一种原代上皮细胞的制备方法

1.本发明涉及一种生物材料的制备方法，具体地说，涉及一种原代上 皮细胞的制备方法。


背景技术：

2.上皮组织在体内扮演着重要的屏障保护作用，同时对组织再生起到 关键作用，因此成为生物医学研究的热点。体外培养的上皮细胞和上皮 类器官在药物毒性研究、个性化疗法、组织工程中有着广泛的应用 (driehuis,e.kretzschmar,k.clevers,h.establishment ofpatient-derived cancer organoids for drug-screening applications. nat protoc 2020；15(10):3380-3409)。原代上皮细胞的获取是构建 上皮体外培养模型的第一步，也是关键一环。现阶段对于牙龈上皮细胞 的提取主要分为两种技术路线，其一是组织块法，其二是酶消化法 (ska,a.nogowska,a.sikorska,m,et al,isolation andculture of human primary keratinocytes-a methods review.expdermatol 2019；28(2):107-112)。组织块法对细胞造成的附带伤害小， 但获取细胞的效率偏低(需要较长的时间才能获得足量的细胞)且容易 引入成纤维细胞污染；此外组织块法无法分离获得单个原代上皮细胞， 因此无法用于类器官模型的构建。近年来酶消化法已成为主流的上皮细 胞获取方法。酶消化法的核心是破坏上皮细胞间连接，进而将单个上皮 细胞从上皮组织中分离。目前研究中酶消化法多采用胰蛋白酶对组织进 行解离，但相较于其他组织，上皮组织的细胞间连接更难以破坏，因此 分离获得足量上皮细胞所需的时间相较其他组织细胞更长(hybbinette, s.m.lindberg.enzymatic dissociation of keratinocytesfrom human skin biopsies for in vitro cell propagation.expdermatol 1999；8(1):30-8)。另一方面，鉴于胰蛋白酶具有很强的消 化特性，长时间的消化会对细胞活性、形态、干性和其他生物学特性造 成影响，进而影响后续的培养体系建立(chen,r.h.zhu,j.zhang,etal.,the tolerance of human epidermal cells to trypsinization invitro.cell tissue bank 2020；21(2):257-264)。目前文献报道的 上皮细胞二维培养体系构建大多仍采用胰蛋白酶消化法，而类器官培养 体系的构建部分采用了胶原酶(driehuis,e.kretzschmar,k.clevers, h.establishment of patient-derived cancer organoids fordrug-screening applications.nat protoc 2020；15(10):3380-3409)。 后者的消化强度相较胰蛋白酶弱，因此可以减小消化过程中对细胞造成 的损伤；但同时由于消化效率偏低，无法在短时间内获取大量细胞，仅 适用于分离少量细胞的实验。总而言之，目前尚缺乏既可用于获取大量 细胞用于二维培养，又可最大限度减少对细胞干性损伤用于类器官构建 的消化手段。因此，改进原代细胞的获取方法对于构建体外培养的上皮 细胞体系尤为重要。
3.公开号为cn 106978391 a的中国发明专利申请公开了一种家禽胫骨 生长板软骨原代细胞分离培养方法。其中采用iv型胶原酶和透明质酸酶 结合消化获得软骨原代细胞，并使用含有胎牛血清、青霉素-链霉素以及 维生素c的高糖dmem/f12培养基生长。
