一种大肠杆菌及利用其高效合成骨化二醇的方法与流程

本发明属于合成领域，具体涉及一种大肠杆菌及利用其高效合成骨化二醇的方法。

背景技术：

1、维生素d是一种激素原，本身无活性，需在体内转化为活性维生素d才能发挥其生物学效应。活性维生素d包括25-羟基维生素d3、1,25-二羟基维生素d3和1-羟基维生素d3，其中，25-羟基维生素d3又名骨化二醇(结构式如下)，具有较强的生理活性，在临床上主要用于治疗骨紊乱、代谢性骨疾病等，尤其适合肾功能正常而肝功能丧失不全的患者使用。

2、

3、目前，骨化二醇的生产方法主要为化学合成法和生物发酵法。其中，化学合成法的步骤较多、分离纯化工艺复杂且生产成本相对较高。而生物发酵法制备骨化二醇具有反应条件温和、成本低廉等优点。

4、cn113736680a提供了一种涉及自养假诺卡氏菌g-5h1发酵制备骨化二醇和/或骨化三醇的发酵方法。该发明通过对自养假诺卡氏菌，保藏号cgmcc 4.1211，名称为pseudonocardiaautotrophica的原始菌株进行基于紫外诱变和核糖体工程诱变的菌种进化，筛选获得一种新的、高产的自养假诺卡氏菌g-5h1，通过以维生素d3为底物，优化发酵条件，发酵4天后，骨化二醇的产量可达525mg/l。此方法发酵反应时间长，且骨化二醇的产量相对较低，不利于工业化生产。

5、cn113493756a为申请人于2020年4月3日申请的一件涉及骨化二醇和/或骨化三醇的基因工程菌，该基因工程菌为在细胞中表达cyp基因、铁氧还原蛋白基因、铁氧还原蛋白还原酶基因和脱氢酶基因的大肠杆菌工程菌。100ml反应体系中加入2g kxrg03菌泥，通过分批次加入底物维生素d3至终浓度为7.5g/l，催化反应7h后，骨化二醇的产量可达5.9g/l。

6、cn102482687b中公开过使用β-环糊精来合成骨化二醇，但转化率并不高，并且反应时间比较长。cn102660618b中公开了使用甲基-β-环糊精发酵制备骨化二醇的方法，该方法的最高收率为57％。

技术实现思路

1、本发明为了克服现有技术中骨化二醇转化率或产量不高的缺陷，提供一种大肠杆菌及利用其高效合成骨化二醇的方法。

2、为了克服上述缺陷，本发明第一方面提供一种大肠杆菌(escherichia coli)，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc m2022985。

3、本发明第二方面提供一种微生物菌体，通过培养如本发明第一方面所述的大肠杆菌获得。优选地，所述的培养使用的培养基为lb培养基或tb培养基。

4、在一些实施例中，在培养中添加诱导剂，使其表达内源性酶。

5、优选地，培养1-3h后，添加阿拉伯糖进行一次诱导；再培养至od600为1.5-2.5时添加诱导剂进行二次诱导，所述二次诱导的诱导剂包括5-氨基乙酰丙酸、fecl3和iptg。

6、更优选地，培养2h后，添加阿拉伯糖进行一次诱导，阿拉伯糖浓度为2g/l；再培养至od600为2时添加诱导剂进行二次诱导，所述二次诱导的诱导剂包括160mg/l的5-氨基乙酰丙酸、80mg/l的fecl3和0.1mm的iptg。

7、在某一具体实施例中，所述大肠杆菌的粗酶液的制备方法为：

8、(1)将如本发明第一方面所述的大肠杆菌培养1-3h例如2h后加入终浓度1-3g/l例如2g/l的阿拉伯糖，再培养至od600为1.5-2.5例如2左右时，加入诱导剂诱导培养18-26h例如22h，获得培养液；所述诱导剂为140-180mg/l例如160mg/l的5-氨基乙酰丙酸(ala)、60-100mg/l例如80mg/l的fecl3和0.1-0.3mm例如0.1mm的iptg；

