].nat rev immunol,2002,2:175-184)。
[0027]
如本文中所使用的，术语“细胞毒性肽”是指，对细胞具有毒性或可诱导细胞凋亡的多肽，其实例但不限于胸苷激酶tk(tk/gcv)、trail和fasl(参见例如，candolfi m,king g d,muhammad a g,et al.evaluation of proapototic transgenes to use in combination with flt3l in an immune-stimulatory gene therapy approach for glioblastoma multiforme(gbm)[j].faseb j,2008,22:1077.13)。
[0028]
如本文中所使用的，术语“抗体”具有本领域技术人员公知的含义。然而，在本发明的方法中，当使用本发明的重组病毒来治疗肿瘤时，特别优选地，所述抗体为能够用于肿瘤
治疗的抗体。“抗体”的实例包括但不限于抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗tigit抗体、抗btla抗体、抗ctla-4抗体、抗tim-3抗体、抗lag-3抗体、抗cd137抗体、抗ox40抗体、抗gitr抗体、抗cd73抗体、抗kir抗体、抗icos抗体、抗csf1r抗体、抗egfr抗体、抗vegfr抗体、抗her2抗体和抗pdgfr抗体(参见例如，khalil d n,smith e l,brentjens r j,et al.the future of cancer treatment:immunomodulation,cars and combination immunotherapy[j].nat rev clin oncol,2016,13(5):273-290；和hughes p e,caenepeel s,wu l c.targeted therapy and checkpoint immunotherapy combinations for the treatment of cancer[j].trends immunol,2016,37(7):462-476)。
[0029]
如本文中所使用的，术语“药学可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如remington's pharmaceutical sciences.edited by gennaro ar,19th ed.pennsylvania:mack publishing company,1995)，并且包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，ph调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如tween-80；佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂)；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
[0030]
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
[0031]
为了克服现有用于肿瘤治疗的重组hsv病毒的安全性及毒副反应问题，本技术的发明人构建了一种新的重组hsv病毒，其不表达功能性icp0和icp34.5蛋白(例如缺失了双拷贝icp0和icp34.5基因)。本发明的重组hsv病毒在肿瘤细胞中具有高水平的复制能力，并且能够有效杀伤多种肿瘤细胞，但是在正常细胞中却具有显著降低的复制能力和杀伤能力。此外，还已发现，本发明的重组hsv病毒在动物体内具有显著降低的神经毒性，可以以显著提高的剂量施用给动物。因此，与现有的重组hsv病毒相比，本发明的重组hsv病毒不仅维持了高溶瘤能力，而且具有显著提高的安全性，能够以更高的剂量施用，具有广阔的应用前景。
[0032]
重组hsv病毒
[0033]
因此，在一个方面，本发明提供了一种重组hsv病毒，其不表达功能性icp0蛋白和icp34.5蛋白。
[0034]
如本领域技术人员所熟知的，可通过对编码目的蛋白(例如icp0蛋白和/或icp34.5蛋白)的基因进行改造来阻止所述目的蛋白的功能性表达。例如，可在编码目的蛋白(例如icp0蛋白和/或icp34.5蛋白)的基因中引入功能丧失性突变，或者将编码目的蛋白(例如icp0蛋白和/或icp34.5蛋白)的基因缺失或置换成外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)，从而阻止所述目的蛋白的功能性表达。
[0035]
本领域技术人员已经知晓，hsv病毒的基因组中包含2个拷贝的icp0基因和2个拷
贝的icp34.5基因。因此，为了阻止icp0蛋白和icp34.5蛋白在重组hsv病毒中的功能性表达，需要对2个拷贝的icp0基因和2个拷贝的icp34.5基因同时进行改造。然而，易于理解的是，对所述2个拷贝的icp0基因和2个拷贝的icp34.5基因(4个核苷酸区段)的改造是彼此独立的，并且可以是相同的或不同的。
[0036]
因此，在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒具有这样的基因组，其中，
[0037]
2个拷贝的icp0基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)；并且，
[0038]
2个拷贝的icp34.5基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。
[0039]
在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组包含下述修饰：
[0040]
2个拷贝的icp0基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)；并且，
[0041]
2个拷贝的icp34.5基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。
[0042]
在某些优选的实施方案中，一个拷贝的icp0基因包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)，并且另一个拷贝的icp0基因包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，一个拷贝的icp0基因被缺失，并且另一个拷贝的icp0基因包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，一个拷贝的icp0基因被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)，并且另一个拷贝的icp0基因包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。
[0043]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)。在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因包含相同的功能丧失性突变。在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因包含不同的功能丧失性突变。例如，在某些优选的实施方案中，第一拷贝的icp0基因包含第一功能丧失性突变，而第二拷贝的icp0基因包含第二功能丧失性突变。所述第一功能丧失性突变与第二功能丧失性突变可以相同或者不同。
[0044]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因被缺失。
[0045]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因被置换为相同的外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因被置换为不同的外源核苷酸序列(例如，编码外
源蛋白的核苷酸序列)。例如，在某些优选的实施方案中，第一拷贝的icp0基因被置换为第一外源核苷酸序列，而第二拷贝的icp0基因被置换为第二外源核苷酸序列。所述第一外源核苷酸序列与第二外源核苷酸序列可以相同或者不同。
[0046]
在某些优选的实施方案中，一个拷贝的icp34.5基因包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)，并且另一个拷贝的icp34.5基因包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，一个拷贝的icp34.5基因被缺失，并且另一个拷贝的icp34.5基因包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，一个拷贝的icp34.5基因被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)，并且另一个拷贝的icp34.5基因包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。
[0047]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp34.5基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)。在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp34.5基因包含相同的功能丧失性突变。在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp34.5基因包含不同的功能丧失性突变。例如，在某些优选的实施方案中，第一拷贝的icp34.5基因包含第三功能丧失性突变，而第二拷贝的icp34.5基因包含第四功能丧失性突变。所述第三功能丧失性突变与第四功能丧失性突变可以相同或者不同。
[0048]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp34.5基因被缺失。
[0049]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp34.5基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp34.5基因被置换为相同的外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp34.5基因被置换为不同的外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。例如，在某些优选的实施方案中，第一拷贝的icp34.5基因被置换为第三外源核苷酸序列，而第二拷贝的icp34.5基因被置换为第四外源核苷酸序列。所述第三外源核苷酸序列与第四外源核苷酸序列可以相同或者不同。
[0050]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)，并且，所述2个拷贝的icp34.5基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)。例如，在某些优选的实施方案中，第一拷贝的icp0基因包含第一功能丧失性突变，第二拷贝的icp0基因包含第二功能丧失性突变；并且，第一拷贝的icp34.5基因包含第三功能丧失性突变，第二拷贝的icp34.5基因包含第四功能丧失性突变。所述第一功能丧失性突变、第二功能丧失性突变、第三功能丧失性突变和第四功能丧失性突变可以相同或者不同。
[0051]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)，并且，所述2个拷贝的icp34.5基因被缺失。例如，在某些优选的实施方案中，第一拷贝的icp0基因包含第一功能丧失性突变，第二拷贝的icp0基因包含第二功能丧失性突变；并且，所述2个拷贝的icp34.5基因被缺失。所述第一功能丧失性突变和第二功能丧失性突变可以相同或者不同。
[0052]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)，并且，所述2个拷贝的icp34.5基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。例如，在某些优选的实施方案中，第一拷贝的icp0基因包含第一功能丧失性突变，第二拷贝的icp0基因包含第二功能丧失性突变；并且，第一拷贝的icp34.5基因被置换为第三外源核苷酸序列，第二拷贝的icp34.5基因被置换为第四外源核苷酸序列。所述第一功能丧失性突变和第二功能丧失性突变可以相同或者不同。所述第三外源核苷酸序列与第四外源核苷酸序列可以相同或者不同。
[0053]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因被缺失；并且，所述2个拷贝的icp34.5基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)。例如，在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因被缺失；并且，第一拷贝的icp34.5基因包含第三功能丧失性突变，第二拷贝的icp34.5基因包含第四功能丧失性突变。所述第三功能丧失性突变和第四功能丧失性突变可以相同或者不同。
[0054]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因被缺失；并且，所述2个拷贝的icp34.5基因被缺失。在此类实施方案中，所述重组hsv病毒不表达icp0蛋白和icp34.5蛋白。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组缺失了野生型hsv-1病毒基因组的nt510至nt5439之间的碱基序列以及nt120802至nt125731之间的碱基序列。
[0055]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因被缺失；并且，所述2个拷贝的icp34.5基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。例如，在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因被缺失；并且，第一拷贝的icp34.5基因被置换为第三外源核苷酸序列，第二拷贝的icp34.5基因被置换为第四外源核苷酸序列。所述第三外源核苷酸序列与第四外源核苷酸序列可以相同或者不同。
[0056]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)，并且，所述2个拷贝的icp34.5基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)。例如，在某些优选的实施方案中，第一拷贝的icp0基因被置换为第一外源核苷酸序列，第二拷贝的icp0基因被置换为第二外源核苷酸序列；并且，第一拷贝的icp34.5基因包含第三功能丧失性突变，第二拷贝的icp34.5基因包含第四功能丧失性突变。所述第一外源核苷酸序列与第二外源核苷酸序列可以相同或者不同。所述第三功能丧失性突变和第四功能丧失性突变可以相同或者不同。
[0057]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)，并且，所述2个拷贝的icp34.5基因被缺失。例如，在某些优选的实施方案中，第一拷贝的icp0基因被置换为第一外源核苷酸序列，而第二拷贝的icp0基因被置换为第二外源核苷酸序列；并且，所述2个拷贝的icp34.5基因被缺失。所述第一外源核苷酸序列与第二外源核苷酸序列可以相同或者不同。