4.上述方法针对上皮细胞获取及培养主要存在以下问题：该方法中采 用的iv型胶原酶特异性针对髓系细胞和骨/软骨组织具有较为特异的消 化作用，对于上皮组织的消化缺乏特异性；iv型胶原酶与透明质酸酶的 浓度均为80-100mg/ml。该浓度对于上皮组织的消化而言明显偏高，不利 于维持上皮细胞的活性、干性以及其他生物学特性；采用含有血清的dmem 培养基培养，该培养基在上皮细胞培养中容易引起成纤维细胞污染。
5.公开号为cn 110643572 a的中国发明专利申请公开了一种脐带间充 质干细胞的分离培养方法。其中采用中性蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶 ii和dna酶混合消化液分离获取脐带间充质干细胞，并采用含有 fgf-basic和hgf生长因子的无血清间充质干细胞培养基生长。
6.上述方法针对上皮细胞获取及培养主要存在以下问题：采用的中性 蛋白酶对于间充质细胞具有较为特异的消化作用，但对于上皮组织的消 化特异性较差；采用的dna酶对于上皮组织的消化缺乏特异性，对于提 高消化效率没有显著意义；而且会加剧对于原代细胞活性及干性的破坏； 采用的ii型胶原酶特异性针对间充质来源细胞具有较为特异的消化作 用，对于上皮组织的消化缺乏特异性；采用的间充质干细胞培养基以及 fgf-basic生长因子对于上皮细胞的培养缺乏特异性，并且容易引起成纤 维细胞污染。
7.公开号为cn 113249317 a的中国发明专利申请公开了一种脐带间充 质干细胞的分离培养扩增方法。其中采用iv型胶原酶、透明质酸酶、dna 酶和2％血清替代物的平衡盐溶液作为消化液分离获得脐带间充质干细 胞，并采用间充质干细胞无血清培养基生长。
8.上述方法针对上皮细胞获取及培养主要存在以下问题：采用的dna 酶对于上皮组织的消化缺乏特异性，对于提高消化效率没有显著意义， 而且会加剧对于原代细胞活性及干性的破坏；采用的iv型胶原酶特异性 针对间充质来源细胞具有较为特异的消化作用，对于上皮组织的消化缺 乏特异性；采用的间充质干细胞培养基对于上皮细胞的培养缺乏特异性。


技术实现要素：

9.本发明就是为了解决现有技术中无法兼顾获取效率与细胞活性、干 性维持的技术问题，提供一种原代上皮细胞的制备方法，其可保证消化 效率的同时、更大限度地保留细胞的干性和增殖性，可以兼顾细胞获取 效率与细胞生物学特性的维持。
10.为此，本发明提供一种原代上皮细胞分离培养方法，包括如下步骤： 包括如下步骤：(1)上皮层组织的制备：将上皮组织用含有双抗的d-hanks 液冲洗，放入中性蛋白酶ii中消化；取出上皮组织，剥离粘膜下层，获 得上皮层组织；(2)上皮层组织的消化：将所述步骤(1)获得的上皮层 组织，用含有双抗的d-hanks液冲洗3遍，切分为大小1mm2的组织块， 而后放入胶原酶i型和透明质酸酶的混合消化液中消化；(3)细胞培养 体系的构建：向所述步骤(2)中的混合消化液中加入含有胎牛血清的dmem 培养基，经过滤后，离心，弃去上清液，d-pbs重悬沉淀后再次离心，得 到沉淀物；将沉淀物使用角化细胞培养基重悬，培养，获得原代上皮细 胞。
11.所述步骤(1)中，含有双抗的d-hanks液是指：能够清除可能残留 在上皮组织块表面的少量细菌等污染物。所述中性蛋白酶ii的作用在于 特异性破坏上皮层组织与上皮下层之间的桥粒蛋白连接体，有效分离获 得上皮层组织，避免因上皮下层分离不彻底导致培
养过程中引入成纤维 细胞污染。
12.步骤(2)中含有双抗的d-hanks液是指：通过冲洗去除上皮组织表 面残留的微量中性蛋白酶消化液，同时再次起到清除组织表面可能残留 的微量污染物的作用。所述步骤(2)中，采用了i型胶原酶与透明质酸 酶混合的消化液对上皮组织进行消化，消化时长4小时。采用i型胶原 酶是由于相比其他类型的胶原酶，i型胶原酶对于消化上皮组织具有较强 的特异性。以往研究中使用i型胶原酶的情形大多为需要获取少量细胞 的实验，单独使用胶原酶消化的效率偏低，因而将透明质酸酶与胶原酶 混合使用可以提高消化的效率。
