一种耐盐且对亚甲基蓝具有强吸附容量的巨大芽孢杆菌

1.本发明涉及亚甲基蓝吸附技术领域，尤其涉及一种耐盐且对亚甲基蓝具有强吸附容量的巨大芽孢杆菌。


背景技术：

2.染料废水的处理已经是现代工农业发展中急需解决的重大问题之一，由于染料颜色鲜艳并且具有较高的吸收波长，会直接影响水中生物的光合作用，危害水体环境，并且对人类和动物的的生命安全也构成了极大的威胁。偶氮染料是染料中使用最广泛的一种，在生产和使用过程中会产生大量高盐、高碱度的染料废水，排放到水体中会造成水体色度污染，降低水体溶解氧含量与透光度，干扰水体生物正常生命活动，破坏水体生态平衡，另外其降解产物对生物也有毒害作用。亚甲基蓝是典型的偶氮染料，含有难以降解的偶氮键，微量溶于水中就可呈现明显蓝色。
3.目前，亚甲基蓝染料废水的处理方法包括化学法、物理法和生物法，其中微生物吸附法具有来源丰富、品种多样、成本低廉、对环境干扰小、实地操作性强、无毒害副物质等优点，在污染治理方面具有显著优越性。从真菌、藻类、细菌中都发现了可以吸附染料的微生物，如白腐真菌、芽孢杆菌等。
4.其中细菌具有生长周期短、生长速率高、环境适应性强、易于获取等特点，非常适用偶氮脱色；但细菌其本身易受温度、ph、盐度等条件的影响，并且存在反应时间较长、去除作用不稳定等局限性，因此我们提出一种耐盐且对亚甲基蓝具有强吸附容量的巨大芽孢杆菌。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对背景技术中存在的现有用于吸附亚甲基蓝的细菌本身易受温度、ph、盐度等条件的影响，并且存在反应时间较长、去除作用不稳定等的问题，提出一种耐盐且对亚甲基蓝具有强吸附容量的巨大芽孢杆菌。
6.本发明的技术方案：一种耐盐且对亚甲基蓝具有强吸附容量的巨大芽孢杆菌，包括巨大芽孢杆菌bacillus megaterium lm-44以及固定菌株的无机载体固定化吸附剂和固定菌株的有机载体固定化吸附剂；
7.所述巨大芽孢杆菌bacillus megaterium lm-44分离于南海深海环境，最大生长耐盐度为8％，可在含盐量为10％的环境中正常吸附亚甲基蓝。
8.优选的，所述巨大芽孢杆菌bacillus megaterium lm-44游离菌株的制备方法包括以下步骤：
9.从固体lb培养基中挑取生长良好的单个菌株于液体lb培养基中，室温下150rmp振荡培养12h，以1％接种量转接至液体lb培养基中，37℃，150rmp振荡培养12h；
10.吸取菌液离心，去除上清液，加入无菌水清洗，离心后去上清液，获得湿菌体备用。
11.优选的，游离菌株bacillus megaterium lm-44在最适条件下对100mg/l亚甲基蓝
去除率为70％，吸附500mg/l亚甲基蓝溶液时，吸附容量为153mg/g。
12.优选的，固定菌株的无机载体固定化吸附剂的载体为无机载体硅胶，固定方式为吸附，固定菌株为bacillus megaterium lm-44。
13.优选的，无机载体固定化吸附剂的固定条件为：取部分湿菌体，加入相同体积无菌水，震荡充分后加入10％载体，振荡，振荡速度为：150rmp反应2h后抽滤，用无菌生理盐水冲洗载体表面，放入50℃恒温箱烘干1h。
14.优选的，无机载体固定化吸附剂最适条件下对100mg/l亚甲基蓝去除率为98％，吸附500mg/l亚甲基蓝时最大吸附容量为192mg/g。
15.优选的，固定菌株的有机载体固定化吸附剂载体为有机载体大孔树脂750s，固定方式为吸附，固定菌株为bacillus megaterium lm-44。
16.优选的，有机载体固定化吸附剂还包括固定条件，所述固定条件为：取部分湿菌体，加入相同体积无菌水，震荡充分后加入10％载体，振荡，振荡速度为：150rmp反应2h后抽滤，用无菌生理盐水冲洗载体表面，放入50℃恒温箱烘干1h。
17.优选的，有机载体固定化吸附剂对100mg/l亚甲基蓝去除率为98％，吸附500mg/l亚甲基蓝时最大吸附容量为192mg/g，在25℃-45℃间吸附率波动不超过1％。
18.与现有技术相比，本发明具有如下有益的技术效果：
19.1、本发明中提出的bacillusmegateriumlm-4在碱性条件下吸附作用较好，适用于处理高盐、高碱的偶氮染料废水；
20.2、本发明树脂固定化吸附剂对100mg/l亚甲基蓝去除率为98％，吸附500mg/l亚甲基蓝时最大吸附容量为192mg/g。且该吸附剂在不同ph条件下吸附作用几乎不受影响，能适应实际废水中不同酸碱环境，且在25℃-45℃间吸附率波动不超过1％，对于温度有较好稳定性；
21.3、综上所述，本发明中的脱色菌株具有易获得、易于培养、生长周期短、吸附容量大、脱色效果稳定、菌株耐盐性较好的特点，固定化后对环境温度、环境ph、染料浓度稳定性显著提高。
22.与其他废水处理方法相比，具有固定方法简单、成本低廉、操作简便、利于回收、无毒害副产物的特点，可应用于吸附降解产物有毒害作用的偶氮染料，因此在染料废水领域具有广泛的应用前景。
附图说明
23.图1是bacillus megaterium lm-44生长曲线图；