[0058]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)，并且，所述2个拷贝的icp34.5基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。例如，在某些优选的实施方案中，第一拷贝的icp0基因被置换为第一外源核苷酸序列，第二拷贝的icp0基因被置换
为第二外源核苷酸序列；并且，第一拷贝的icp34.5基因被置换为第三外源核苷酸序列，第二拷贝的icp34.5基因被置换为第四外源核苷酸序列。所述第一外源核苷酸序列、第二外源核苷酸序列、第三外源核苷酸序列和第四外源核苷酸序列可以相同或者不同。
[0059]
在某些优选的实施方案中，所述第一功能丧失性突变、第二功能丧失性突变、第三功能丧失性突变和第四功能丧失性突变各自独立地选自错义突变、无义突变、移码突变、碱基缺失、碱基置换、碱基添加、以及其任何组合(例如，基因片段的缺失或置换或添加)。
[0060]
在某些优选的实施方案中，所述第一外源核苷酸序列、第二外源核苷酸序列、第三外源核苷酸序列和第四外源核苷酸序列各自独立地编码选自下列的外源蛋白：荧光蛋白、免疫调节多肽、细胞因子、趋化因子、抗体和细胞毒性肽。
[0061]
在某些优选的实施方案中，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白(例如，具有如seq id no:7所示氨基酸序列的绿色荧光蛋白)，红色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，及其任何组合。
[0062]
在某些优选的实施方案中，所述免疫调节多肽选自cd40l、ox40l、可诱导共刺激分子(icos)、ftl3l、light、cd137l、cd70、4-1bb、gitr、cd28，及其任何组合。
[0063]
在某些优选的实施方案中，所述细胞因子选自白介素(例如il-2、il-12和il-15)、干扰素(例如ifnα、ifnβ、ifnγ)、肿瘤坏死因子(例如tnfα)、集落刺激因子(例如gm-csf)，及其任何组合。
[0064]
在某些优选的实施方案中，所述趋化因子选自ccl2、rantes、ccl7、ccl9、ccl10、ccl12、ccl15、ccl19、ccl21、ccl20、xcl-1，及其任何组合。
[0065]
在某些优选的实施方案中，所述细胞毒性肽选自胸苷激酶tk(tk/gcv)、trail、fasl，及其任何组合。
[0066]
在某些优选的实施方案中，所述抗体选自抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗tigit抗体、抗btla抗体、抗ctla-4抗体、抗tim-3抗体、抗lag-3抗体、抗cd137抗体、抗ox40抗体、抗gitr抗体、抗cd73抗体、抗kir抗体、抗icos抗体、抗csf1r抗体、抗egfr抗体、抗vegfr抗体、抗her2抗体、抗pdgfr抗体，及其任何组合。
[0067]
近五年来，针对pd-1的抗体药物已经在临床上取得巨大成功，相继被fda批准用于治疗黑色素瘤、肺癌等实体瘤病人。然而临床研究表明，抗pd-1抗体仅对30％左右的实体瘤病人有效。这可能是因为t细胞难以渗透至实体肿瘤内部，不能与抗pd-1抗体一起作用于实体肿瘤内部的肿瘤细胞。不拘于理论限制，溶瘤型hsv病毒不仅能够直接靶向并杀死肿瘤细胞，而且还能够诱导免疫细胞(例如t细胞)浸润肿瘤。因此，本发明的重组hsv病毒与抗pd-1抗体的组合使用对于提高肿瘤治疗的效果可能是特别有利的，在肿瘤免疫治疗中有着巨大的应用前景。因此，在某些优选的实施方案中，所述外源蛋白为抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体或其任何组合。例如，所述外源蛋白为抗pd-1单链抗体。
[0068]
在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒为重组hsv-1病毒，重组hsv-2病毒，或hsv-1/hsv-2嵌合病毒(即，其基因组既含有来源于hsv-1的dna，又含有来源于hsv-2的dna的重组hsv病毒)。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒衍生自hsv-1病毒株kos。
[0069]
在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒能够表达功能性ul43蛋白，功能性ul41蛋白(即，vhs蛋白)，功能性ul48蛋白(即，vmw65蛋白)，或其任何组合。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒能够表达功能性ul43蛋白。在某些优选的实施方案中，所述重
组hsv病毒能够表达功能性ul41蛋白。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒能够表达功能性ul48蛋白。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒能够表达功能性ul43蛋白和功能性ul41蛋白。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒能够表达功能性ul43蛋白和功能性ul48蛋白。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒能够表达功能性ul41蛋白和功能性ul48蛋白。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒能够表达功能性ul43蛋白，功能性ul41蛋白和功能性ul48蛋白。
[0070]
在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组包含能够表达功能性ul43蛋白的ul43基因，能够表达功能性ul41蛋白的ul41基因(即，vhs基因)，和/或，能够表达功能性ul48蛋白的ul48基因(即，vmw65基因)。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组包含能够表达功能性ul43蛋白的ul43基因。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组包含能够表达功能性ul41蛋白的ul41基因。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组包含能够表达功能性ul48蛋白的ul48基因。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组包含能够表达功能性ul43蛋白的ul43基因，和能够表达功能性ul41蛋白的ul41基因。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组包含能够表达功能性ul43蛋白的ul43基因，和能够表达功能性ul48蛋白的ul48基因。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组包含能够表达功能性ul41蛋白的ul41基因，和能够表达功能性ul48蛋白的ul48基因。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组包含能够表达功能性ul43蛋白的ul43基因，能够表达功能性ul41蛋白的ul41基因，和能够表达功能性ul48蛋白的ul48基因。
[0071]
在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组含有ul43基因，ul41基因(即，vhs基因)，和/或ul48基因(即，vmw65基因)，并且所述ul43基因，ul41基因，和/或ul48基因不包含功能丧失性突变。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组含有，不包含功能丧失性突变的ul43基因。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组含有，不包含功能丧失性突变的ul41基因。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组含有，不包含功能丧失性突变的ul48基因。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组含有，不包含功能丧失性突变的ul43基因和ul41基因。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组含有，不包含功能丧失性突变的ul43基因和ul48基因。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组含有，不包含功能丧失性突变的ul41基因和ul48基因。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组含有，不包含功能丧失性突变的ul43基因、ul41基因和ul48基因。
[0072]
在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组还包含下述修饰：一个或多个非必需基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，所述非必需基因选自ul3基因，ul4基因，ul14基因，ul16基因，ul21基因，ul24基因，ul31基因，ul32基因，us3基因，ul51基因，ul55基因，ul56基因，us2基因，us12基因(即，icp47基因)，lat基因，对应于jq673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段，及其任何组合。在某些优选的实施方案中，在所述重组hsv病毒的基因组中，ul3基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述重组hsv病毒的基因组中，ul4基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述重组hsv病毒的基因
组中，ul14基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述重组hsv病毒的基因组中，ul16基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述重组hsv病毒的基因组中，ul21基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述重组hsv病毒的基因组中，ul24基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述重组hsv病毒的基因组中，ul31基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述重组hsv病毒的基因组中，ul32基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述重组hsv病毒的基因组中，us3基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述重组hsv病毒的基因组中，ul51基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述重组hsv病毒的基因组中，ul55基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述重组hsv病毒的基因组中，ul56基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述重组hsv病毒的基因组中，us2基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述重组hsv病毒的基因组中，us12基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述重组hsv病毒的基因组中，lat基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述重组hsv病毒的基因组中，对应于jq673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。
[0073]
在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组还包含下述修饰：ul55基因、us2基因、lat基因和对应于jq673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段中的一个或多个被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组还包含下述修饰：ul55基因、us2基因、lat基因或对应于jq673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。
[0074]
在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的必需基因未被缺失，且不包含功能丧失性突变。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的必需基因的编码序列未被缺失或突变。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒能够表达所有必需基因。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组含有所有必需基因，并且，所有必需基因均不包含功能丧失性突变。在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组含有所有必需基因，并且，所有必需基因的编码序列均不包含突变。必需基因是hsv病毒生存和复制所不可或缺的，因此，通常而言，在重组hsv病毒中，所有必需基因均不包含功能丧失性突变。然而，易于理解的是，可以对此类必需基因的启动子进行改造(例如，将必需基因的原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子，例如htert的启动子)，从而可进一步提高重组hsv病毒的安全性，而不影响本发明的重组hsv病毒的功能/性质。因此，在某些优选的实施方案中，在所述
重组hsv病毒的基因组中，一个或多个必需基因的原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子，例如htert的启动子。在某些优选的实施方案中，所述必需基因选自icp27基因、icp4基因、vp5基因、gl基因、gh基因、gd基因、gk基因、gb基因、gn基因、ul5基因、ul6基因、ul8基因、ul9基因、ul12基因、ul25基因、ul26基因、ul28基因、ul29基因、ul30基因、ul33基因、ul36基因、ul38基因、ul42基因、ul48基因、ul52基因，以及其任何组合。
[0075]
在某些优选的实施方案中，除了如上所述的2个拷贝的icp0基因和2个拷贝的icp34.5基因之外，所述重组hsv病毒的基因组含有野生型hsv病毒的所有其他基因，并且所述其他基因均不包含功能丧失性突变。然而，易于理解的是，可以对所述其他基因的启动子进行改造(例如，将原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子，例如htert的启动子)，从而可进一步提高重组hsv病毒的安全性，而不影响本发明的重组hsv病毒的功能/性质。因此，在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组还包含下述修饰：一个或多个hsv基因的原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子，例如htert的启动子。在某些优选的实施方案中，所述hsv基因选自vp5基因、icp27基因和icp4基因。
