动脉粥样硬化血浆外泌体miRNA标志物组、获取方法及其应用

本发明涉及生物检测，具体来说是一种动脉粥样硬化血浆外泌体mirna标志物组、获取方法及其应用。

背景技术：

1、动脉粥样硬化(as)对冠心病疾病作用有很大，如果及时发现和干预动脉粥样硬化可降低冠心病发生概率，一定程度上减轻患者冠心病症状。李晓伟等(microrna-34a-5p参与硫酸吲哚酚促动脉粥样硬化的作用机制研究[d].南华大学,2019)的研究，在as发生的过程中有一定的规律可循，首先由各种因素引起血管内皮细胞受到创伤，低密度脂蛋白就聚集在内皮细胞间隙，从而导致内皮细胞产生趋化因子，进而使单核细胞、血管平滑肌细胞出现于内膜中，分别形成巨噬细胞源性泡沫细胞和平滑肌源性泡沫细胞，大量的泡沫细胞聚集后逐渐形成纤维斑块，这些泡沫细胞会在各种因素下裂解死亡形成粥样斑块。

2、现有技术在诊断动脉粥样硬化疾病的过程存在许多实际的困难，如血脂代谢异常、冠状动脉造影、ct血管造影和磁共振血管显像是目前我们常用的诊断方法，但这些方法还不成熟，多数存在着不足，不能够有效地诊断动脉粥样硬化疾病，并且对人体有一定的伤害，所以亟需寻找一种操作简洁、没有伤害和大部分人易接受的动脉粥样硬化诊断方法。

3、mirnas是首次在秀丽隐杆线虫(elegans)中发现，mirna是约22个核苷酸的单链小rna分子，内源性非蛋白质编码。耿春晖等(microrna作为动脉粥样硬化的诊断生物标志物的研究进展[j].心血管病学进展,2019,40(07):996-999)研究，在转录后水平基因调控中，mirnas具有非常特殊的作用，而mirna可以将特定靶mirna的相应区域进行去核，然后与之相互作用，导致mirna的降解或表达抑制，并且mirna在外周血中稳定存在，mirna具有高灵敏度、特异和无创性。

4、mirna在疾病生物标志物方面做出重要贡献，温佳新等(血浆外泌体mirna作为早期肺腺癌诊断标记物研究[d].中国人民解放军医学院,2019)研究，mirna对动脉粥样硬化发生发展的各个过程都扮演着极其重要角色作用，特别是在目前研究心血管疾病和动脉粥样硬化生物学过程。如谢勇等(基于氧化应激探讨大株红景天胶囊改善ldlr-/-小鼠动脉粥样硬化的作用及机制[d].南京中医药大学,2019)研究，mir-126、mir-210参与动脉粥样硬化发生初始的内皮细胞活化；杜文丽等(基于illumina hiseq2500测序技术对高温胁迫下苦瓜叶片转录组特性分析[j].分子植物育种,2019,17(02):377-387)研究，mir-21、mir-143、mir-145、mir-29参与血管平滑肌细胞功能调节；mir-33、mir-122、mir-370参与脂质代谢的调节，也有研究发现mirna也参与动脉粥样硬化的调节。但对于mirnas作为as诊断生物标志物仍有待进一步研究。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于如何提供一种动脉粥样硬化血浆外泌体mirna标志物组，并将其应用在动脉粥样硬化诊断试剂盒中，为as的无创性诊断提供新的途径。

2、本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

3、本发明第一方面提供一种动脉粥样硬化血浆外泌体mirna标志物组，包括mmu-mir-378d、mmu-mir-181b-5p、mmu-mir-146a-5p、mmu-mir-421-3p、mmu-mir-350-3p、mmu-mir-184-3p中的一种或多种。

4、有益效果：本技术利用高通量mirna测序技术，检测正常小鼠和动脉粥样硬化小鼠血浆外泌体中显著变化的mirnas，并利用生物信息学软件target scan、miranda和rnahybrid对mirnas进行靶基因预测，再用go和kegg方法进一步分析预测结果的交集，得到mmu-mir-378d、mmu-mir-181b-5p、mmu-mir-146a-5p、mmu-mir-421-3p、mmu-mir-350-3p、mmu-mir-184-3p具有显著的差异性表达；还采用基于taqman的qrt-pcr方法，证实了上述差异性显著mirnas与高通量测序结果具有良好的一致性，表明本技术的动脉粥样硬化血浆外泌体mirna标志物组可以作为as的很有前途的诊断生物标记物。

5、优选的，所述mmu-mir-378d、mmu-mir-181b-5p、mmu-mir-146a-5p、mmu-mir-421-3p、mmu-mir-350-3p、mmu-mir-184-3p在测序过程中，反转录成cdna的核苷酸序列分别如seq id no:1、seq id no:6、seq id no:11、seq id no:16、seq id no:21、seq id no:26所示。

