一种棘白菌素B的提取、纯化方法与流程

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种棘白菌素b的提取、纯化方法。

背景技术：

1、近年来，真菌感染疾病的发病率显著升高，每年可导致数千万人感染，已经成为危害公共卫生安全的重要隐患之一，尤其是深部真菌感染的发病率和病死率逐年增加。

2、棘白菌素(echinocandin)类药物是近年来新上市的一种抗真菌药物，该类抗生素通过非竞争性作用抑制真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性，不经过肝代谢和肾清除，抗菌谱广、活性强、不良反应率低，被广泛应用于抗真菌领域，由于其独特的作用靶点和确切的疗效，已经成为临床首选。

3、目前，国外棘白菌素b的制备方法普遍工艺参在一定缺点，主要方法为：有机溶剂提取棘白菌素类化合物，萃取除去部分杂质，活性炭脱色，利用吸附剂进行吸附，最后经过解析、浓缩、沉淀得到棘白菌素类化合物。但上述方法存在问题，一是萃取中溶剂的使用量大，若直接排放造成环境污染压力大，若进行溶剂回收又会增大生产成本；二是使用的吸附剂价格贵，再生困难，使用寿命有限，不利于扩大生产；三是提取过程中使用了氯仿之类的危险化学溶剂，对人体及环境的影响较大，存在安全隐患。

4、国内也对棘白菌素的制备工艺进行了大量研究。专利cn200910133117.6采用菌体甲醇浸泡、大孔吸附树脂吸附洗脱、氧化铝柱除色素的制备方法；cn201110244359.x发酵菌体经甲醇或乙醇浸泡、滤液经大孔吸附树脂吸附解吸、活性炭脱色、乙酸乙酯萃取、丙酮重结晶的制备方法；cn201210066411.1使用膜过滤及原位浸提方法，在微滤膜中进行原位浸提过滤，滤液再经过纳滤浓缩的制备方法。在实际生产中发现，但上述方法也存在诸多问题，如工艺需反复蒸干复溶，操作复杂，而且反复加热容易导致产品降解产生过多杂质，以及进行的多次转移可能造成物料损失；如制备工艺中萃取剂选用的有机溶剂不当，萃取过程容易形成乳化层，降低萃取效率，不利于后续溶剂回收；纯化过程使用的有机溶剂对滤膜产生的溶胀作用较大，不利于有效成成分截留，缩短设备使用寿命；浓缩后加水析出进行固液分离时，产品粘度较大，工业化放大时操作困难等问题。

5、基于此，开发出一种适合工业化生产、生产成本低、环境污染小、产品收率和纯度高的棘白菌素b制备方法对于满足实际工业需求具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术不足，本发明提供了一种棘白菌素b的提取、纯化方法，经过实验证实，通过本方法提取、纯化得到的棘白菌素b，杂质含量低，产品纯度高，生产成本低，工艺步骤简单，整体操作过程环境污染小，适合工业化生产。

2、本发明采用有机溶剂萃取、大孔吸附树脂吸附纯化棘白菌素b，脱色、除杂效果明显，制得的棘白菌素b中的色素和柄曲霉素几乎完全被去除，有效的降低了后续处理难度；析晶采用盐析，减少了棘白菌素b的损失，产品的收率大于89.4％；经过纯化，棘白菌素b纯度大于98.0％。