[0076]
在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组还包含有选自下述的一项或多项修饰：
[0077]
(1)vp5基因的原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子，例如htert的启动子；
[0078]
(2)icp27基因的原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子，例如htert的启动子；
[0079]
(3)icp4基因的原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子，如htert的启动子；和
[0080]
(4)ul55基因、us2基因、lat基因和对应于jq673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段中的一个或多个被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。
[0081]
在某些优选的实施方案中，所述htert启动子具有如seq id no:5所示的序列。
[0082]
此外，还可修饰本发明的重组hsv病毒，以携带一个或多个外源核苷酸序列。例如，在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒的基因组还包含第五外源核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述第五外源核苷酸序列编码选自下列的外源蛋白：荧光蛋白、免疫调节多肽、细胞因子、趋化因子、抗体和细胞毒性肽。
[0083]
在本技术中，可以通过本领域内众所周知的技术，在所提到的各种病毒基因中引入功能丧失性突变。例如，可以通过碱基的缺失、置换或插入，在病毒基因中引入功能丧失性突变，使病毒基因在功能上失活。在某些示例性实施方案中，通过缺失(例如缺失整个基因或其部分)，使病毒基因在功能上失活。在此类实施方案中，可缺失目的病毒基因序列的至少25％，至少50％，至少75％，或100％，或者可缺失至少10bp，至少100bp，或至少1000bp的目的病毒基因序列。在某些示例性实施方案中，通过碱基的插入或缺失造成移码突变，从而使病毒基因在功能上失活。在某些示例性实施方案中，通过将整个目的基因或其部分置换为外源核苷酸序列，使病毒基因在功能上失活。
[0084]
病毒载体
[0085]
在另一方面，本发明提供了一种病毒载体，其包含根据本发明的重组hsv病毒的基因组或者由根据本发明的重组hsv病毒的基因组组成。
[0086]
在另一方面，本发明提供了一种病毒载体，其包含或者由不表达功能性功能性icp0蛋白和icp34.5蛋白的经突变的hsv基因组组成。
[0087]
在某些优选的实施方案中，在所述经突变的hsv基因组中，
[0088]
2个拷贝的icp0基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)；并且，
[0089]
2个拷贝的icp34.5基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。
[0090]
在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组包含下述修饰：
[0091]
2个拷贝的icp0基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)；并且，
[0092]
2个拷贝的icp34.5基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。
[0093]
在某些优选的实施方案中，一个拷贝的icp0基因包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)，并且另一个拷贝的icp0基因包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，一个拷贝的icp0基因被缺失，并且另一个拷贝的icp0基因包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，一个拷贝的icp0基因被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)，并且另一个拷贝的icp0基因包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。
[0094]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)。在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因包含相同的功能丧失性突变。在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因包含不同的功能丧失性突变。例如，在某些优选的实施方案中，第一拷贝的icp0基因包含第一功能丧失性突变，而第二拷贝的icp0基因包含第二功能丧失性突变。所述第一功能丧失性突变与第二功能丧失性突变可以相同或者不同。
[0095]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因被缺失。
[0096]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因被置换为相同的外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因被置换为不同的外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。例如，在某些优选的实施方案中，第一拷贝的icp0基因被置换为第一外源核苷酸序列，而第二拷贝的icp0基因被置换为第二外源核苷酸序列。所述第一外源核苷酸序列与第二外源核苷酸序列可以相同或者不同。
[0097]
在某些优选的实施方案中，一个拷贝的icp34.5基因包含功能丧失性突变(例如一
个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)，并且另一个拷贝的icp34.5基因包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，一个拷贝的icp34.5基因被缺失，并且另一个拷贝的icp34.5基因包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，一个拷贝的icp34.5基因被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)，并且另一个拷贝的icp34.5基因包含功能丧失性突变(例如，一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。
[0098]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp34.5基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)。在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp34.5基因包含相同的功能丧失性突变。在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp34.5基因包含不同的功能丧失性突变。例如，在某些优选的实施方案中，第一拷贝的icp34.5基因包含第三功能丧失性突变，而第二拷贝的icp34.5基因包含第四功能丧失性突变。所述第三功能丧失性突变与第四功能丧失性突变可以相同或者不同。
[0099]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp34.5基因被缺失。
[0100]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp34.5基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp34.5基因被置换为相同的外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp34.5基因被置换为不同的外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。例如，在某些优选的实施方案中，第一拷贝的icp34.5基因被置换为第三外源核苷酸序列，而第二拷贝的icp34.5基因被置换为第四外源核苷酸序列。所述第三外源核苷酸序列与第四外源核苷酸序列可以相同或者不同。
[0101]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)，并且，所述2个拷贝的icp34.5基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)。例如，在某些优选的实施方案中，第一拷贝的icp0基因包含第一功能丧失性突变，第二拷贝的icp0基因包含第二功能丧失性突变；并且，第一拷贝的icp34.5基因包含第三功能丧失性突变，第二拷贝的icp34.5基因包含第四功能丧失性突变。所述第一功能丧失性突变、第二功能丧失性突变、第三功能丧失性突变和第四功能丧失性突变可以相同或者不同。
[0102]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)，并且，所述2个拷贝的icp34.5基因被缺失。例如，在某些优选的实施方案中，第一拷贝的icp0基因包含第一功能丧失性突变，第二拷贝的icp0基因包含第二功能丧失性突变；并且，所述2个拷贝的icp34.5基因被缺失。所述第一功能丧失性突变和第二功能丧失性突变可以相同或者不同。
[0103]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)，并且，所述2个拷贝的icp34.5基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。例如，在某些优选的实施方案中，第一拷贝的icp0基因包含第一功能丧失性突变，第二拷贝的icp0基因包含
第二功能丧失性突变；并且，第一拷贝的icp34.5基因被置换为第三外源核苷酸序列，第二拷贝的icp34.5基因被置换为第四外源核苷酸序列。所述第一功能丧失性突变和第二功能丧失性突变可以相同或者不同。所述第三外源核苷酸序列与第四外源核苷酸序列可以相同或者不同。
[0104]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因被缺失；并且，所述2个拷贝的icp34.5基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)。例如，在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因被缺失；并且，第一拷贝的icp34.5基因包含第三功能丧失性突变，第二拷贝的icp34.5基因包含第四功能丧失性突变。所述第三功能丧失性突变和第四功能丧失性突变可以相同或者不同。
[0105]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因被缺失；并且，所述2个拷贝的icp34.5基因被缺失。在此类实施方案中，所述病毒载体不包含编码icp0蛋白的基因和编码icp34.5蛋白的基因。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组缺失了野生型hsv-1病毒基因组的nt510至nt5439之间的碱基序列以及nt120802至nt 125731之间的碱基序列。
[0106]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因被缺失；并且，所述2个拷贝的icp34.5基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。例如，在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因被缺失；并且，第一拷贝的icp34.5基因被置换为第三外源核苷酸序列，第二拷贝的icp34.5基因被置换为第四外源核苷酸序列。所述第三外源核苷酸序列与第四外源核苷酸序列可以相同或者不同。
[0107]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)，并且，所述2个拷贝的icp34.5基因各自独立地包含功能丧失性突变(例如一个或多个碱基的添加、缺失和/或置换)。例如，在某些优选的实施方案中，第一拷贝的icp0基因被置换为第一外源核苷酸序列，第二拷贝的icp0基因被置换为第二外源核苷酸序列；并且，第一拷贝的icp34.5基因包含第三功能丧失性突变，第二拷贝的icp34.5基因包含第四功能丧失性突变。所述第一外源核苷酸序列与第二外源核苷酸序列可以相同或者不同。所述第三功能丧失性突变和第四功能丧失性突变可以相同或者不同。
[0108]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)，并且，所述2个拷贝的icp34.5基因被缺失。例如，在某些优选的实施方案中，第一拷贝的icp0基因被置换为第一外源核苷酸序列，而第二拷贝的icp0基因被置换为第二外源核苷酸序列；并且，所述2个拷贝的icp34.5基因被缺失。所述第一外源核苷酸序列与第二外源核苷酸序列可以相同或者不同。
[0109]
在某些优选的实施方案中，所述2个拷贝的icp0基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)，并且，所述2个拷贝的icp34.5基因各自独立地被置换为外源核苷酸序列(例如，编码外源蛋白的核苷酸序列)。例如，在某些优选的实施方案中，第一拷贝的icp0基因被置换为第一外源核苷酸序列，第二拷贝的icp0基因被置换为第二外源核苷酸序列；并且，第一拷贝的icp34.5基因被置换为第三外源核苷酸序列，第二拷贝的icp34.5基因被置换为第四外源核苷酸序列。所述第一外源核苷酸序列、第二外源核苷酸序列、第三外源核苷酸序列和第四外源核苷酸序列可以相同或者不同。
[0110]
在某些优选的实施方案中，所述第一功能丧失性突变、第二功能丧失性突变、第三功能丧失性突变和第四功能丧失性突变各自独立地选自错义突变、无义突变、移码突变、碱基缺失、碱基置换、碱基添加、以及其任何组合(例如，基因片段的缺失或置换或添加)。
[0111]
在某些优选的实施方案中，所述第一外源核苷酸序列、第二外源核苷酸序列、第三外源核苷酸序列和第四外源核苷酸序列各自独立地编码选自下列的外源蛋白：荧光蛋白、免疫调节多肽、细胞因子、趋化因子、抗体和细胞毒性肽。
[0112]
在某些优选的实施方案中，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白(例如，具有如seq id no:7所示氨基酸序列的绿色荧光蛋白)，红色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，及其任何组合。
[0113]
在某些优选的实施方案中，所述免疫调节多肽选自cd40l、ox40l、可诱导共刺激分子(icos)、ftl3l、light、cd137l、cd70、4-1bb、gitr、cd28，及其任何组合。
[0114]
在某些优选的实施方案中，所述细胞因子选自白介素(例如il-2、il-12和il-15)、干扰素(例如ifnα、ifnβ、ifnγ)、肿瘤坏死因子(例如tnfα)、集落刺激因子(例如gm-csf)，及其任何组合。
[0115]
