双效功能菌株WL及其在铜绿微囊藻控制与微囊藻毒素降解中的应用

本发明属于蓝藻的污染治理领域，涉及双效功能菌株wl及其在铜绿微囊藻控制与微囊藻毒素降解中的应用。

背景技术：

1、蓝藻是生长在水体表面和底部的生物，这些生物的大量繁殖可以在水体表面上形成蓝藻水华。由于难闻的气味及其有毒的蓝藻毒素，蓝藻水华已经成为一个严重的全球环境问题。大量繁殖的蓝藻通过阻挡阳光破坏水生生态系统，并消耗氧气。铜绿微囊藻形成的蓝藻水华现象在世界范围内具有普遍性、广泛性，并因其能够产生并释放出有毒的微囊藻毒素，给水生生物和人类健康的安全带来重大危害。微囊藻毒素是一类具有生物活性的环状七肽化合物，也是分布最广泛的肝毒素。微囊藻毒素能够抑制蛋白磷酸酶(pp1和pp2a)，诱导真核生物的氧化应激反应。2011年，根据世界卫生组织的要求，饮用水中微囊藻毒素(microcystin-lr，简称mc-lr)含量的阈值为1μg/l。微囊藻毒素具有稳定性和严重的毒性，对全球的生态系统和人类健康构成严重威胁。因此，控制铜绿微囊藻水华的形成，抑制微囊藻毒素的积累应该受到全球环境工作者的高度重视。

2、近年来，已经有不少研究工作者针对铜绿微囊藻分离了大量的溶藻细菌，以控制铜绿微囊藻的生长；也有部分研究工作者分离出了微囊藻毒素的降解菌株。然而，到目前为止，对能够抑制铜绿微囊藻生长，同时又可以降解微囊藻毒素的双效功能菌株的研究比较有限，这也限制了细菌在铜绿微囊藻水华污染及其微囊藻毒素污染治理中的应用。

技术实现思路

1、本发明目的是解决现有技术中存在的上述问题，提供双效功能菌株wl及其筛选方法，以及在铜绿微囊藻控制和微囊藻毒素mc-lr降解中的应用。所述菌株wl对铜绿微囊藻具有较强的溶藻作用，对微囊藻毒素mc-lr具有较强的降解作用。

2、本发明的技术方案

3、本发明首先提供了一株对铜绿微囊藻具有溶藻效果，同时对微囊藻毒素mc-lr具有降解效果的双效功能菌株wl。该菌株已于2022年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为cgmcc 24976，建议分类命名为deinococcus sp.。

4、本发明从富营养化的三峡水库支流-香溪河水体中筛选、分离并纯化出一株异常球菌 wl，经16s rdna序列对比分析鉴定，该菌株分类于异常球菌属(deinococcus sp.)。该菌株为双效功能菌株，不仅可以对铜绿微囊藻具有溶藻效果，还可以降解微囊藻毒素 mc-lr。

5、所述的双效功能菌株wl为革兰氏阳性，菌落形态为圆形，橙色，光滑半透明，边缘整齐，较粘稠，易挑起。在扫描电子显微镜下为杆状，直径为2μm左右。

6、所述的双效功能菌株wl的16s rdna序列如序列表seq id no.1所示。

7、本发明同时提供了所述双效功能菌株wl的筛选方法，所述筛选方法包括以下具体步骤：

8、(1)水样采集于湖北省宜昌市富营养化的香溪河，深度约1米左右。将水样经30μm的滤纸进行过滤，以去除较大的颗粒物，收集过滤液。

9、(2)将5ml经过滤的水样加入到45ml无菌的超纯水中，并在30℃条件下摇匀，转速设为120转/分钟。30分钟后，静置15分钟。

10、(3)取上清液1ml接种到9ml含有微囊藻毒素(mc-lr)的无机盐培养基(msm) 培养瓶中，使mc-lr标准品的最终浓度为25mg/ml。

11、(4)将mc-lr作为细菌生长的唯一碳源和氮源，在恒温摇床30℃条件下对细菌进行培养，转速设置为120转/分钟。

12、(5)连续培养120小时后，用10mm的磷酸缓冲液pbs对样本进行梯度稀释。即吸取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的样本稀释液，分别接种到营养肉汤(nb)的固体平板中，进行稀释涂布。