3、具体的，所述棘白菌素b提取、纯化的方法包括下列步骤：

4、(1)将低分子醇溶液加入棘白菌素b发酵液，混匀；

5、(2)加入活性炭吸附，过滤得滤液；

6、(3)滤液加水稀释后过大孔吸附树脂，用低分子醇溶液洗脱，收集洗脱液；

7、(4)洗脱液静置析晶，过滤得滤饼，干燥得棘白菌素b粗品。

8、其中，所述步骤(1)中所述的低分子醇是甲醇、乙醇、丙醇中的一种或任意2种或3种的组合，加入的低分子醇体积为原发酵液体积的50％-80％。

9、步骤(2)具体还包括加入助滤剂增强除杂效果的步骤：加入活性炭吸附，再加入助滤剂后过滤得滤液。

10、优选的，步骤(2)加入的活性炭为发酵液体积的1％-3％，即g/100ml。

11、优选的，步骤(2)加入的助滤剂为硅藻土、珍珠岩、纤维素、氧化镁、石膏、酸性白土中的一种或几种。

12、进一步优选的，步骤(2)加入的助滤剂量为5-10g/l。

13、步骤(3)中所述大孔吸附树脂是指ads-17或x-5；优选的，所述的步骤3)滤液加水稀释至低分子醇浓度为10％-30％。

14、步骤(4)收集液浓缩至1-1.6倍柱体积，25-35℃干燥。

15、此外，为进一步提升本发明的技术效果，是棘白菌素的收率、纯度显著提升，本发明所述提取、纯化方法还可以包含以下步骤：

16、(5)加低分子醇溶解棘白菌素b粗品，溶解液过反相树脂柱，用低分子醇溶液洗脱，收集收集洗脱液；

17、(6)洗脱液加入氯化钠溶液，析晶，过滤，干燥，得棘白菌素b纯品。

18、即，本发明所述的提取、纯化方法为：

19、(1)将低分子醇溶液加入棘白菌素b发酵液，充分搅拌；

20、(2)加入活性炭吸附剂脱色除杂，再加入助滤剂后过滤得滤液；

21、(3)滤液加水稀释后过大孔吸附树脂，用低分子醇溶液洗脱，收集富含棘白菌素b的溶液；

22、(4)收集液浓缩，加入氯化钠溶液，2-8℃下析晶，过滤，干燥得棘白菌素b粗品；

23、(5)加低分子醇溶解棘白菌素b粗品，过滤，滤液过反相树脂柱，用低分子醇溶液洗脱，收集富含棘白菌素b的溶液；

24、(6)收集液浓缩，加入氯化钠溶液，0-8℃下析晶，过滤，干燥得棘白菌素b纯品。

25、通过上述优选的技术方案，本发明的技术效果优于其他技术方案，收率、纯度大大提升，满足工业大生产需求。

26、优选的，步骤(5)所述的反相树脂柱是xt30树脂柱；

27、步骤(6)收集液浓缩至出现析晶，滤饼干燥10-14小时。

28、进一步的，对本发明技术方案描述如下：

29、(1)将低分子醇溶液加入棘白菌素b发酵液(与发酵液体积比0.5-0.8:1)，充分搅拌后，静置2小时；

30、(2)加入活性炭吸附剂脱色除杂(活性炭比例0.25％-1％)，再加入助滤剂(助滤剂5-10g/l)后过滤得滤液；

31、(3)滤液加水稀释后过大孔吸附树脂，用低分子醇溶液洗脱，收集富含棘白菌素b的溶液；

32、(4)收集液浓缩后，加入氯化钠溶液，放在2-8℃环境中析晶，并过滤得滤饼，干燥(25-35℃)得棘白菌素b粗品；

33、(5)加低分子醇溶解棘白菌素b粗品，过滤，滤液过反相树脂柱，用低分子醇溶液洗脱，收集富含棘白菌素b的溶液；

34、(6)收集液浓缩后，加入氯化钠溶液，放在0-8℃环境析晶，过滤得滤饼，干燥(25-35℃、10-14小时)后得棘白菌素b纯品，纯度大于98.9％；

35、具体的，本发明步骤(1)中使用低分子醇选用甲醇、乙醇、丙醇中的一种或几种，优选乙醇。

36、本发明步骤(2)中选用助滤剂硅藻土、珍珠岩、纤维素、氧化镁、石膏、酸性白土中的一种，优选珍珠岩作为助滤剂。

37、本发明步骤(3)滤液过大孔吸附树脂前要稀释，稀释至乙醇浓度10％-30％。

38、本发明步骤(4)收集液浓缩，浓缩至1倍柱体积。

39、本发明步骤(6)收集液浓缩，浓缩至出现析晶。

40、相对于现有技术，本发明技术方案优势明显：

41、(1)工艺操作简单，提取、纯化路线短，产品收率高、纯度高，适用于工业大生产。

42、(2)操作过程用到的溶剂种类少，使用溶剂量少，且整个过程涉及到的有机溶剂均为低毒性，后续处理较为简便，环保压力小。

43、(3)本发明浓缩过程无需采用高温环境，避免了加热浓缩时温度偏高而产生新杂质问题，保证了产品纯度。

44、(4)本发明针对棘白菌素生产过程中的柄曲霉素进行了有效监控，制备的部分产品中并未检测到柄曲霉素。