9、(2)将上述培养液于5000-7000rpm例如6000rpm离心10-20min例如15min，去上清收集湿菌体；

10、(3)将所述湿菌体使用pbs缓冲液按照0.05-2g/ml例如0.1g/ml进行悬浮后500-800bar例如500bar、4℃下均质1-3min例如1min后8000-14000rpm例如12000rpm离心5-10min例如5min，即得。

11、本发明第三方面提供一种合成骨化二醇的方法，在反应体系中，利用如本发明第二方面所述的微生物菌体催化底物vd3发生反应，即得所述骨化二醇。

12、优选地，所述反应体系中还包括缓冲液、辅酶和辅酶再生体系。

13、更优选地，所述微生物菌体以菌体的粗酶液、纯酶或纯酶液的形式存在，例如以粗酶液的形式存在。

14、在一些实施例中，所述底物vd3溶解于含有助溶剂的乙醇或甲醇溶剂中。

15、较佳地，所述助溶剂为羟丙基-β-丙环糊精和/或甲基-β-环糊精，优选为甲基-β-环糊精。

16、更佳地，所述助溶剂的添加量为10-30g/l，优选为20g/l。

17、在一些实施例中，在反应体系中，所述底物vd3的终浓度为4-9g/l，优选为4-7g/l；和/或，所述缓冲液为pbs缓冲液，和/或，所述微生物菌体与底物vd3的质量比为1:1～2.5:1。

18、在一些实施例中，所述辅酶为氧化型辅酶，例如nad(p)+；所述辅酶再生体系为醇脱氢酶和异丙醇、葡萄糖脱氢酶和葡萄糖、甲酸脱氢酶和甲酸盐中的一种。

19、较佳地，所述辅酶为nad+，所述辅酶再生体系为葡萄糖脱氢酶和葡萄糖。

20、更佳地，所述葡萄糖脱氢酶来源于枯草芽胞杆菌(bacillus subtilis)168，ncbi登录号为np_388275.1，所述葡萄糖脱氢酶优选以菌体、粗酶液、纯酶或纯酶液的形式存在。

21、进一步更佳地，所述葡萄糖与底物vd3的摩尔比为5:1～1:1，优选为3:1；

22、和/或，所述辅酶和底物vd3的摩尔比为1:5～1:1000，优选为1:10；

23、和/或，所述葡萄糖脱氢酶的菌体与葡萄糖的质量比为1:5～1:12，更优选地为1:7；

24、和/或，所述微生物菌体的粗酶液和葡萄糖脱氢酶的酶液的体积比为10:1。

25、在某一具体实施例中，所述微生物菌体的粗酶液的酶活为100-115u/ml，例如为107u/ml。

26、在一些实施例中，所述反应体系的温度为25-33℃，优选为30℃；和/或，

27、所述反应体系的ph为7.0-7.8，优选为7.4。

28、较佳地，所述ph通过缓冲液来维持，例如pbs缓冲液。

29、本发明第四方面提供一种试剂盒，其包括如本发明第一方面所述的大肠杆菌。

30、优选地，其还包括选自甲基-β-环糊精、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶或生产其的菌株、底物vd3、乙醇或甲醇、nad(p)+、nad(p)h和pbs缓冲液中的一种或多种。

31、本发明第五方面提供如本发明第一方面所述的大肠杆菌或本发明第四方面所述的试剂盒在合成骨化二醇或制备合成骨化二醇的试剂中的应用。

32、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

33、本发明所用试剂和原料均市售可得。

34、本发明的积极进步效果在于：本发明提供了一种新的生产骨化二醇的大肠杆菌，利用本发明提供的菌株合成骨化二醇可以提高底物vd3的摩尔转化率及骨化二醇的产量。在某一实施例中，转化率可以达到98％，在另一实施例中，产量可达6.49g/l。

35、生物材料保藏信息

36、本发明的大肠杆菌(escherichia coli)cais213，已于2022年6月27日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址：中国湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编：430072，保藏编号为：cctcc m2022985，培养物名称是大肠杆菌(escherichia coli)cais213，分类命名是大肠杆菌(escherichia coli)。