6、本发明第二方面提供一种获取上述动脉粥样硬化血浆外泌体mirna标志物组的方法，包括以下步骤：

7、s1、获取样本：通过高脂肪喂养ldlr-/-小鼠引发动脉粥样硬化；

8、s2、分离外泌体：分别抽取正常ldlr-/-小鼠与脉粥样硬化ldlr-/-小鼠的血液，冷藏保存并离心除去细胞和碎屑，使用外泌体试剂盒提取血浆样品中的外泌体；

9、s3、提取总mirna：利用mirna提取试剂盒提取外泌体中的总mirna；

10、s4、筛选显著差异的mirnas:对提取的总mirnas进行分类，并采用高通量测序技术检测显著变化的mirnas。

11、优选的，利用生物信息学软件target scan、miranda和rna hybrid对步骤s4中提取的总mirnas的靶基因预测，并将预测结果交集的mirna与步骤s4中检测的显著变化mirnas作对比。

12、优选的，采用go和kegg方法分析上述三种生物信息学软件预测结果交集的mirna与as生理和病理过程的相关途径及潜在功能。

13、有益效果：三种生物信息学软件预测结果交集mirna与步骤s4中检测的显著变化mirnas一致；采用go和kegg方法分析预测结果交集发现，焦点粘附和ras信号通路可能与as的生理和病理密切相关，预测结果交集mirna可以作为诊断as的无创生物标志物。

14、优选的，采用基于taqman的qrt-pcr方法，以u6snrna为内参基因，采用cdna合成试剂盒对mirna标志物组进行逆转录，并与对步骤s4中检测的显著变化mirnas进行比较，以此评价mirna标志物组表达的显著性差异。

15、有益效果：采用基于taqman的qrt-pcr方法，证实mirnas，mmu-mir-378d、mmu-mir-181b-5p、mmu-mir-146a-5p、mmu-mir-421-3p、mmu-mir-350-3p、mmu-mir-184-3p的表达具有显著性差异，且与高通量测序结果具有良好的一致性，表明动脉粥样硬化血浆外泌体mirna标志物组可作为诊断as的无创生物标志物。

16、本发明第三方面提供一种上述mirna标志物组在动脉粥样硬化诊断试剂盒中的应用。

17、优选的，所述试剂盒包括针对mmu-mir-378d、mmu-mir-181b-5p、mmu-mir-146a-5p、mmu-mir-421-3p、mmu-mir-350-3p、mmu-mir-184-3p的特异性引物、探针。

18、优选的，所述特异性引物包括反转录引物、上游引物、下游引物。

19、优选的，所述mmu-mir-378d的反转录引物、上游引物、下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4所示。

20、优选的，所述mmu-mir-181b-5p的反转录引物、上游引物、下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9所示。

21、优选的，所述mmu-mir-146a-5p的反转录引物、上游引物、下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14所示。

22、优选的，所述mmu-mir-421-3p的反转录引物、上游引物、下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19所示。

23、优选的，所述mmu-mir-350-3p的反转录引物、上游引物、下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24所示。

24、优选的，所述mmu-mir-184-3p的反转录引物、上游引物、下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29所示。

25、优选的，所述mmu-mir-378d、mmu-mir-181b-5p、mmu-mir-146a-5p、mmu-mir-421-3p、mmu-mir-350-3p、mmu-mir-184-3p的探针的核苷酸序列分别如seq id no:5、seq idno:10、seq id no:15、seq id no:20、seq id no:25、seq id no:30所示。

26、有益效果：通过taqman的qrt-pcr方法，并利用mmu-mir-378d、mmu-mir-181b-5p、mmu-mir-146a-5p、mmu-mir-421-3p、mmu-mir-350-3p和mmu-mir-184-3p对应的引物和探针，对这6种mirna的表达水平进行检测，以此诊断动脉粥样硬化。

27、本发明的优点在于：

28、1.本技术利用高通量mirna测序技术，检测正常小鼠和动脉粥样硬化小鼠血浆外泌体中显著变化的mirnas，并利用生物信息学软件target scan、miranda和rna hybrid 对mirnas进行靶基因预测，再用go和kegg方法进一步分析预测结果的交集，得到mmu-mir-378d、mmu-mir-181b-5p、mmu-mir-146a-5p、mmu-mir-421-3p、mmu-mir-350-3p、mmu-mir-184-3p具有显著的差异性表达；还采用基于taqman的qrt-pcr方法，证实了上述差异性显著mirnas与高通量测序结果具有良好的一致性，表明本技术的动脉粥样硬化血浆外泌体mirna标志物组可以作为as的很有前途的诊断生物标记物。

29、2.本技术中三种生物信息学软件预测结果交集mirna与步骤s4中检测的显著变化mirnas一致；采用go和kegg方法分析预测结果交集发现，焦点粘附和ras信号通路可能与as的生理和病理密切相关，预测结果交集mirna可以作为诊断as的无创生物标志物。

30、3.本技术采用基于taqman的qrt-pcr方法，证实mirnas，mmu-mir-378d、mmu-mir-181b-5p、mmu-mir-146a-5p、mmu-mir-421-3p、mmu-mir-350-3p、mmu-mir-184-3p的表达具有显著性差异，且与高通量测序结果具有良好的一致性，表明动脉粥样硬化血浆外泌体mirna标志物组可作为诊断as的无创生物标志物。

31、4.本技术通过taqman的qrt-pcr方法，并利用mmu-mir-378d、mmu-mir-181b-5p、mmu-mir-146a-5p、mmu-mir-421-3p、mmu-mir-350-3p和mmu-mir-184-3p对应的引物和探针，对这6种mirna的表达水平进行检测，以此诊断动脉粥样硬化。