13.所述步骤(3)中，先使用含有胎牛血清的dmem培养基抑制消化酶 的作用，并同时起到稀释消化液的效果；离心后再次使用d-pbs重悬是 考虑到胎牛血清对于胶原酶和透明质酸酶的抑制作用不显著，第一次离 心后可能残余少量消化酶，会对后续培养的细胞造成损伤；再次重悬后 d-pbs起到了进一步稀释残留消化酶的作用，离心再次重悬后剩余微量的 消化酶对于细胞的损伤可以忽略。
14.优选的，所述步骤(1)中，将上皮组织用含有双抗的d-hanks液冲 洗3遍，放入2.5mg/ml的中性蛋白酶ii溶液中，4℃消化8小时；取出 上皮组织，使用眼科镊剥离粘膜下层，保留上皮层组织；
15.优选的，所述步骤(2)中，用含有双抗的d-hanks液冲洗上皮层组 织3次，使用手术刀将上皮层组织分割为1x1mm2的组织块，而后放入 2mg/ml胶原酶i型与1mg/ml透明质酸酶的混合消化液中，37℃消化0.5～ 4小时，期间每半小时使用移液枪吹打1次。
16.优选的，所述步骤(3)中，向消化液中加入含有胎牛血清的dmem 培养基，移液枪充分吹打，经100μm细胞滤网过滤后离心5分钟，弃去 上清液，d-pbs重悬沉淀后再次离心5分钟，沉淀使用角化细胞培养基重 悬，接种于孔板上进行细胞培养。
17.优选的，所述步骤(3)中，所述角化细胞培养基使用如下成份制成： dmem/f12培养基、表皮生长因子egf添加剂、胰岛素、转铁蛋白、hepes 缓冲液、glutamax溶液、青霉素-链霉素溶液。
18.优选的，所述步骤(3)中，所述角化细胞培养基使用如下浓度的成 份制成：dmem/f12培养基、50ng/ml表皮生长因子egf添加剂、5μg/ml 胰岛素、5μg/ml转铁蛋白、10mmolml hepes缓冲液、1x glutamax溶 液、15mg/ml青霉素-链霉素溶液。
19.本发明具有以下有益效果：
20.(1)本发明通过将胶原酶i型与透明质酸酶结合，显著提高了消化 效率，获取的原代上皮细胞总数相较胰蛋白酶消化法高出68.42
±
3.54％， 活细胞数量相较胰蛋白酶消化法高出98.22
±
9.92％，活细胞占比相较胰 蛋白酶消化法高出17.59
±
4.04％；
21.(2)通过本发明中的消化方法获取的大鼠牙龈上皮细胞总细胞数以 及活细胞数相较传统的胰蛋白酶消化法分别高出113.67
±
21.36％， 303.47
±
28.75％；活细胞占比高出18.99
±
2.76％；
22.(3)通过本发明中的消化方法获取的大鼠食管上皮细胞总细胞数以 及活细胞数相较传统的胰蛋白酶消化法分别高出120.14
±
2.07％， 186.54
±
3.29％；活细胞占比高出30.45
±
0.79％；
23.(4)通过本发明中的消化方法获取的大鼠舌上皮细胞总细胞数以及 活细胞数相较传统的胰蛋白酶消化法分别高出52.44
±
14.21％， 134.61
±
20.45％；活细胞占比高出
53.85
±
10.84％；
24.(5)通过本发明中的消化方法获取的大鼠泌尿道上皮细胞总细胞数 以及活细胞数相较传统的胰蛋白酶消化法分别高出226.73
±
16.86％， 303.47
±
28.75％；活细胞占比高出23.16
±
2.76％；
25.(6)通过本发明中的消化方法获取的大鼠鼠尾上皮细胞总细胞数无 显著性差异，活细胞数及活细胞占比相较传统的胰蛋白酶消化法分别高 出27.76
±
15.08％，30.77
±
5.71％；
26.(7)本发明通过采用相对温和的消化方法，降低了消化酶对伪足等 细胞表面结构的破坏，获取的原代上皮细胞贴壁培养后细胞铺展范围相 较胰蛋白酶消化法更大，伪足伸展更加明显；