在某些优选的实施方案中，所述趋化因子选自ccl2、rantes、ccl7、ccl9、ccl10、ccl12、ccl15、ccl19、ccl21、ccl20、xcl-1，及其任何组合。
[0116]
在某些优选的实施方案中，所述细胞毒性肽选自胸苷激酶tk(tk/gcv)、trail、fasl，及其任何组合。
[0117]
在某些优选的实施方案中，所述抗体选自抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗tigit抗体、抗btla抗体、抗ctla-4抗体、抗tim-3抗体、抗lag-3抗体、抗cd137抗体、抗ox40抗体、抗gitr抗体、抗cd73抗体、抗kir抗体、抗icos抗体、抗csf1r抗体、抗egfr抗体、抗vegfr抗体、抗her2抗体、抗pdgfr抗体，及其任何组合。
[0118]
在某些优选的实施方案中，所述外源蛋白为抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体或其任何组合。例如，所述外源蛋白为抗pd-1单链抗体。
[0119]
在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组衍生自hsv-1病毒，hsv-2病毒，或hsv-1/hsv-2嵌合病毒(即，其基因组既含有来源于hsv-1的dna，又含有来源于hsv-2的dna的重组hsv病毒)的基因组。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组衍生自hsv-1病毒株kos的基因组。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组衍生自genbank:jq673480.1所示的基因组。
[0120]
在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组能够表达功能性ul43蛋白，功能性ul41蛋白(即，vhs蛋白)，功能性ul48蛋白(即，vmw65蛋白)，或其任何组合。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组能够表达功能性ul43蛋白。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组能够表达功能性ul41蛋白。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组能够表达功能性ul48蛋白。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组能够表达功能性ul43蛋白和功能性ul41蛋白。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组能够表达功能性ul43蛋白和功能性ul48蛋白。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组能够表达功能性ul41蛋白和功能性ul48蛋白。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组能够表达功能性ul43蛋白，功能性ul41蛋白和功能性ul48蛋白。
[0121]
在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组包含能够表达功能性ul43蛋白的ul43基因，能够表达功能性ul41蛋白的ul41基因(即，vhs基因)，和/或，能够表达功能性ul48蛋白的ul48基因(即，vmw65基因)。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组包含能够表达功能性ul43蛋白的ul43基因。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组包含能够表达功能性ul41蛋白的ul41基因。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组包含能够表达功能性ul48蛋白的ul48基因。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组包含能够表达功能性ul43蛋白的ul43基因，和能够表达功能性ul41蛋白的ul41基因。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组包含能够表达功能性ul43蛋白的ul43基因，和能够表达功能性ul48蛋白的ul48基因。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组包含能够表达功能性ul41蛋白的ul41基因，和能够表达功能性ul48蛋白的ul48基因。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组包含能够表达功能性ul43蛋白的ul43基因，能够表达功能性ul41蛋白的ul41基因，和能够表达功能性ul48蛋白的ul48基因。
[0122]
在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组含有ul43基因，ul41基因(即，vhs基因)，和/或ul48基因(即，vmw65基因)，并且所述ul43基因，ul41基因，和/或ul48基因不包含功能丧失性突变。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组含有，不包含功能丧失性突变的ul43基因。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组含有，不包含功能丧失性突变的ul41基因。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组含有，不包含功能丧失性突变的ul48基因。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组含有，不包含功能丧失性突变的ul43基因和ul41基因。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组含有，不包含功能丧失性突变的ul43基因和ul48基因。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组含有，不包含功能丧失性突变的ul41基因和ul48基因。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组含有，不包含功能丧失性突变的ul43基因、ul41基因和ul48基因。
[0123]
在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组还包含下述修饰：一个或多个非必需基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，所述非必需基因选自ul3基因，ul4基因，ul14基因，ul16基因，ul21基因，ul24基因，ul31基因，ul32基因，us3基因，ul51基因，ul55基因，ul56基因，us2基因，us12基因(即，icp47基因)，lat基因，对应于jq673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段，及其任何组合。在某些优选的实施方案中，在所述经突变的hsv基因组中，ul3基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述经突变的hsv基因组中，ul4基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述经突变的hsv基因组中，ul14基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述经突变的hsv基因组中，ul16基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述经突变的hsv基因组中，ul21基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述经突变的hsv基因组中，ul24基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述经
突变的hsv基因组中，ul31基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述经突变的hsv基因组中，ul32基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述经突变的hsv基因组中，us3基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述经突变的hsv基因组中，ul51基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述经突变的hsv基因组中，ul55基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述经突变的hsv基因组中，ul56基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述经突变的hsv基因组中，us2基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述经突变的hsv基因组中，us12基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述经突变的hsv基因组中，lat基因被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，在所述经突变的hsv基因组中，对应于jq673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。
[0124]
在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组还包含下述修饰：ul55基因、us2基因、lat基因和对应于jq673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段中的一个或多个被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组还包含下述修饰：ul55基因、us2基因、lat基因或对应于jq673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。
[0125]
在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组中的必需基因未被缺失，且不包含功能丧失性突变。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组中的必需基因的编码序列未被缺失或突变。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组能够表达所有必需基因。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组含有所有必需基因，并且，所有必需基因均不包含功能丧失性突变。在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组含有所有必需基因，并且，所有必需基因的编码序列均不包含突变。必需基因是hsv病毒生存和复制所不可或缺的，因此，通常而言，在重组hsv病毒的基因组中，所有必需基因均不包含功能丧失性突变。然而，易于理解的是，可以对此类必需基因的启动子进行改造(例如，将必需基因的原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子，例如htert的启动子)，从而可进一步提高重组hsv病毒的安全性，而不影响本发明的重组hsv病毒的功能/性质。因此，在某些优选的实施方案中，在所述经突变的hsv基因组中，一个或多个必需基因的原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子，例如htert的启动子。在某些优选的实施方案中，所述必需基因选自icp27基因和、icp4基因、vp5基因、gl基因、gh基因、gd基因、gk基因、gb基因、gn基因、ul5基因、ul6基因、ul8基因、ul9基因、ul12基因、ul25基因、ul26基因、ul28基因、ul29基因、ul30基因、ul33基因、ul36基因、ul38基因、ul42基因、ul48基因、ul52基因，以及其任何组合。
[0126]
在某些优选的实施方案中，除了如上所述的2个拷贝的icp0基因和2个拷贝的
icp34.5基因之外，所述经突变的hsv基因组含有野生型hsv病毒的所有其他基因，并且所述其他基因均不包含功能丧失性突变。然而，易于理解的是，可以对所述其他基因的启动子进行改造(例如，将原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子，例如htert的启动子)，从而可进一步提高重组hsv病毒的安全性，而不影响本发明的重组hsv病毒的功能/性质。因此，在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组还包含下述修饰：一个或多个hsv基因的原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子，例如htert的启动子。在某些优选的实施方案中，所述hsv基因选自vp5基因、icp27基因和icp4基因。
[0127]
在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组还包含有选自下述的一项或多项修饰：
[0128]
(1)vp5基因的原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子，例如htert的启动子；
[0129]
(2)icp27基因的原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子，例如htert的启动子；
[0130]
(3)icp4基因的原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子，如htert的启动子；和
[0131]
(4)ul55基因、us2基因、lat基因和对应于jq673480.1的nt5853-nt7485的核苷酸片段中的一个或多个被缺失或突变(例如包含功能丧失性突变，或者被置换为外源核苷酸序列)。
[0132]
在某些优选的实施方案中，所述htert启动子具有如seq id no:5所示的序列。
[0133]
此外，还可修饰所述经突变的hsv基因组，以携带一个或多个外源核苷酸序列。例如，在某些优选的实施方案中，所述经突变的hsv基因组还包含第五外源核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述第五外源核苷酸序列编码选自下列的外源蛋白：荧光蛋白、免疫调节多肽、细胞因子、趋化因子、抗体和细胞毒性肽。
[0134]
宿主细胞
[0135]
在另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其感染了根据本发明的重组hsv病毒，或者包含有根据本发明的重组hsv病毒的基因组，或者转染了根据本发明的病毒载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的重组hsv病毒在肿瘤细胞中具有高复制能力，但在正常细胞中仅以低水平复制。因此，在某些特别优选的实施方案中，所述细胞为肿瘤细胞。此类肿瘤细胞包括但不限于，肺癌细胞(例如h1299，h520，h1975，nci-h358和a549)；肝癌细胞(例如huh7，hep3b，hepg2，gsg7701，smmc7721，hepa1-6，bel7404，plc/prf和qgy7703)；乳腺癌细胞(例如madmb231，mcf7和madmb468)；骨肉瘤细胞(例如u2os和saos2)；卵巢癌细胞(例如skov3和caov3)；宫颈癌细胞(例如siha和hela)；前列腺癌细胞(例如pc-3)；神经胶质瘤细胞(例如u87mg)；黑色素瘤细胞(例如a375)；结直肠癌细胞(例如hct116)和胰腺癌细胞(例如panc-1)。