13、(6)将涂布好的固体平板置于恒温培养箱中进行培养72～120小时，温度设置为30℃。

14、(7)观察恒温培养箱中的固体平板，将长有细菌群落的平板进行细菌分离与纯化。即挑取单菌到新的nb固体平板上，并进行划线、分离与培养，反复此步骤，直至获取纯化的单菌。

15、(8)对以上步骤(7)获得的单菌，利用nb液体培养基在恒温摇床30℃条件下培养24小时，转速设置为120转/分钟。

16、(9)对上述步骤(8)单菌培养液进行dna提取，pcr扩增，然后进行16s rdna 测序，对获得的序列在美国国家生物技术信息中心(ncbi)数据库网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)中进行序列比对，鉴定该菌株为异常球菌deinococcus sp.strain wl。

17、所述步骤(3)中的无机盐培养基msm成分为：七水硫酸镁1.0g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾4.0g，氯化钠1.0g，氯化钙0.02g,硫酸铁0.005g,四水氯化锰0.005g,氯化锌0.005g,氯化铜0.0005g，溶于1000ml超纯水，ph值用氢氧化钠或盐酸调节至7.0左右。

18、所述步骤(5)中的营养肉汤(nb)的培养基成分为：每升nb培养基需要蛋白胨 10g，牛肉浸粉3g，氯化钠5g，ph值用氢氧化钠或盐酸调节至7.0左右。营养肉汤(nb) 的固体培养基为：每100毫升nb培养基中加入2g琼脂粉。

19、本发明还提供了双效功能菌株wl的应用，可用于控制铜绿微囊藻的生长，还可用于降解微囊藻毒素mc-lr。并且该菌株对铜绿微囊藻同时具有直接和间接的溶藻作用，即菌株wl的细菌悬浮液和无菌过滤液对铜绿微囊藻均具有较强的溶藻作用，7天后，溶藻效率分别为99.93％和70.79％。

20、本发明的优点和有益效果：

21、(1)微囊藻毒素降解菌株的筛选，主要有两种方式，一种是通过筛选微囊藻的溶藻细菌来验证该菌株对微囊藻毒素是否具有降解效果，目前已分离的绝大多数溶藻细菌不具备降解微囊藻毒素的能力；另一种是直接对微囊藻毒素的降解菌株进行筛选，选用的常见培养基为以微囊藻毒素为唯一碳源和氮源的无机盐培养基，初步筛选时微囊藻毒素浓度一般不高于5mg/ml。本发明优先地对微囊藻毒素的降解菌株进行筛选，选用的培养基为浓度为25mg/ml的微囊藻毒素为唯一碳源和氮源的无机盐培养基，提高了微囊藻毒素降解菌株筛选的成功率；然后从微囊藻毒素的降解菌株里筛选出对铜绿微囊藻具有溶藻效果的菌株，即为双效功能菌株。

22、(2)本发明的双效功能菌株wl，以较低的浓度1×105cells/ml对铜绿微囊藻(初始浓度为1×106cells/ml)具有较强的溶藻效果，溶藻效率达到97.40％，与此同时，该菌株wl对微囊藻毒素mc-lr的降解效率达到55.85％，具有较强的降解效果。

23、(3)本发明的双效功能菌株wl，根据16s rdna序列分析对比，该菌株分类于异常球菌属(deinococcus sp.)，这也是首次发现异常球菌属的细菌对铜绿微囊藻具有溶藻效果，对微囊藻毒素具有降解效果。

24、(4)本发明的双效功能菌株wl，对铜绿微囊藻同时具有直接的和间接的溶藻作用，既可以通过与藻细胞直接接触的方式直接杀死藻细胞，也可以通过分泌某种活性物质间接地杀死藻细胞，而大部分溶藻细菌是通过其中一种方式来进行溶藻活动的。

25、(5)本发明的双效功能菌株wl，来自于富营养化的三峡水库支流-香溪河，水体中具有较高的藻类生物量，在常温或温度高达40℃环境下，均可良好的生长，具有良好的环境兼容性，成本低，在铜绿微囊藻水华及其微囊藻毒素污染的治理中具有较强的应用前景。