27.(8)本发明通过采用相对温和和的消化方法，降低了消化过程中对 细胞干性造成的损伤，获取的牙龈原代上皮细胞在消化后即刻ck-19阳 性和ki-67阳性的干细胞占比相较胰蛋白酶消化法分别高出 81.53
±
10.51％，40.31
±
0.72％；获取的鼠尾上皮细胞在消化后即刻pcna 阳性和ki-67阳性的干细胞占比相较胰蛋白酶消化法分别高出 25.99
±
3.70％，24.70
±
3.60％；
28.(9)本发明通过采用相对温和和的消化方法，降低了消化过程中对 细胞干性造成的损伤，获取的原代上皮细胞相比胰蛋白酶获取的细胞在 贴壁培养第3天ck-19阳性细胞荧光强度相较胰蛋白酶消化组高出 127.44
±
38.63％，ki-67阳性细胞荧光强度相较胰蛋白酶消化组高出 84.50
±
16.71％；贴壁培养第9天ck-19阳性细胞荧光强度相较胰蛋白酶 消化组高出102.51
±
22.13％，ki-67阳性细胞荧光强度相较胰蛋白酶消 化组高出119.12
±
33.97％；
29.(10)通过采用相对温和和的消化方法，获取的原代上皮细胞可以 在体外培养稳定传代至第三代。
附图说明
30.图1a和图1b是本研究中对比2mg/ml胶原酶i型单独消化与2mg/ml 胶原酶i型和1mg/ml透明质酸酶混合消化在相同时间(4小时)内消化 人牙龈上皮组织获得的原代细胞中活细胞数量(图1a)以及活细胞占比 (图1b)；
31.图2a、图2b和图2c是本研究中对比0.25％胰蛋白酶-edta消化液(作 用0.5小时和4小时)与2mg/ml胶原酶i型和1mg/ml透明质酸酶混合 消化液(作用0.5小时和4小时)消化人的牙龈上皮组织获得的原代细 胞中总细胞数(图2a)、活细胞数(图2b)以及活细胞占比(图2c)；
32.图3a、图3b和图3c是本研究中对比0.25％胰蛋白酶-edta消化液(作 用0.5小时)与2mg/ml胶原酶i型和1mg/ml透明质酸酶混合消化液(作 用2小时)消化人的牙龈上皮组织获得的原代细胞中总细胞数(图3a)、 活细胞数(图3b)以及活细胞占比(图3c)；
33.图4a、图4b和图4c是本研究中对比0.25％胰蛋白酶-edta消化液(作 用0.5小时)与2mg/ml胶原酶i型和1mg/ml透明质酸酶混合消化液(作 用4小时)消化大鼠的舌上皮获得的原代细胞中总细胞数(图4a)、活细 胞数(图4b)以及活细胞占比(图4c)；
34.图5a、图5b和图5c是本研究中对比0.25％胰蛋白酶-edta消化液 (作用0.5小时)
与2mg/ml胶原酶i型和1mg/ml透明质酸酶混合消化 液(作用4小时)消化大鼠的食管上皮组织获得的原代细胞中总细胞数 (图5a)、活细胞数(图5b)以及活细胞占比(图5c)；
35.图6a、图6b和图6c是本研究中对比0.25％胰蛋白酶-edta消化液 (作用0.5小时)与2mg/ml胶原酶i型和1mg/ml透明质酸酶混合消化 液(作用4小时)消化大鼠的牙龈上皮组织获得的原代细胞中总细胞数 (图6a)、活细胞数(图6b)以及活细胞占比(图6c)；
36.图7a、图7b和图7c是本研究中对比0.25％胰蛋白酶-edta消化液 (作用0.5小时)与2mg/ml胶原酶i型和1mg/ml透明质酸酶混合消化 液(作用4小时)消化大鼠的泌尿道上皮组织获得的原代细胞中总细胞 数(图7a)、活细胞数(图7b)以及活细胞占比(图7c)；
37.图8a、图8b和图8c是本研究中对比0.25％胰蛋白酶-edta消化液 (作用0.5小时)与2mg/ml胶原酶i型和1mg/ml透明质酸酶混合消化 液(作用4小时)消化大鼠的鼠尾上皮组织获得的原代细胞中总细胞数 (图8a)、活细胞数(图8b)以及活细胞占比(图8c)；
38.图9a、图9b和图9c是本研究中对比0.25％胰蛋白酶-edta消化液 (作用0.5小时)与2mg/ml胶原酶i型和1mg/ml透明质酸酶混合消化 液(作用4小时)消化人的牙龈上皮组织获得的原代细胞贴壁培养后第3 天(图9a)和第9天(图9b)光学显微镜下形态差异以及贴壁第6天扫 描电镜下形态差异(图9c)；