[0136]
制备方法
[0137]
在另一个方面，本发明涉及一种获得本发明的重组hsv病毒的方法，其包括：
[0138]
(1)培养根据本发明的宿主细胞；
[0139]
(2)待所述宿主细胞发生病变后，收集和裂解所述宿主细胞，以获得所述宿主细胞的裂解液；和
[0140]
(3)从所述裂解液中回收本发明的重组hsv病毒。
[0141]
药物组合物
[0142]
在另一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含根据本发明的重组hsv病毒，或者根据本发明的重组hsv病毒的基因组，或者根据本发明的病毒载体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。本发明的药物组合物可以用于治疗肿瘤，例如，肺癌，肝癌，乳腺癌，骨肉瘤，卵巢癌，前列腺癌，神经胶质瘤，黑色素瘤，结直肠癌，和胰腺癌。
[0143]
本发明的药物组合物可通过本领域公知的方法进行施用，例如但不限于通过注射进行施用。在某些优选的实施方案中，本发明的药物组合物通过注射(例如瘤内注射)来进行施用。在某些优选的实施方案中，本发明的药物组合物为注射液或冻干粉剂。
[0144]
在某些优选的实施方案中，所述重组hsv病毒或重组hsv病毒的基因组或病毒载体以治疗有效量(例如治疗肿瘤有效量)存在。在某些优选的实施方案中，本发明的药物组合物以单位剂量形式存在。例如但不意欲限定本发明，每单位剂量的药物组合物中包含的重组hsv病毒的量可以为10
2-109pfu，例如10
2-103pfu，10
3-104pfu，10
4-105pfu，10
5-106pfu，10
6-107pfu，10
7-108pfu，或10
8-109pfu。
[0145]
用途/使用方法
[0146]
本发明的重组hsv病毒可以用于治疗各种肿瘤。因此，在另一个方面，本发明涉及一种治疗肿瘤的方法，其包括，给有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的重组hsv病毒或本发明的病毒载体或本发明的药物组合物。在某些优选的实施方案中，所述肿瘤包括但不限于，肺癌，肝癌，乳腺癌，骨肉瘤，卵巢癌，前列腺癌，神经胶质瘤，黑色素瘤，结直肠癌，和胰腺癌。在某些优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。在某些优选的实施方案中，通过注射(例如瘤内注射)，将本发明的重组hsv病毒或本发明的病毒载体或本发明的药物组合物施用给所述受试者。
[0147]
在另一个方面，本发明涉及本发明的重组hsv病毒或本发明的病毒载体用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗受试者的肿瘤。在某些优选的实施方案中，所述肿瘤包括但不限于，肺癌，肝癌，乳腺癌，骨肉瘤，卵巢癌，前列腺癌，神经胶质瘤，黑色素瘤，结直肠癌，和胰腺癌。在某些优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物通过注射(例如瘤内注射)来进行施用。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物为注射液或冻干粉剂。
[0148]
发明的有益效果
[0149]
与现有技术中的重组单纯疱疹病毒相比，本发明的重组hsv病毒具有下述有益技术效果：本发明的重组hsv病毒在肿瘤细胞中具有高水平的复制能力，并且能够有效杀伤多种肿瘤细胞，但是在正常细胞中却具有显著降低的复制能力和杀伤能力。此外，还已显示，本发明的重组hsv病毒在动物体内具有显著降低的神经毒性，可以以显著提高的剂量施用给动物。因此，与现有的重组hsv病毒相比，本发明的重组hsv病毒不仅维持了高溶瘤能力，而且具有显著提高的安全性，能够以更高的剂量施用，具有广阔的应用前景。
[0150]
关于序列信息的说明
[0151]
本发明涉及的序列的信息提供于表1中。
[0152]
表1：序列信息
[0153][0154]
seq id no:1
[0155]
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[0166]
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seq id no:17
[0171]
ctactcgtcccagaatttggccaggacgtccttgtagaacgcgggtgggggggcctgggtccgcagctgctccagaaacctgtcggcgatatcaggggccgtgatatgccgggtcacaatagatcgcgccaggttttcgtcgcggatgtcctggtagataggcaggcgtttcagaagagtccacggcccccgctccttggggccgataagcgatatgacgtacttaatgtagcggtgttccaccagctcggtgatggtcatgggatcggggagccagtccagggactctggggcgtcgtggatgacgtggcgtcgccggctggccacataactgcggtgctcttccagcagctgcgcgttcgggacctggacgagctcgggcggggtgagtatctccgaggaggacgacctggggccggggtggcccccggtaacgtcccggggatccagggggaggtcctcgtcgtcttcgtatccgccggcgatctgttgggttagaatttcggtccacgagacgcgcatctcggtgccgccggcggccggcggcaaagggggcctggtttccgtggagcgcgagctggtgtgttcccggcggatggcccgccgggtctgagagcgactcgggggggtccagtgacattcgcgcagcacatcctccacggaggcgtaggtgttattgggatggaggtcggtgtggcagcggacaaagagggccaggaactgggggtagctcatcttaaagtactttagtatatcgcgacagttgatcgtgggaatgtagcaggcgctaatatccaacacaatatcacagcccatcaacaggaggtcagtgtctgtggtgtacacgtacgcgaccgtgttggtgtgatagaggttggcgcaggcatcgtccgcctccagctgacccgagttaatgtaggcgtaccccagggcccggagaacgcgaatacagaacagatgcgccagacgcagggccggcttcgagggcgcggcggacggcagcgcggctccggacccggccgtcccccgggtccccgaggccagagaggtgccgcgccggcgcatgttggaaaaggcagagctgggtctggagtcggtgatgggggaaggcggtggagaggcgtccacgtcactggcctcctcgtccgtccggcattgggccgtcgtgcgggccaggatggccttggctccaaacacaaccggctccatacaattgaccccgcgatcggtaacgaagatggggaaaagggacttttgggtaaacacctttaataagcgacagaggcagtgtagcgtaatggcctcgcggtcgtaactggggtatcggcgctgatatttgaccaccaacgtgtacatgacgttccacaggtccacggcgatgggggtgaagtacccggccggggccccaaggccctggcgcttgaccagatggtgtgtgtgggcaaacttcatcatcccgaacaaacccat
[0172]
seq id no:18
[0173]
atgctccgcaacgacagccaccgggccgcgtccccggaggacggccagggacgggtcgacgacggacggccacacctcgcgtgcgtgggggccctggcgcgggggttcatgcatatctggcttcaggccgccacgctgggttttgcgggatcggtcgttatgtcgcgcgggccgtacgcgaatgccgcgtctggggcgttcgccgtcgggtgcgccgtgctgggctttatgcgcgcaccccctcccctcgcgcggcccaccgcgcggatatacgcctggctcaaactggcggccggtggagcggcccttgttctgtggagtctcggggagcccggaacgcagccgggggccccgggcccggccacccagtgcctggcgctgggcgccgcctatgcggcgctcctggtgctcgccgatgacgtctatccgctctttctcctcgccccggggcccctgttcgtcggcaccctggggatggtcgtcggcgggctgacgatcggaggcagcgcgcgctactggtggatcggtgggcccgccgcggccgccttggccgcggcggtgttggcgggcccgggggcgaccaccgccagggactgcttctccagggcgtgccccgaccaccgccgcgtctgcgtcatcgtcgcaggcgagtctgtttcccgccgccccccggaggacccagagc
gacccggggaccccgggccaccgtcccccccgacaccccaacgatcccaggggccgccggccgatgaggtcgcaccggccggggtagcgcggcccgaaaacgtctgggtgcccgtggtcacctttctgggggcgggcgcgctcgccgtcaagacggtgcgagaacatgcccgggaaacgccgggcccgggcctgccgctgtggccccaggtgtttctcggaggccatgtggcggtggccctgacggagctgtgtcaggcgcttatgccctgggaccttacggacccgctgctgtttgttcacgccggactgcaggtcatcaacctcgggttggtgtttcggttttccgaggttgtcgtgtatgcggcgctagggggtgccgtgtggatttcgttggcgcaggtgctggggctccggcgtcgcctgcacaggaaggaccccggggacggggcccggttggcggcgacgcttcggggcctcttcttctccgtgtacgcgctggggtttggggtgggggcgctgctgtgccctccggggtcaacgggcgggtggtcgggcgattga
[0174]
seq id no:19
[0175]
ctacccaccgtactcgtcaattccaagggcatcggtaaacatctgctcaaactcgaagtcggccatatccagagcgccgtagggggcggagtcgtggggggtaaatcccggacccggggaatccccgtcccccaacatgtccagatcgaaatcgtctagcgcgtcggcatgcgccatcgccacgtcctcgccgtctaagtggagctcgtcccccaggctgacatcggtcgggggggccgtcgacagtctgcgcgtgtgtcccgcggggagaaaggacaggcgcggagccgccagccccgcctcttcgggggcgtcgtcgtccgggagatcgagcaggccctcgatggtagacccgtaattgtttttcgtacgcgcgcggctgtacgcgtgttcccgcatgaccgcctcggagggcgaggtcgtgaagctggaatacgagtccaacttcgcccgaatcaacaccataaagtacccagaggcgcgggcctggttgccatgcagggtgggaggggtcgtcaacggcgcccctggctcctccgtagccgcgctgcgcaccagcgggaggttaaggtgctcgcgaatgtggtttagctcccgcagccggcgggcctcgattggcactccccggacggtgagcgctccgttgacgaacatgaagggctggaacagacccgccaactgacgccagctctccaggtcgcaacagaggcagtcaaacaggtcgggccgcatcatctgctcggcgtacgcggcccataggatctcgcgggtcaaaaatagatacaaatgcaaaaacagaacacgcgccagacgagcggtctctcggtagtacctgtccgcgatcgtggcgcgcagcatttctcccaggtcgcgatcgcgtccgcgcatgtgcgcctggcggtgcagctgccggacgctggcgcgcaggtaccggtacagggccgagcagaagttggccaacacggttcgatagctctcctcccgcgcccgtagctcggcgtggaagaaacgagagagcgcttcgtagtagagcccgaggccgtcgcgggtggccggaagcgtcgggaaggccacgtcgccgtgggcgcgaatgtcgatttgggcgcgttcggggacgtacgcgtccccccattccaccacatcgctgggcagcgttgataggaatttacactcccggtacaggtcggcgttggtcggtaacgccgaaaacaaatcctcgttccaggtatcgagcatggtacatagcgcggggcccgcgctaaagcccaagtcgtcgaggagacggttaaagagggcggcgggggggacgggcatgggcggggagggcatgagctgggcctggctcaggcgccccgttgcgtacagcggaggggccgccggggtgtttttgggacccccggccgggcgggggggtggtggcgaagcgccgtccgcgtccatgtcggcaaacagctcgtcgaccaagaggtccat
[0176]
seq id no:20
[0177]
atgacagcgacccccctcaccaacctgttcttacgggccccggacataacccacgtggcccccccttactgcctcaacgccacctggcaggccgaaacggccatgcacaccagcaaaacggactccgcttgcgtggccgtgcggagttacctggtccgcgcctcctgtgagaccagcggcacaatccactgctttttctttgcggtatacaaggacacccaccatacccctccgctgattaccgagctccgcaactttgcggacctggttaaccacccgccggtcctacgcgaactggaggataagcgcggggtgcggctgcggtgtgcgcggccgtttagcgtcgggacgattaaggacgtctctgggtccggcgcgtcctcggcgggagagtacacgataaacgggatcgtgtaccactgccactgtcggtatccgttctcaaaaacatgctggatgggggcctccgcggccctacagcacctgcgctccatcagctccagcggcatggccgcccgcgcggcagagcatcgacgcgtcaagattaaaattaaggcgtga
[0178]
seq id no:21
[0179]
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[0180]
