一种浒苔来源的微藻发酵营养补充剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于藻类应用技术领域，具体涉及一种浒苔来源的微藻发酵营养补充剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.浒苔(uiva)是目前在我国黄海引起绿潮的主要原因，其环境适应和繁殖能力较强，藻体易漂浮在海面上，对养殖业造成经济损失，其开发利用亟需解决。浒苔干粉中蛋白质含量大于8％、多糖大于40％，还含有钙、磷、镁、铁、铜等无机元素，营养丰富。但其藻体中含有大量纤维中空结构，难以溶解和直接利用，应用范围有限。
3.藻油是食品营养补充剂dha的主要来源，dha是一种重要的ω-3 系多不饱和脂肪酸,具有重要的生理活性,在医药、保健品、功能性食品等方面有广泛应用。目前高产dha藻株包括裂殖壶藻(schizochytrium)、破囊壶菌(thraustochytrids)、隐甲藻(crypthecodinium cohnii)等。其中裂殖壶藻生长速度快、周期短，是目前藻油生产的主要菌株。
4.但裂殖壶藻发酵工艺需要高糖低氮，目前主要使用的碳源是葡萄糖，发酵过程中藻细胞可以将可溶性还原糖的转换生成油脂。裂殖壶藻发酵过程中还需要各种微量元素和维生素，如硫酸镁、磷酸盐、铁、钙、铜等物质。而且，在发酵过程中需要使用复合氮源，如蛋白胨、酵母粉来补充营业，导致制备藻油的成本较高。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是提供一种浒苔来源的微藻发酵营养补充剂及其制备方法和应用，从而弥补现有技术的不足。
6.本发明首先提供一种浒苔来源的微藻发酵营养补充剂的发酵方法，是将浒苔使用蛋白酶进行酶解；酶解产物进行灭菌后，使用芽孢杆菌进行发酵，发酵后的上清液进行干燥获得所制备的营养补充剂；
7.更进一步的，所述的酶解，其中蛋白酶选用能够破坏浒苔纤维结构、软化藻体的蛋白酶；
8.作为实施例的一种具体记载，所述的蛋白酶为纤维素酶、葡聚糖酶、碱性蛋白酶、硫酸酯酶中的任一种或几种。
9.所述的酶解，作为实施例的一种具体记载，酶解温度为45-60℃。
10.更进一步，所述的芽孢杆菌是芽孢杆菌(bacillus sp.)ny-r8株，其于2022年06月02日保藏在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no.m2022782。
11.所述的发酵，作为实施例的具体记载，发酵的温度是在30℃发酵。
12.本发明再一个方面还提供所述方法制备的微藻发酵营养补充剂；
13.本发明还提供所述的微藻发酵营养补充剂在发酵制备裂殖壶藻藻油中的应用；
14.本发明还提供一种用于裂殖壶藻发酵的培养基，所述的培养基中包含有上述的营
养补充剂；
15.作为优选，所述的营养补充剂添加量为1-3％(g/ml)，最佳添加量是1％。
16.本发明还提供一种发酵制备包含有dha的藻油的方法，是将裂殖壶藻接种到添加有营养补充剂的培养基中进行发酵。
17.本发明提供一种绿藻来源的微藻发酵补充剂，其来源于浒苔提取物，其成本低，可溶性好，蛋白质和多糖含量高，且含有对植物生长发育有显著作用的微量植物激素物质。本发明中的微藻发酵补充剂，可以用于藻油dha发酵。将能够发酵生产dha的裂殖壶藻接种至发酵培养基中进行发酵培养，在发酵培养基中加入该发酵补充剂，可以有效提高裂殖壶藻细胞浓度和藻油产量。
附图说明
18.图1：本发明筛选的芽孢杆菌(bacillus sp.)ny-r8株的培养照片图；
19.图2：发酵液中生长素iaa(上图)和脱落酸aba(下图)的含量图；