39.图10a、图10b、图10c和图10d是本研究中对比0.25％胰蛋白酶
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edta消化液(作用0.5小时)与2mg/ml胶原酶i型和1mg/ml透明质酸 酶混合消化液(作用4小时)消化人的牙龈上皮组织获得的原代细胞流 式细胞分析ki-67阳性细胞占比差异(图10a、图10b)与ck-19阳性细 胞占比差异(图10c、图10d)；
40.图11a、图11b是本研究中对比0.25％胰蛋白酶-edta消化液作用0.5 小时(图11a)与2mg/ml胶原酶i型和1mg/ml透明质酸酶混合消化液作 用4小时(图11b)消化大鼠的鼠尾上皮组织获得的原代细胞中ki-17阳 性以及pcna阳性细胞占比流式分析；图11c以柱状图形式对比了两种消 化方法获得的原代细胞中ki-67阳性细胞占比；图11d以柱状图形式对 比了两种消化方法获得的原代细胞中pcna阳性细胞占比；
41.图12a、图12b是本研究中对比0.25％胰蛋白酶-edta消化液(作用 0.5小时)与2mg/ml胶原酶i型和1mg/ml透明质酸酶混合消化液(作用 4小时)消化人的牙龈上皮组织获得的原代细胞贴壁培养第3天(图12a) 和9天(图12b)固定后经免疫荧光染色观察，ki-67阳性以及ck-19阳 性细胞荧光强度差异；
42.图13a、图13b是本研究中经2mg/ml胶原酶i型和1mg/ml透明质 酸酶混合消化液消化4小时获得的原代细胞经3次传代后p1代与p3代 细胞光学显微镜(图13a)以及扫描电子显微镜下(图13b)形态。
具体实施方式
43.下面结合实施例对本发明做进一步描述。
44.本发明中，步骤(1)中中性蛋白酶的制备方法为将冻干粉状态的中 性蛋白酶ii溶解于含有10mm naac(ph 7.5)和5mm caac的缓冲液中， 制备成10mg/ml的储存液，-80℃保存；使用时4℃溶解储存液，使用含 有10mm naac(ph 7.5)和5mm caac的缓冲液稀释到2.5mg/ml。
45.步骤(2)中消化液制备方法为将4mg/ml一型胶原酶与等体积的2mg/l 透明质酸酶
的混合，4℃保存，全程避光操作，消化液避光保存。
46.实施例1
47.(1)上皮组织的获取与保存：本发明中的大鼠上皮组织可取自死后 1小时内的spf级sd大鼠的食管、表皮、舌、泌尿道上皮组织。例如北 京大学口腔医学院spf级动物实验室；人的牙龈上皮组织可取自临床牙 周手术废弃的牙龈上皮组织。
48.将获得的上皮组织使用生理盐水冲去表面血迹后，4℃保存于含有 10μmol/l y-27632,5％青霉素-链霉素双抗的dmem/f12培养基中；上皮 组织确保在2小时内开始下一步的分离。
49.(2)上皮细胞的消化：通过中性蛋白酶ii型4℃消化8小时分离上 皮层与上皮下层组织；将分离获得的上皮层组织使用手术刀切分成1x1mm2大小的组织块，平均分成2组分别放入0.25％胰蛋白酶消化液或等体积的 2mg/ml胶原酶i型+1mg/ml透明质酸酶混合消化液中；胰蛋白酶消化30 分钟，胶原酶i型+透明质酸酶混合消化液消化4小时；达到各自消化时 间后胰蛋白酶组加入2倍体积的含有10％胎牛血清dmem培养基终止消化， 100μm细胞滤网过滤后离心5分钟；胶原酶i型+透明质酸酶混合消化液 组经100μm细胞滤网过滤后离心5分钟，弃去上清液，d-pbs重悬沉淀 后再次离心5分钟；
50.(3)上皮细胞的接种培养：弃去离心后的上清液，细胞沉淀使用培 养基重悬，接种于细胞培养板中；细胞培养孔板置于，置于温度37℃、 饱和湿度、体积分数为5％的co2培养箱中进行培养。
51.实施例2