se id no:22
[0181]
cccgggacccccctgacgtcctcggcggcctccgcctcttcctcctccgcctcttcctcctcggccccgactcccgcgggggccacctcttccgccaccggggccgcgtcctcctccgcttccgcctcctcgggcggggccgtcggtgccctgggagggagacaagaggaaacctccctcggcccccgcgctgcttctgggccgcgggggccgaggaagtgtgcccggaagacgcgccacgcggagacttccggggccgtccccgcgggcggcctcacgcgctacctgcccatctcgggggtctctagcgtggtcgccctgtcgccttacgtgaacaagacgatcacgggggactgcctgcccatcctggacatggagacggggaacatcggggcgtacgtggtcctggtggaccagacgggaaacatggcgacccggctgcgggccgcggtccccggctggagccgccgcaccctgctccccgagaccgcgggtaaccacgtgacgccccccgagtacccgacggcccccgcgtcggagtggaacagcctctggatgacccccgtggggaacatgctgttcgaccagggcaccctagtgggcgccctggacttccgcagcctgcggtctcggcacccgtggtccggggagcagggggcgtcgacccgggacgagggaaaacaataagggacgcccccgtgtttgtggggaggggggggtcgggcgctgggtggtctctggccgcgcccactacaccagccaatccgtgtcggggaggtggaaagtgaaagacacgggcaccacacaccagcgggtcttttgtgttggccctaataaaaaaaactcaggggatttttgctgtctgttgggaaataaaggtttacttttgtatcttttccctgtctgtgttggatgtatcgcgggggtgcgtgggagtgggggtgcgtgggagtgggggtgcgtgggagtgggggtgcgtgggagtgggggtgcgtgggagtgggggtgcgtgggagtgggggtgcgtgggagtgggggtgcgtgggagtgggggtgcgtgggagtgggggtgccatgttgggcaggctctggtgttaaccacagagccgcggcccgggctgcctgaccaccgatccccgaaagcatcctgccactggcatggagccagaaccacagtgggttgggtgtgggtgttaagtttccgcgagcgcctgcccgcccggactgacctggcctctggccgccacaaagggcgggggggggggttaactacactatagggcaacaaaggatgggaggggtagcggggcgggacggggcgcccaaaagggggtcggccacaccacagacgtgggtgttggggggtggggcggaggggtggggggggagacagaaacaggaacatagttagaaaacaagaatgcggtgcagccagagaatcacaggagacgaggggatgggcgtgttggttaccaacccacacccaggcatgctcggtggtatgaaggagggggggcggtgtttcttagagaccgccgggggacgtggggttggtgtgcaaaggcacgcgcacccgcgccggccaggtgggccggtaccccatccccccctcccccgacccttcccacccccgcgtgccagagatcaccccggtcccccggcacccgccactcctccatatcctcgctttaggaacaactttaggggggggtacacacgcgccgtgcatttccttccacaccccccccctcccccgcactccccccccccaggcagtaagacccaagcatagagagccaggcacaaaaacacaggcggggtgggacacatgccttcttggagtacgtgggtcattggcgtggggggttacagcgacaccggccgaccccctggcggtcttccagccggcccttagataagggggcagttggtggtcggacgggtaagtaacagagtctaactaagggtgggagggggggaaaataacgggctgg
tgtgctgtaacacgagcccacccgcgagtggcgtggccgaccttagcctctggggcgccccctgtcgtttgggtccccccccctctattggggagaagcaggtgtctaacctacctggaaacgcggcgtctttgttgaacgacaccggggcgccctcgacgagtgggataacgggggaggaagggagggaggagggtactgggggtgaagggggggggggagaagcgagaacaggaaaggcgacggagcccggcagaacaccgaggaaaaaaaaaccacagcgcatgc
[0182]
seq id no:23
[0183]
ccatgttgggcaggctctggtgttaaccacagagccgcggcccgggctgcctgaccaccgatccccgaaagcatcctgccactggcatggagccagaaccacagtgggttgggtgtgggtgttaagtttccgcgagcgcctgcccgcccggactgacctggcctctggccgccacaaagggcgggggggggggttaactacactatagggcaacaaaggatgggaggggtagcggggcgggacggggcgcccaaaagggggtcggccacaccacagacgtgggtgttggggggtggggcggaggggtggggggggagacagaaacaggaacatagttagaaaacaagaatgcggtgcagccagagaatcacaggagacgaggggatgggcgtgttggttaccaacccacacccaggcatgctcggtggtatgaaggagggggggcggtgtttcttagagaccgccgggggacgtggggttggtgtgcaaaggcacgcgcacccgcgccggccaggtgggccggtaccccatccccccctcccccgacccttcccacccccgcgtgccagagatcaccccggtcccccggcacccgccactcctccatatcctcgctttaggaacaactttaggggggggtacacacgcgccgtgcatttccttccacaccccccccctcccccgcactccccccccccaggcagtaagacccaagcatagagagccaggcacaaaaacacaggcggggtgggacacatgccttcttggagtacgtgggtcattggcgtggggggttacagcgacaccggccgaccccctggcggtcttccagccggcccttagataagggggcagttggtggtcggacgggtaagtaacagagtctaactaagggtgggagggggggaaaataacgggctggtgtgctgtaacacgagcccacccgcgagtggcgtggccgaccttagcctctggggcgccccctgtcgtttgggtccccccccctctattggggagaagcaggtgtctaacctacctggaaacgcggcgtctttgttgaacgacaccggggcgccctcgacgagtgggataacgggggaggaagggagggaggagggtactgggggtgaagggggggggggagaagcgagaacaggaaaggcgacggagcccggcagaacaccgaggaaaaaaaaaccacagcgcatgcgccgggccgttgtggggccccgggccggggccccttgggtccgccggggccccgggccgggccgccacgggggccggccgttggcggtaaccccgagtgttcatctcaggccccgggccgggaacccggaaaagcctccggggggcctttttcgcgtcgcgtgccggcgagcgggtccggacggggcccggaccgccgcggtcgggggcccctcgtcccgggccgtacgcggccttcgccccgtgaggggacagacgaacgaaacattccggcgacggaacgaaaaacaccccagacgggttaaagaaacagaaaccgcaacccccaccacccccgaaacggggaaaacgaaaaaacagaccagcggccggccggcgcttagggggaggatgtcgccgacgccccttggccgccccggctgca
[0184]
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
[0185]
图1a显示了重组病毒ovn的构建策略。
[0186]
图1b显示了重组病毒ovh的构建策略。
[0187]
图2示意性展示了重组病毒hsv1716、nv1020、g207、oncovex
gm-csf
(t-vec)和ovn所包含的基因组修饰；其中，符号
“×”
表示缺失。
[0188]
图3示意性展示了与病毒株kos相比，重组病毒ovn、ovh和dicp0所包含的基因组修饰；其中，符号
“×”
表示缺失。
[0189]
图4显示了以病毒株kos、ovn、ovh或dicp0的基因组为模板，用特异性扩增icp0基因、icp34.5基因、icp27基因或htert核心启动子的引物分别进行pcr所获得的产物的凝胶电泳结果。
[0190]
图5显示了分析kos、ovn、ovh或dicp0的ie基因表达(mrna)的实时定量pcr的实验结果。
[0191]
图6显示了以moi＝1的感染复数用病毒kos、ovn、ovh或dicp0感染l-o2细胞(图6a)或u-2os细胞(图6b)48h后的病毒滴度。
[0192]
图7显示了以moi＝0.01的感染复数用病毒kos、ovn、ovh或dicp0感染单层的u-2os细胞后不同时间点(感染后12h、24h、36h、48h和60h)的病毒滴度。图7的结果显示，病毒kos、ovn、ovh或dicp0在肿瘤细胞(例如u-2os细胞)中具有基本上相当的复制能力。
[0193]
图8显示了以moi＝1的感染复数用病毒kos、ovn、ovh或dicp0感染l-o2细胞(图8a)或u-2os细胞(图8b)72h后的细胞存活率；其中，mock表示未感染病毒的细胞。图8的结果显示，病毒kos、ovn、ovh和dicp0对肿瘤细胞(例如u-2os细胞)具有基本上相当的细胞杀伤能力，但是病毒ovn和ovh对正常细胞(例如l-o2细胞)的细胞杀伤能力显著低于病毒kos和dicp0。
[0194]
图9显示了用病毒ovn或ovh感染各种肿瘤细胞48h后的细胞存活率；其中，mock表示未感染病毒的肿瘤细胞。图9的实验结果显示，重组病毒ovn和ovh可显著杀伤多种肿瘤细胞。
[0195]
图10显示了以指定剂量颅内注射病毒kos、dicp0、ovn或ovh后小鼠的存活率；其中，vehicle表示未注射病毒的小鼠。
[0196]
图11显示了接种了huh7细胞的裸鼠在接受ovn或ovh治疗后的肿瘤体积-时间曲线(图11a)和存活率-时间曲线(图11b)；其中，dmem表示未接受治疗的小鼠。
[0197]
图12显示了接种了hepa1-6细胞的正常小鼠(c57bl/6)在接受ovn或ovh治疗后背部左侧肿瘤(图12a)和背部右侧肿瘤(图12b)的肿瘤体积-时间曲线；其中，dmem表示未接受治疗的小鼠。
[0198]
图13示意性展示了重组病毒ovh、ovh1和ovh2与重组病毒ovn的基因组结构差异；其中，与重组病毒ovn相比，重组病毒ovh的icp27基因的原生启动子序列、重组病毒ovh1的vp5基因的原生启动子序列、重组病毒ovh2的icp4基因的原生启动子序列分别被替换为htert核心启动子序列。
[0199]
图14示意性展示了重组病毒d34.5/0lacz、ovn、ovn-gfp、ovn-pd-1-scfv、ovh-gfp和ovh-pd-1-scfv的基因组结构差异；其中“null”表示缺失。
[0200]
图15显示了用重组病毒ovn-gfp或ovh-gfp感染的u-2os细胞的荧光显微镜观察结果。
[0201]
图16显示了用重组病毒ovh或ovh-pd-1-scfv感染u-2os细胞24h或48h后，细胞上清液抑制pd-1/pd-l1的特异性结合的能力(图16a)以及细胞上清液与pd-1蛋白之间的相互作用(图16b)的分析结果；其中，mock表示未感染病毒的肿瘤细胞。
[0202]
图17显示了接种了hepa1-6细胞的正常小鼠(c57bl/6)在接受ovh或ovh-pd-1-scfv治疗后背部左侧肿瘤(图17a)和背部右侧肿瘤(图17b)的肿瘤体积-时间曲线；其中，vehicle表示未接受治疗的小鼠。
[0203]
图18显示了以moi＝0.01的感染复数用病毒ovn、ovn-dul41、ovn-dul43、ovn-dul48、ovn-dul55、ovn-dus2、ovn-dlat或ovn-dnf分别感染u-2os细胞60h后的病毒滴度。
[0204]
图19显示了以moi＝0.5的感染复数用病毒ovn、ovn-dul41、ovn-dul43、ovn-dul48、ovn-dul55、ovn-dus2、ovn-dlat或ovn-dnf分别感染正常细胞(l-o2细胞；图19a)或肿瘤细胞(u-2os细胞；图19b)72h后的细胞存活率。
具体实施方式
[0205]
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
[0206]
除非特别指明，否则本技术中所使用的分子生物学实验方法、病毒学实验方法、免疫检测法以及动物学实验方法均是本领域技术人员惯常使用的实验方法。例如，分子生物学实验方法可参照j.sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及f.m.ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，john wiley&sons,inc.，1995中所述的方法进行。各实施例中所使用的试剂(例如酶，质粒及引物)均购自商业化公司，并且，各种试剂(例如酶)依照产品制造商推荐的条件来使用。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
[0207]
实施例1.重组病毒ovn和ovh的构建
[0208]
(1.1)i型单纯疱疹病毒(hsv-1)的培养及滴度测定
[0209]
野生型hsv-1病毒株kos购自美国atcc公司(货号vr-1493
tm
)，其全基因组信息已公开于ncbi(genbank:jq673480.1)。在moi＝0.1的条件下，用病毒株kos感染培养的vero细胞(购买于美国atcc公司，货号ccl-81
tm
)。48小时后，用细胞刮收集所有的细胞，并进行离心，以去除细胞培养液。将获得的细胞沉淀重悬于新鲜的完全培养基中，并保存在-80℃。随后，对细胞悬液进行反复冻融(3次)，然后离心，收集上清，获得病毒液。将病毒液分装，并保存在-80℃。
[0210]
以1
×
106个细胞的密度，将u-2os细胞(购买于美国atcc公司，货号htb-96
tm
)接种于6cm培养板中。待细胞长成单层后，对如上获得的病毒液进行系列10倍梯度稀释，然后用各个稀释梯度的病毒液(500μl)感染细胞。感染75min之后，弃去细胞培养液，加入5ml新鲜的完全培养基，继续培养细胞。2h后，加入10ml甲基纤维素培养基，然后将培养板放入培养箱中培养2天。随后，向培养板中加入含有0.01％中性红的基础培养基，并继续培养12hr。培养结束后，弃去所有细胞培养液，并对各个培养板的空斑进行计数。根据各个培养板的空斑数及病毒液的稀释倍数，按照以下公式计算出病毒滴度：病毒滴度(pfu/ml)＝每板空斑数