20.图3：发酵过程中菌体干重的变化图；
21.图4：浒苔发酵营养补充剂对藻油dha产量的影响图。
具体实施方式
22.本发明再筛选获得一株能够有效的酶解浒苔的芽孢杆菌的基础上，筛选建立了一种从浒苔来源的营养补充剂，能够高效的培养裂殖壶藻。
23.下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
24.实施例1：筛选能够降解浒苔的菌株
25.从近海海岸腐烂的-浒苔进行微生物富集、初筛、复筛后获得能够高效的对浒苔发酵制备获得包含有可溶性蛋白、可溶性多糖等可溶性营养物质的菌株。
26.具体的筛选方法如下：
27.无菌条件下取待筛选的浒苔，加入无菌海水稀释，接入50ml海生细菌液体培养基中富集培养(每升培养基中含有蛋白胨5.0g,酵母粉1.0g,柠檬酸铁0.1g，氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙1.8g，氯化钾0.55g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶0.034g，硼酸0.022g，硅酸钠0.004g，氟化钠0.0024g，硝酸铵0.0016g，磷酸氢二钠0.008g)ph值7.6，20-25℃培养40-72小时。
28.富集两次后，菌株培养的富集液接种至浒苔水解液中定向培养，其中浒苔水解液是将新鲜浒苔与适量水1:1混合后，再加入纤维素酶、葡聚糖酶和果胶酶水解酶水解过夜，得到浒苔糊，115℃灭菌30分钟制备的；菌株培养的富集液体接种到浒苔水解液中培养72h，温度30℃，获得富集培养菌液。
29.将富集培养菌液稀释后涂布于海生细菌培养基(2216e培养基)平板上，在30℃培养2天，挑取单菌落纯化培养。
30.将挑取的单菌落进行二次筛选，接种至浒苔水解液中，30℃培养72 小时后，取发酵液8000rpm离心5min，使用德国sartorius赛多利斯水分测定仪ma37-1cn检测样品含水量，计算固含量。
31.最终筛选获得了一个菌株，该菌株接种到浒苔水解液中，经过36 小时培养后，能
够将浒苔水解液中的物质转化为可溶物质的能力最高，上清固含量达到5.05％。
32.将菌株在30℃条件下培养过夜，取1ml菌液，使用tiaamp bacteriadna kit提取基因组。以基因组为模板，采用16s全长通用引物序列(8f： aga gtt tga tcc tgg ctc ag；1492r：ggt tac ctt gtt acg act t) 对该筛选的菌株进行16s扩增，扩增体系：50μl(模板0.5μl，上下游引物各0.5μl，taq酶0.5μl，buffer 2.5μl，双蒸水补足体积)。经过16s序列比对确定该菌属于bacillus sp.。
33.对菌株进行革兰氏染色，为革兰氏阳性菌。在lb培养基上，培养 24h，菌落乳白色，扁平粗糙，易挑起，正反面颜色均一。该菌为兼性厌氧，能分解葡萄糖并利用其产酸不产气，不利用乳糖。
34.所筛选的芽孢杆菌(bacillus sp.)ny-r8株于2022年06月02日保藏在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno.m2022782。
35.实施例2：制备浒苔发酵营养补充剂
36.取新鲜浒苔1kg，或浒苔干粉100g加适量水混合至1kg，再加入含有水解酶的100ml溶液，混合均匀，在适合的温度下水解1-4h，得到软化的浒苔糊。
37.水解酶可以选择纤维素酶、葡聚糖酶、碱性蛋白酶、硫酸酯酶其中的一种或几种，酶解解温度45-60℃。本实施例中选择葡聚糖酶和中性蛋白酶，酶活比例为1:5。