52.选取步骤(2)中获得的人牙龈上皮细胞沉淀，使用角化细胞培养基 重悬，吸取20μl与等体积台盼蓝染液混合，加入载玻片中放入自动细 胞计数仪统计总细胞数、活细胞数和活细胞比率；
53.通过新方法获取的人牙龈原代上皮细胞总细胞数量、活细胞数量以 及或细胞占比均显著高于胰蛋白酶消化法获得的细胞。
54.实施例3
55.选取步骤(2)中获得的大鼠硬腭牙龈上皮细胞沉淀，使用角化细胞 培养基重悬，吸取20μl与等体积台盼蓝染液混合，加入载玻片中放入 自动细胞计数仪统计总细胞数、活细胞数和活细胞比率；
56.通过新方法获取的大鼠硬腭牙龈原代上皮细胞总细胞数量、活细胞 数量以及或细胞占比均显著高于胰蛋白酶消化法获得的细胞。
57.实施例4
58.选取步骤(2)中获得的大鼠舌上皮细胞沉淀，使用角化细胞培养基 重悬，吸取20μl与等体积台盼蓝染液混合，加入载玻片中放入自动细 胞计数仪统计总细胞数、活细胞数和活细胞比率；
59.通过新方法获取的大鼠舌原代上皮细胞总细胞数量、活细胞数量以 及或细胞占比均显著高于胰蛋白酶消化法获得的细胞。
60.实施例5
61.选取步骤(2)中获得的大鼠食管上皮细胞沉淀，使用角化细胞培养 基重悬，吸取20μl与等体积台盼蓝染液混合，加入载玻片中放入自动 细胞计数仪统计总细胞数、活细胞
数和活细胞比率；
62.通过新方法获取的大鼠食管原代上皮细胞总细胞数量、活细胞数量 以及或细胞占比均显著高于胰蛋白酶消化法获得的细胞。
63.实施例6
64.选取步骤(2)中获得的大鼠泌尿道上皮细胞沉淀，使用角化细胞培 养基重悬，吸取20μl与等体积台盼蓝染液混合，加入载玻片中放入自 动细胞计数仪统计总细胞数、活细胞数和活细胞比率；
65.通过新方法获取的泌尿道原代上皮细胞总细胞数量、活细胞数量以 及或细胞占比均显著高于胰蛋白酶消化法获得的细胞。
66.实施例7
67.选取步骤(2)中获得的大鼠尾部表皮细胞沉淀，使用角化细胞培养 基重悬，吸取20μl与等体积台盼蓝染液混合，加入载玻片中放入自动 细胞计数仪统计总细胞数、活细胞数和活细胞比率；
68.通过新方法获取的大鼠鼠尾原代上皮活细胞数量以及或细胞占比均 显著高于胰蛋白酶消化法获得的细胞。
69.实施例8
70.选取步骤(2)中获得的大鼠尾部表皮细胞沉淀，使用角化细胞培养 基重悬，经多聚甲醛固定、triton打孔、bsa封闭、一抗及二抗染色后 流式细胞仪分析ki-67及pcna阳性细胞占比。
71.实施例9
72.选取步骤(2)中获得的牙龈上皮细胞悬液，经多聚甲醛固定，triton 打孔，bsa封闭，一抗染色及二抗染色后将细胞经流式细胞仪分析ck-19 和ki-67阳性的细胞占比。
73.实施例10
74.选取步骤(3)中接种于孔板的牙龈上皮细胞，于培养的第3天和第 9天使用多聚甲醛固定，triton打孔，bsa封闭，一抗染色及二抗染色后 经免疫荧光检测ck-19阳性和ki-67阳性细胞中荧光强度的差异。
75.实施例11
76.选取步骤(3)中接种于孔板的牙龈上皮细胞，于培养的第6天固定， 扫描电子显微镜检测细胞伪足伸展等细微结构；于培养的第3天和第9 天光学显微镜观察细胞形态。
77.实施例12
78.选取步骤(3)中接种于孔板的牙龈上皮细胞，5天后第一次换液， 而后每2天换液直至原代上皮细胞达到80％的细胞汇合率；
79.使用0.125％胰蛋白酶-edta消化并按照1:3的比例传代培养，连续 培养3代；
80.选取培养第1代和第3代细胞汇合率达到80％的细胞光学显微镜及扫 描电子显微镜观察形体结构；
81.通过新方法获取的表皮原代上皮细胞总细胞数量、活细胞数量以及 或细胞占比均显著高于胰蛋白酶消化法获得的细胞。
82.惟以上所述者，仅为本发明的具体实施例而已，当不能以此限定本 发明实施的范围，故其等同组件的置换，或依本发明专利保护范围所作 的等同变化与修改，皆应仍属本
发明权利要求书涵盖之范畴。