×2×
病毒稀释倍数。
[0211]
(1.2)重组质粒的构建
[0212]
使用限制性内切酶saci和psti，将野生型hsv-1病毒基因组(genbank:jq673480.1)的第33位碱基(nt33)至第5876位碱基(nt5876)之间的序列(seq id no:1)克隆入商购获得的puc57载体(上海生工)，从而获得质粒puc57-f0。随后，使用限制性内切酶ncoi和sali，将质粒puc57-f0中ncoi和sali酶切位点之间的序列替换成lacz的基因序列(seq id no:2)，从而获得质粒puc57-d34.5/0lacz。另外，还将质粒puc57-f0中ncoi和sali酶切位点之间的序列切除，从而获得puc57-d34.5/0质粒。
[0213]
(1.3)重组病毒ovn和ovh的构建及鉴定
cells[j].cancer res,1999,59(3):551-557)，从而获得质粒puc57-27p/htert。在质粒puc57-27p/htert中，icp27基因受肿瘤特异性启动子(即，htert核心启动子)调控。
[0224]
随后，参照(1.3.1)和(1.3.2)描述的构建方法，以重组病毒ovn为起始病毒，利用质粒puc57-27p/lacz和puc57-27p/htert，将htert核心启动子序列导入重组病毒ovn基因组中，用于调控icp27基因，从而构建获得重组病毒ovh。经测序验证，与重组病毒ovn相比，重组病毒ovh基因组中，icp27基因的原生启动子序列(野生型hsv-1基因组(genbank:jq673480.1)的nt113423至nt113589)已被替换为htert核心启动子序列(seq id no:5)。
[0225]
(1.4)重组病毒ovn和ovh与已知的重组hsv病毒的比较
[0226]
目前，已开发了多种意欲用于肿瘤治疗的重组hsv病毒，包括例如hsv1716、nv1020、g207、oncovex
gm-csf
(t-vec)等。这些重组hsv病毒与本发明的重组病毒ovn和ovh各自包含的基因组修饰概述于下面的表2中。
[0227]
表2：各种重组hsv病毒所包含的基因组修饰
[0228][0229]
图2示意性展示了重组病毒hsv1716、nv1020、g207、oncovex
gm-csf
(t-vec)和ovn所包含的基因组修饰。
[0230]
实施例2.重组病毒ovn和ovh的表征
[0231]
参照实施例1中描述的方法，构建了重组病毒dicp0，其与病毒株kos相比，缺失了双拷贝的icp0基因。将病毒株kos和重组病毒dicp0用作对照病毒，以对重组病毒ovn和ovh进行表征。图3示意性展示了与病毒株kos相比，重组病毒ovn、ovh和dicp0所包含的基因组修饰；其中，与病毒株kos相比，重组病毒dicp0缺失了双拷贝的icp0基因；重组病毒ovn缺失了双拷贝的icp34.5基因和icp0基因；重组病毒ovn缺失了双拷贝的icp34.5基因和icp0基因，并且icp27基因的原生启动子被替换为htert核心启动子。
[0232]
通过pcr方法来验证重组病毒ovn、ovh和dicp0中的基因缺失。简言之，以病毒株kos、ovn、ovh或dicp0的基因组为模板，用特异性扩增icp0基因、icp34.5基因、icp27基因或htert核心启动子的引物分别进行pcr。pcr所使用的引物概述于表3中。
[0233]
表3：引物序列
[0234]
[0235][0236]
反应结束后，通过凝胶电泳检测pcr产物。结果如图4所示。图4显示了以病毒株kos、ovn、ovh或dicp0的基因组为模板，用特异性扩增icp0基因、icp34.5基因、icp27基因或htert核心启动子的引物分别进行pcr所获得的产物的凝胶电泳结果；其中，泳道1表示dna分子量标记；泳道2表示以病毒株kos基因组为模板的pcr产物；泳道3表示以重组病毒dicp0基因组为模板的pcr产物；泳道4表示以重组病毒ovn基因组为模板的pcr产物；泳道5表示以重组病毒ovh基因组为模板的pcr产物；泳道6表示以水为模板的pcr产物。
[0237]
图4的结果显示，病毒株kos的基因组中包含icp0基因、icp34.5基因和icp27基因，但不包含htert核心启动子；重组病毒dicp0的基因组中包含icp34.5基因和icp27基因，但不包含icp0基因和htert核心启动子；重组病毒ovn的基因组中包含icp27基因，但不包含icp34.5基因、icp0基因和htert核心启动子；重组病毒ovh的基因组中包含icp27基因和htert核心启动子，但不包含icp34.5基因和icp0基因。
[0238]
另外，还使用实时定量pcr法分析kos、ovn、ovh或dicp0感染细胞后的基因表达(mrna)。简言之，用kos、ovn、ovh和dicp0分别感染宿主细胞u-2os。待细胞发生病变后，收获细胞并提取总mrna。将总mrna反转录为cdna，并使用特异性扩增icp0基因、icp34.5基因或icp27基因的引物分别进行实时定量pcr。结果如图5所示。
[0239]
图5显示了分析kos、ovn、ovh或dicp0的ie基因表达(mrna)的实时定量pcr的实验结果。图5的结果显示，病毒株kos能够表达icp0基因、icp34.5基因和icp27基因；重组病毒dicp0能够表达icp34.5基因和icp27基因，但不表达icp0基因；重组病毒ovn和ovh均能够表达icp27基因，但均不表达icp34.5基因和icp0基因。这表明，重组病毒dicp0已缺失了双拷贝的icp0基因，其在感染宿主细胞后不能表达icp0蛋白；并且，重组病毒ovn和ovh均缺失了双拷贝的icp34.5基因和icp0基因，其在感染宿主细胞后不能表达icp0蛋白和icp34.5蛋白。
[0240]
实施例3.重组病毒ovn/ovh的复制能力和杀伤能力的评估
[0241]
以5-7.5
×
106个细胞/板的密度，将状态良好、处于对数生长期的正常细胞(l-o2细胞)和肿瘤细胞(u-2os细胞)接种于6cm培养板中。随后，以moi＝1的感染复数，用病毒kos、ovn、ovh或dicp0感染培养的细胞。感染48h后，在显微镜下观察细胞的状态，并拍照记录。随后，将感染了病毒的细胞消化，并用台盼蓝染色法计算细胞的存活率。细胞存活率(％)＝(感染病毒后的活细胞数目)/(未感染病毒的对照细胞的数目)
×
100。每组实验均设置3孔重复，实验结果为3次独立实验的平均值。另外，参照实施例1中描述的方案，测定用病毒kos、ovn、ovh或dicp0感染正常细胞(l-o2细胞)和肿瘤细胞(u-2os细胞)后不同时间点的病毒滴度。每组实验均设置3孔重复，实验结果为3次独立实验的平均值。实验结果如图6-8所示。
[0242]
图6显示了以moi＝1的感染复数用病毒kos、ovn、ovh或dicp0感染l-o2细胞(图6a)或u-2os细胞(图6b)48h后的病毒滴度。图6a的结果显示，在感染l-o2细胞后，病毒kos和
dicp0均以高水平复制，感染48h后二者的病毒滴度分别达到约1.94
×
107和3.01
×
106pfu/ml；而病毒ovn和ovh的复制能力显著下降，感染48h后二者的病毒滴度分别仅为约2.14
×
105和1.85
×
103pfu/ml。图6b的结果显示，在感染u-2os细胞后，病毒kos、ovn、ovh和dicp0均以高水平复制，感染48h后它们的病毒滴度均在1.01-1.83
×
108pfu/ml。这些结果表明，病毒kos和dicp0能够在正常细胞(例如l-o2细胞)和肿瘤细胞(例如u-2os细胞)中以高水平复制；而病毒ovn和ovh仅能在肿瘤细胞(例如u-2os细胞)中以高水平复制(其复制能力与病毒kos和dicp0相比，仅略微下降)，在正常细胞(例如l-o2细胞)中的复制能力则显著下降。例如，在l-o2细胞中，与病毒kos相比，病毒ovn和ovh的复制能力分别下降约90倍和104倍；与病毒dicp0相比，病毒ovn和ovh的复制能力分别下降约14倍和1.6
×
103倍。
[0243]
图7显示了以moi＝0.01的感染复数用病毒kos、ovn、ovh或dicp0感染单层的u-2os细胞后不同时间点(感染后12h、24h、36h、48h和60h)的病毒滴度。图7的结果显示，病毒kos、ovn、ovh或dicp0在肿瘤细胞(例如u-2os细胞)中具有基本上相当的复制能力。
[0244]
图8显示了以moi＝1的感染复数用病毒kos、ovn、ovh或dicp0感染l-o2细胞(图8a)或u-2os细胞(图8b)72h后的细胞存活率；其中，mock表示未感染病毒的细胞。图8a的结果显示，在感染72h后，病毒kos和dicp0对l-o2细胞的杀伤分别为约91.5％和89％(二者对l-o2细胞均有显著杀伤)；病毒ovn和ovh对l-o2细胞的杀伤分别为约42％和5％(二者对l-o2细胞的杀伤能力显著下降)。图8b的结果显示，在感染72h后，病毒kos、ovn、ovh和dicp0均能100％杀伤u-2os细胞(对u-2os细胞均具有极强的杀伤能力)。这些结果表明，病毒kos和dicp0对正常细胞(例如l-o2细胞)和肿瘤细胞(例如u-2os细胞)均具有极高的杀伤活性；而病毒ovn和ovh仅对肿瘤细胞(例如u-2os细胞)具有高杀伤活性(其杀伤能力与病毒kos和dicp0基本上相同)，但是对正常细胞(例如l-o2细胞)的杀伤能力则显著下降。例如，在l-o2细胞中，与病毒kos相比，病毒ovn和ovh的杀伤能力分别下降约54.1％和94.5％；与病毒dicp0相比，病毒ovn和ovh的杀伤能力分别下降约52.8％和94.4％。
[0245]
图6-8的实验结果表明，与野生型病毒kos和重组病毒dicp0相比，重组病毒ovn和ovh在正常细胞中的复制能力和杀伤能力显著降低，而在肿瘤细胞中的复制能力和杀伤能力基本上相当(或者仅略微下降)。这表明，本发明的重组病毒ovn和ovh不仅能够维持在肿瘤细胞中的高复制能力和高杀伤能力(具有良好的抗肿瘤活性)，而且对正常细胞的毒力显著降低。因此，本发明的重组病毒ovn和ovh可用于抗肿瘤治疗，并且其对正常细胞具有更高的安全性，可以以更高的剂量使用。
[0246]
另外，还参照如上描述的方法，测定了重组病毒ovn和ovh对各种肿瘤细胞的杀伤能力。简言之，以5-7.5
×
106个细胞/板的密度，将状态良好、处于对数生长期的肿瘤细胞接种于6cm培养板中。随后，以moi＝1的感染复数，用病毒ovn或ovh感染培养的肿瘤细胞。感染48h后，将感染了病毒的肿瘤细胞消化，并用台盼蓝染色法计算肿瘤细胞的存活率。在本实验中，将未用病毒感染的细胞用作对照。细胞存活率(％)＝(感染病毒后的活细胞数目)/(未感染病毒的对照细胞的数目)
×
100。每组实验均设置3孔重复，实验结果为3次独立实验的平均值。实验结果如图9所示。
[0247]
图9显示了用病毒ovn或ovh感染各种肿瘤细胞48h后的细胞存活率；其中，mock表示未感染病毒的肿瘤细胞。图9的实验结果显示，重组病毒ovn和ovh可显著杀伤多种肿瘤细胞，包括例如肺癌细胞h1299，h520，h1975，nci-h358和a549(5株)；肝癌细胞huh7，hep3b，
hepg2，gsg7701，smmc7721，hepa1-6，bel7404，plc/prf，qgy7703(9株)；乳腺癌细胞madmb231，mcf7，madmb468(3株)；骨肉瘤细胞u2os和saos2(2株)；卵巢癌细胞skov3和caov3(2株)；宫颈癌细胞siha和hela(2株)；前列腺癌细胞pc-3(1株)；神经胶质瘤细胞u87mg(1株)；黑色素瘤a375(1株)；结直肠癌hct116(1株)和胰腺癌panc1(1株)；并且ovn和ovh的肿瘤杀伤能力相当。这些实验结果表明，本发明的重组病毒ovn和ovh对各种肿瘤细胞均具有良好的杀伤活性，可用于肿瘤治疗。
[0248]
实施例4.重组病毒ovn/ovh的神经毒性和体内安全性的评估
[0249]
疱疹病毒具有神经毒性以及神经潜伏性，其最大的危害在于能感染人或动物的中枢神经系统，导致严重的副反应例如脑炎等。因此，评价疱疹病毒安全性的最直接以及最灵敏的方式是，在幼鼠颅内注射病毒，并评估病毒对鼠中枢神经系统的直接杀伤。在本实施例中，我们利用由颅内注射病毒诱发的小鼠脑炎模型，评价了各种重组hsv-1病毒对小鼠的神经毒性及安全性。
[0250]
简言之，以4-6周龄的balb/c雌鼠(n＝10)为实验对象，在鼠脑的左前叶、靠近冠状缝与矢状缝交界的位置处缓慢颅内注射20μl病毒。注射完毕后，每天观察小鼠的发病情况及生存情况。图10显示了以指定剂量颅内注射病毒kos、dicp0、ovn或ovh后小鼠的存活率；其中，vehicle表示未注射病毒的小鼠。
[0251]
实验结果显示，当颅内注射1
×
104pfu野生型病毒kos时，100％的小鼠会发生中度至重度的副反应；疾病发作后，小鼠常伴有毛发耸立、厌食、怕冷，行动迟缓甚至瘫痪等症状；并且，100％的小鼠会在病毒注射后4-6日内死亡(图10)。当颅内注射1
×
105pfu的病毒dicp0时，约80％的小鼠会在病毒注射后4-8日内死亡，仅有剩下20％的小鼠在一周后逐渐恢复。
[0252]
当颅内注射高剂量(1
×
107pfu)的病毒ovn时，在整个实验周期内，无小鼠(0/10)死亡，小鼠存活率为100％。这表明，与野生型病毒kos和重组病毒dicp0相比，病毒ovn的神经毒性显著降低，体内安全性显著提高，其使用剂量分别可提高至少1000倍和100倍。
[0253]
当颅内注射更高剂量(4
×
107pfu)的病毒ovn时，在整个实验周期内，仅一只小鼠(1/10)死亡，小鼠存活率为90％。这表明，病毒ovn对小鼠的半致死剂量高于4
×
107pfu，具有优良的体内安全性。
[0254]
当颅内注射4
×
107pfu的病毒ovh时，在整个实验周期内，无小鼠(0/10)死亡，小鼠存活率为100％。并且，更重要的是，在整个实验周期内，小鼠未表现出任何不良反应。这表明，相对于病毒ovn，病毒ovh的神经毒性进一步显著下降，体内安全性进一步显著提升。
[0255]
上述实验结果表明，本发明的病毒ovn和ovh的神经毒性小，体内安全性高，具有广阔的应用前景。
[0256]
实施例5.重组病毒ovn/ovh的治疗潜能的评估
[0257]
在37℃，5％co2的培养箱中，在含10％小牛血清的完全培养基中培养肿瘤细胞(huh7和hepa1-6)。当细胞生长至对数生长期时，细胞用0.05％的胰酶进行消化，并用pbs进行洗涤，从而获得重悬于pbs中的细胞悬液(细胞密度为5
×
107个/ml)。
[0258]
取0.1ml的huh7细胞悬液，分别接种于5-6周龄的裸鼠(nude mice)背部右侧皮下。当小鼠背部肿瘤生长至6mm
×
6mm(肿瘤体积约为100mm3)时，将小鼠分组(n＝8/组)，并开始给予治疗(第0天)。治疗方案如下：瘤内注射1
×
107pfu病毒(ovn或ovh)或相同体积的dmem
(用作对照)，每3天注射一次，共注射3次。
[0259]
取0.1ml的hepa1-6细胞悬液，分别接种于5周龄正常小鼠(c57bl/6)背部左右两侧皮下。当小鼠背部肿瘤生长至6mm
×
6mm(肿瘤体积约为100mm3)时，将小鼠分组，并开始给予治疗。治疗方案如下：右侧瘤内注射1
×
107pfu病毒(ovn或ovh)或相同体积的dmem，每3天注射一次，共注射3次。
[0260]
每隔3天监测小鼠状态，并用电子游标卡尺测量肿瘤的大小。按照以下公式计算肿瘤体积和抑瘤率：
[0261]
v(volume)＝[l
×
(w)2]/2；l表示长径，w表示短径。
[0262]
抑瘤率＝(对照组肿瘤体积-实验组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积
×
100％。
[0263]
实验结果概述于图11-12中。
[0264]
图11显示了接种了huh7细胞的裸鼠在接受ovn或ovh治疗后的肿瘤体积-时间曲线(图11a)和存活率-时间曲线(图11b)；其中，dmem表示未接受治疗的小鼠。图11a的结果显示，在三次病毒注射后，重组病毒ovn和ovh都显著抑制了肿瘤的生长；在第21天，ovn的抑瘤率达到86.1％，ovh的抑瘤率达到78％。图11b的结果显示，在三次病毒注射后，重组病毒ovn和ovh都显著延长了荷瘤裸鼠的生存时间；在第60天，对照组裸鼠完全死亡，而接受重组病毒ovn或ovh的裸鼠在整个实验结束后，存活率仍达到75％。