38.先将5g酶粉溶解于水中，混匀，再喷洒到1kg浸湿浒苔中，在50℃进行水解，水解过程需要不断搅拌。水解时间一般为1-4小时，形成糊状，视浒苔原料情况可以延长时间。
39.将酶解后的浒苔糊在115℃下高温灭酶灭菌30min，冷却至室温，分别接入本发明筛选的芽孢杆菌bacillus sp.ny-r8和标准菌atcc 10716 芽孢杆菌进行发酵，摇床内30℃发酵36h后，离心得到上清液，对发酵液中的成分进行测定。
40.成分测定具体包含：
41.1)蛋白质含量测定：取1ml样品，离心1min，取0.5ml上清加2.5ml 考马斯亮蓝g-250染液，充分混匀，5min后在595nm波长处测定蛋白质含量。
42.2)还原糖含量测定：取1ml样品，离心1min，取0.2ml上清加0.3ml 水，加1mldns，煮沸5分钟，定容至25ml，在520nm下，测还原糖。
43.3)固形物含量测定：使用赛多利斯烘干仪(ma37-1cn)烘干测定。
44.浒苔经过酶解再经芽孢杆菌发酵后，上清液中可溶解还原糖、可溶性蛋白质含量和固含量都比发酵前大幅提高(表1)。
45.表1：浒苔发酵前后可溶解还原糖、可溶性蛋白质含量和固含量表
[0046][0047]
4)生长因子测定：取上清，用柠檬酸调节ph到6.4，过pvp柱过滤吸附，用柠檬酸磷酸缓冲液洗柱，收集滤液。继续使用柠檬酸调节ph 到2.8，加入等体积的乙酸乙酯萃取3次
并合并萃取液，减压蒸馏浓缩备用。
[0048]
经过检测，发酵液中还含有生长因子，在发酵液中，生长素(iaa)含量为1.73μg/ml，脱落酸(aba)含量为0.48μg/ml。
[0049]
根据之前的报告(刘雪梅,赵鹏,徐继林,骆其君,王秀娟,陈海敏,严小军.lc-ms同时测定大型海藻中9个植物激素.药物分析杂志,2012,32(10):1747-1752。)浒苔藻体中的生长素(iaa)、脱落酸(aba)比厚膜藻、角叉菜、羊栖菜、鼠尾藻等低许多，在检测限内很难检到，使用本方法可以将浒苔彻底破壁，将生长激素释放在上清溶液中。
[0050]
实施例3：浒苔发酵营养补充剂对裂殖壶藻生长发酵的影响
[0051]
裂殖壶藻发酵培养基的组分如下：葡萄糖15％，硫酸铵1.65％，氯化钠12.5％，硫酸镁2.5％，磷酸二氢钾2.5％，氯化钾0.5％，氯化钙0.1％， ph为7.0(使用2m koh调节)。
[0052]
在原发酵培养基的基础上，添加浒苔发酵营养补充剂培养裂殖壶藻。实验方案如下：原培养基为对照，分别添加补充剂1％，2％，3％。培养周期，培养条件：50ml培养基添加到500ml三角瓶中，转速：200rpm，温度28℃，接种量10％，ph6.5-7.0。
[0053]
菌体干重测定：发酵结束后，收集发酵液，5000rpm*15min，弃上清，纯水洗涤2次后，置于干燥器中低温40℃干燥至菌重不再变化。菌体干重(％)＝烘干菌体的重量/发酵液体积*100％。
[0054]
脂肪酸组成：发酵结束后，收集发酵液，调节ph到8.0，使用碱性脂肪酶在50℃破壁8h后，升温到80℃灭酶。离心去除菌体沉淀，上清用等体积正己烷萃取油脂，连续萃取3次，收集萃取液。旋转蒸发浓缩获得油脂。计算油脂含量(每升发酵液中提取油脂的质量)。使用安捷伦6890气象色谱仪，db-wax型毛细管柱(30m*0.25μm，0.25μm)，程序升温，载气为氮气，fid检测器，流速1ml/min，检测脂肪酸组成比例。
[0055]
通过发酵过程中菌体干重变化情况可以看出，添加各种浓度的营养补充剂都可以提高菌体干重，有显著的促生长作用。当添加量为1％时，促生长作用较为稳定，最终菌体干重能达到73g/l(图3)。检测该发酵条件下的脂肪酸组成情况，藻油中dha含量达到57％(图4)。