[0265]
图12显示了接种了hepa1-6细胞的正常小鼠(c57bl/6)在接受ovn或ovh治疗后背部左侧肿瘤(图12a)和背部右侧肿瘤(图12b)的肿瘤体积-时间曲线；其中，dmem表示未接受治疗的小鼠。图12的结果显示，在右侧肿瘤接受三次病毒注射后，重组病毒ovn和ovh不仅安全清除了小鼠背部右侧的肿瘤，而且清除了背部左侧的肿瘤。
[0266]
这些实验结果证实，本发明的病毒ovn和ovh在体内具有显著的治疗肿瘤的潜能，具有广阔的应用前景。
[0267]
实施例6.其他重组病毒的构建和表征(1)
[0268]
在本实施例中，基于重组病毒ovn和ovh，构建了一系列衍生的重组病毒。
[0269]
参照实施例1(特别是1.3.1-1.3.3)中描述的方法，以重组病毒ovn为起始病毒，利用重组质粒将htert核心启动子序列导入重组病毒ovn基因组中，用于调控vp5基因或icp4基因，从而构建获得重组病毒ovh1和ovh2。
[0270]
经测序验证，与重组病毒ovn相比，重组病毒ovh1基因组中，vp5基因的原生启动子序列(野生型hsv-1基因组(genbank:jq673480.1)的nt40729-nt40475)已被替换为htert核心启动子序列(seq id no:5)；重组病毒ovh2基因组中，icp4基因的原生启动子序列(野生型hsv-1基因组(genbank:jq673480.1)的nt146151-nt146867以及nt131706-nt130990)已被替换为htert核心启动子序列(seq id no:5)。
[0271]
图13示意性展示了重组病毒ovh、ovh1和ovh2与重组病毒ovn的基因组结构差异；其中，与重组病毒ovn相比，重组病毒ovh的icp27基因的原生启动子序列、重组病毒ovh1的vp5基因的原生启动子序列、重组病毒ovh2的icp4基因的原生启动子序列分别被替换为htert核心启动子序列。
[0272]
另外，参照实施例1(特别是1.3.1-1.3.3)中描述的方法，以重组病毒d34.5/0lacz为起始病毒，利用重组质粒将编码gfp蛋白(seq id no:7)的核苷酸序列和编码抗人pd-1单链抗体(seq id no:8)的核苷酸序列分别导入重组病毒d34.5/0lacz基因组中并替换lacz
基因，从而构建获得重组病毒ovn-gfp和ovn-pd-1-scfv。经测序验证，与重组病毒d34.5/0lacz相比，重组病毒ovn-gfp基因组中，两个拷贝的lacz基因均已被替换为编码gfp蛋白的核苷酸序列(也即，在重组病毒ovn-gfp的基因组中，野生型hsv-1基因组(genbank:jq673480.1)的nt510至nt5439区间的序列和nt120802至nt125731区间的序列被替换为编码gfp蛋白的核苷酸序列)；重组病毒ovn-pd-1-scfv基因组中，两个拷贝的lacz基因均已被替换为编码pd-1单链抗体的核苷酸序列(也即，在重组病毒ovn-pd-1-scfv的基因组中，野生型hsv-1基因组(genbank:jq673480.1)的nt510至nt5439区间的序列和nt120802至nt125731区间的序列被替换为编码pd-1单链抗体的核苷酸序列)。
[0273]
进一步，以重组病毒ovn-gfp和ovn-pd-1-scfv为起始病毒，利用质粒puc57-27p/lacz和puc57-27p/htert，将htert核心启动子序列导入起始病毒基因组中，用于调控icp27基因，从而构建获得重组病毒ovh-gfp和ovh-pd-1-scfv。
[0274]
经测序验证，与重组病毒ovn-gfp相比，重组病毒ovh-gfp基因组中，icp27基因的原生启动子序列(野生型hsv-1基因组(genbank:jq673480.1)的nt113423至nt113589)已被替换为htert核心启动子序列(seq id no:5)。与重组病毒ovn-pd-1-scfv相比，重组病毒ovh-pd-1-scfv基因组中，icp27基因的原生启动子序列(野生型hsv-1基因组(genbank:jq673480.1)的nt113423至nt113589)已被替换为htert核心启动子序列(seq id no:5)。
[0275]
图14示意性展示了重组病毒d34.5/0lacz、ovn、ovn-gfp、ovn-pd-1-scfv、ovh-gfp和ovh-pd-1-scfv的基因组结构差异。
[0276]
以1
×
106个细胞的密度，将u-2os细胞(购买于美国atcc公司，货号htb-96
tm
)接种于6cm培养板中。待细胞长成单层后，用重组病毒ovn-gfp和ovh-gfp分别感染细胞。待细胞发生病变后，在荧光显微镜下观察重组病毒ovn-gfp和ovh-gfp感染的细胞。结果如图15所示。图15显示了用重组病毒ovn-gfp或ovh-gfp感染的u-2os细胞的荧光显微镜观察结果。图15的结果显示，ovn-gfp和ovh-gfp感染的u-2os细胞能够发出绿色荧光。这表明，重组病毒ovn-gfp和ovh-gfp在感染宿主细胞后，能够表达gfp蛋白。
[0277]
以1
×
106个细胞的密度，将u-2os细胞(购买于美国atcc公司，货号htb-96
tm
)接种于6cm培养板中。待细胞长成单层后，用重组病毒ovh和ovh-pd-1-scfv分别感染细胞。分别于感染24小时和48小时后，收获细胞的培养上清，用于后续检测。对感染后48h收集的上清进行系列2倍梯度稀释，并通过基于pd-1单链抗体和pd-l1蛋白竞争结合pd-1蛋白而建立的elisa方法检测各个稀释度的上清抑制pd-1/pd-l1之间的相互作用的能力。另外，还通过基于pd-1单链抗体和pd-1蛋白之间的反应性而建立的elisa方法，测定了感染后24h和48h收集的上清与pd-1之间的相互结合能力。实验结果如图16所示。
[0278]
图16显示了用重组病毒ovh或ovh-pd-1-scfv感染u-2os细胞24h或48h后，细胞上清液抑制pd-1/pd-l1的特异性结合的能力(图16a)以及细胞上清液与pd-1蛋白之间的相互作用(图16b)的分析结果；其中，mock表示未感染病毒的肿瘤细胞。图16的结果显示，ovh-pd-1-scfv感染的u-2os细胞的上清液能够抑制pd-1/pd-l1的特异性结合，并且能够特异性结合pd-1。这表明，重组病毒ovh-pd-1-scfv在感染宿主细胞后表达了pd-1单链抗体，其能够与pd-1结合，且能够阻断pd-1/pd-l1之间的相互作用。
[0279]
图15-16的实验结果表明，本发明的重组病毒ovn和ovh的基因组可用作病毒载体，用于携带和表达外源基因。
[0280]
另外，还按照实施例5中描述的方法，在接种了hepa1-6细胞的正常小鼠(c57bl/6)中验证了重组病毒ovh和ovh-pd-1-scfv治疗肿瘤的能力。结果如图17所示。
[0281]
图17显示了接种了hepa1-6细胞的正常小鼠(c57bl/6)在接受ovh或ovh-pd-1-scfv治疗后背部左侧肿瘤(图17a)和背部右侧肿瘤(图17b)的肿瘤体积-时间曲线；其中，vehicle表示未接受治疗的小鼠。图17的结果显示，在右侧肿瘤接受三次病毒注射后，重组病毒ovh和ovh-pd-1-scfv不仅安全清除了小鼠背部右侧的肿瘤，而且清除了背部左侧的肿瘤。
[0282]
这些实验结果证实，本发明的重组病毒ovh-pd-1-scfv和ovh在体内具有显著的治疗肿瘤的潜能，具有广阔的应用前景。
[0283]
实施例7.其他重组病毒的构建和表征(2)
[0284]
在本实施例中，基于重组病毒ovn，构建了一系列衍生的重组病毒。简言之，参照实施例1(特别是1.3.1-1.3.3)中描述的方法，以重组病毒ovn为起始病毒，利用重组质粒将重组病毒ovn基因组中的非必需基因ul41、ul43、ul48、ul55、us2、lat或nf分别删除，从而构建获得重组病毒ovn-dul41、ovn-dul43、ovn-dul48、ovn-dul55、ovn-dus2、ovn-dlat和ovn-dnf。
[0285]
经测序验证，与重组病毒ovn相比，重组病毒ovn-dul41基因组中，ul41(vhs)基因(genbank:afe62869.1；对应于野生型hsv-1基因组(genbank:jq673480.1)的nt91088-nt92557)已被缺失；重组病毒ovn-dul43基因组中，ul43基因(genbank:afe62871.1；对应于野生型hsv-1基因组(genbank:jq673480.1)的nt94721-nt95968)已被缺失；重组病毒ovn-dul48基因组中，ul48(vmw65)基因(genbank:afe62876.1；对应于野生型hsv-1基因组(genbank:jq673480.1)的nt103527-nt104999)已被缺失；重组病毒ovn-dul55基因组中，ul55基因(genbank:afe62884.1；对应于野生型hsv-1基因组(genbank:jq673480.1)的nt115418-nt115978)已被缺失；重组病毒ovn-dus2基因组中，us2基因(genbank:afe62890.1；对应于野生型hsv-1基因组(genbank:jq673480.1)的nt133911-nt134786)已被缺失；重组病毒ovn-dlat基因组中，lat基因(对应于野生型hsv-1基因组(genbank:jq673480.1)的nt4781-nt7062)已被缺失；并且，重组病毒ovn-dnf基因组中，核苷酸片段(nf)(对应于野生型hsv-1基因组(genbank:jq673480.1)的nt5853-nt7485)已被缺失。
[0286]
另外，也可使用crispr技术，例如通过设计特异性sgrna引物，并使用可商购获得的lenticrispr v2载体(addgene)，将重组病毒ovn基因组中的非必需基因ul41、ul43、ul48、ul55、us2、lat或nf分别删除。
[0287]
关于非必需基因ul41、ul43、ul48、ul55、us2、lat和nf的信息，还提供于表4中。
[0288]
表4.非必需基因的信息
[0289]
基因名称genbank no.基因组中的位置seq id no:ul41(vhs)afe62869.1nt91088-nt9255717ul43afe62871.1nt94721-nt9596818ul48(vmw65)afe62876.1nt103527-nt10499919ul55afe62884.1nt115418-nt11597820us2afe62890.1nt133911-nt13478621lat来自jq673480.1nt4781-nt706222
核苷酸片段(nf)来自jq673480.1nt5853-nt748523
[0290]
以5-7.5
×
106个细胞/板的密度，将状态良好、处于对数生长期的肿瘤细胞(u-2os细胞)接种于6cm培养板中。随后，以moi＝0.01的感染复数，用重组病毒ovn、ovn-dul41、ovn-dul43、ovn-dul48、ovn-dul55、ovn-dus2、ovn-dlat或ovn-dnf分别感染培养的细胞。感染60h后，参照实施例1中描述的方案，测定上述重组病毒的病毒滴度。每组实验均设置3孔重复，实验结果为3次独立实验的平均值。实验结果如图18所示。
[0291]
图18显示了以moi＝0.01的感染复数用病毒ovn、ovn-dul41、ovn-dul43、ovn-dul48、ovn-dul55、ovn-dus2、ovn-dlat或ovn-dnf分别感染u-2os细胞60h后的病毒滴度。图18的结果显示，在感染u-2os细胞后，病毒ovn、ovn-dul55、ovn-dus2、ovn-dlat和ovn-dnf均以高水平复制：感染60h后，它们的病毒滴度均在1.01-1.18
×
108pfu/ml之间，为108pfu/ml量级；而病毒ovn-dul43、ovn-dul41和ovn-dul48均以低水平复制：感染60h后，它们的病毒滴度均低于107pfu/ml，为104至106pfu/ml量级。这些重组病毒的病毒滴度还提供于表5中。
[0292]
表5：重组病毒感染u-2os细胞60h后的病毒滴度
[0293][0294][0295]
这些结果表明，病毒ovn、ovn-dul55、ovn-dus2、ovn-dlat和ovn-dnf能够在肿瘤细胞(例如u-2os细胞)中以高水平复制；而病毒ovn-dul43、ovn-dul41和ovn-dul48在肿瘤细胞(例如u-2os细胞)中的复制能力则显著下降。例如，在u-2os细胞中，与病毒ovn相比，病毒ovn-dul41、ovn-dul43和ovn-dul48的复制能力分别下降约561倍、55倍和3
×
103倍。
[0296]
另外，还以moi＝0.5的感染复数，用重组病毒ovn、ovn-dul41、ovn-dul43、ovn-dul48、ovn-dul55、ovn-dus2、ovn-dlat或ovn-dnf分别感染培养的正常细胞(l-o2细胞)或肿瘤细胞(u-2os细胞)。感染72h后，测定细胞的存活率。每组实验均设置3孔重复，实验结果为3次独立实验的平均值。实验结果如图19所示。
[0297]
图19显示了以moi＝0.5的感染复数用病毒ovn、ovn-dul41、ovn-dul43、ovn-dul48、ovn-dul55、ovn-dus2、ovn-dlat或ovn-dnf分别感染正常细胞(l-o2细胞；图19a)或肿瘤细胞(u-2os细胞；图19b)72h后的细胞存活率。
[0298]
图19a的结果显示，在感染72h后，病毒ovn-dul41和ovh-dul48对l-o2细胞的杀伤率分别为约17.67％和14.33％；二者对l-o2细胞的杀伤能力强于病毒ovn。病毒ovn-dul43、ovn-dul55、ovn-dus2、ovn-dlat或ovn-dnf对l-o2细胞的杀伤率均在8.33％-11.00％之间，与病毒ovn无显著差异。
[0299]
图19b的结果显示，在感染72h后，病毒ovn、ovn-dul55、ovn-dus2、ovn-dlat和ovn-dnf均能100％杀伤u-2os细胞(即，对肿瘤细胞均具有极强的杀伤能力)。病毒ovn-dul41、ovn-dul43和ovn-dul48杀伤u-2os细胞的能力则显著减弱。
[0300]
这些重组病毒对l-o2和u-2os细胞的杀伤率还提供于表6中。
[0301]
表6：重组病毒对l-o2细胞和u-2os细胞的杀伤率
[0302][0303][0304]
这些结果表明，与病毒ovn类似，病毒ovn-dul55、ovn-dus2、ovn-dlat和ovn-dnf对正常细胞(例如l-o2细胞)仅具有非常有限的杀伤活性，而对肿瘤细胞(例如u-2os细胞)具有极高的杀伤活性；这表明，这四株重组病毒与病毒ovn的效果相当。与病毒ovn相比，病毒ovn-dul41和ovh-dul48不仅对正常细胞(例如l-o2细胞)的杀伤能力增强，而且对肿瘤细胞(例如u-2os细胞)的杀伤能力显著下降；这表明这两株重组病毒对正常细胞的毒性增大，抑瘤活性降低。与病毒ovn相比，病毒ovn-dul43对正常细胞(例如l-o2细胞)的杀伤活性虽然没有显著增强，但是对肿瘤细胞(例如u-2os细胞)的杀伤活性显著下降。
[0305]
具体而言，在正常细胞中，与病毒ovn相比，病毒ovn-dul41、ovn-dul43和ovh-dul48的杀伤能力分别提高约7.67％、1.00％和4.33％。在肿瘤细胞中，与病毒ovn相比，病毒ovn-dul41、ovn-dul43和ovh-dul48的杀伤能力分别降低约75.13％、51.80％和67.46％。
[0306]
以上实验结果表明，在本发明的重组hsv病毒中，可对除了ul41、ul43和ul48之外的非必需基因(例如，ul55、us2、lat和nf)进行进一步的改造，例如在其中引入功能丧失性突变或将其缺失。
[0307]
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。