24.图2是bacillus megaterium lm-44生长耐盐曲线图；
25.图3是bacillusmegaterium lm-44在不同含盐量中吸附亚甲基蓝的图；
26.图4是游离bacillus megaterium lm-44最适吸附剂浓度的图；
27.图5是硅胶固定化吸附剂最适吸附剂浓度的图；
28.图6是树脂固定化吸附剂最适吸附剂浓度的图；
29.图7是ph对吸附剂的影响图；
30.图8是时间对吸附剂的影响图；
31.图9是温度对吸附剂的影响图；
32.图10是不同亚甲基蓝浓度对吸附作用影响图；
33.图11是无机盐对吸附作用影响图。
具体实施方式
34.下文结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
35.实施例
36.如图1-11所示，本发明提出的一种耐盐且对亚甲基蓝具有强吸附容量的巨大芽孢杆菌，包括巨大芽孢杆菌bacillus megaterium lm-44以及固定菌株的无机载体固定化吸附剂和固定菌株的有机载体固定化吸附剂。
37.本实施例中bacillus megaterium lm-44筛选分离于南海深海环境样品；亚甲基蓝等均为分析纯；柱层层析硅胶(200-300目，青岛海洋化工厂分厂)；大孔树脂hpd-750s(郑州和成新材料厂)；酶标仪(infinitem200pro)；恒温摇床(广州湘西生物仪器公司)。
38.本实施例中游离菌株、无机载体固定化吸附剂和有机载体固定化吸附剂的鉴定测试包括以下方式：
39.1、菌种分离与筛选
40.取样本土壤于lb液体培养基中，150rmp、37℃恒温培养培养1.5h；吸取培养菌液于lb固体培养基中，倒置、37℃恒温培养16h。从lb平板上挑取不同形态的单个菌落至新鲜液体lb培养基中摇床培养12h(37℃、150rmp)。取菌液离心，向离心管中加入100mg/l的mb溶液，震荡使菌体充分悬浮后放入摇床中反应1h。离心后取上清液于665nm处测量吸光度。
41.2、菌株生理生化性质鉴定
42.(1)生长曲线测定：从lb平板上挑取生长良好的单个菌落至新鲜液体lb培养基中，摇床培养12h(37℃、150rmp)。(2)以1％接种量转接至新鲜液体lb培养基中，取菌液于600nm处测量0d值(间隔两小时)。(3)耐盐性测定：分别向lb培养液中加入1％-15％的nacl，以1％接种量将菌液转接至不同含盐量的液体lb培养基中，分别于4h、12h、24h、36h取菌液于600nm处测定吸光度。吸取1ml发酵菌液至离心管中低温保存，由上海生工完成16srrna测序分析。
43.3、吸附优化实验
44.(1)最适吸附剂浓度测定：mb溶液为100mg/l，游离菌株、硅胶固定化菌株和大孔树脂固定化菌株浓度分别为0.5935mg/ml-23.74mg/ml、1g/l-10g/l、1g/l-10g/l；室温、150rmp、反应1h后离心，取上清液于665nm处测量吸光度。结果如图：吸附剂对mb具有吸附作用，因此随着吸附剂投放量的增加，去除率会逐渐增加直至趋于100％，吸附剂浓度较低时，去除率随着吸附剂浓度的增加而快速增加，之后增长速率逐渐变小，而吸附容量随吸附剂浓度增加逐渐降低。在实际应用中，为降低成本，使吸附剂性能比最优化，需综合考虑去除率和吸附容量。
45.(2)ph对吸附作用的影响：用ph5.0-10.0的缓冲液溶解mb至100mg/l，以最适吸附剂浓度加入三种不同吸附剂、室温、150rmp、反应1h后离心，取上清液于665nm处测量吸光度。结果如图：ph对游离菌株、硅胶固定化菌株两种吸附剂吸附作用影响更为显著，ph值低于9时去除率随ph值降低而呈现下降趋势。三种吸附剂最佳ph分别为ph9、ph9、ph8，当ph值从最佳ph降至5时，三种吸附剂吸附率下降率分别为37％、38％、14％，大孔树脂固定化吸附
剂在不同ph条件下吸附性能比较均一，而硅胶固定化吸附剂在碱性条件下的吸附效果优于在酸性条件下的吸附效果。
46.(3)温度对吸附作用的影响：在最适吸附剂浓度、最佳ph的条件下，将三种吸附剂分别置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃恒温摇床中，150rmp震荡反应1h。游离菌株和硅胶固定化菌株吸附率随温度升高略有下降，可能是由于温度升高影响了微生物表面的活性位点，但三种吸附剂去除率波动范围不超过9％，说明温度对吸附作用影响不大，bacillusmegateriumstrainlm-44对温度适应性较好。在实际工业应用中，升高温度会需要较高成本，在温度影响不大的情况下选用接近室温操作更符合经济效益。
47.(4)时间对吸附作用的影响：在最适吸附剂浓度、最佳溶液ph、最适温度的条件下，将吸附剂投入mb溶液中150rmp震荡反应，分别于1min、5min、10min、30min、60min、120min、180min取上清液于665nm处测量吸光度。游离菌株与硅胶固定化菌株的初始吸附速率要大于大孔树脂固定化菌株，10min时前两种吸附剂进入了缓慢阶段，30min接近吸附平衡，即吸附容量达到饱和，吸附率不再随时间增加。而大孔树脂在60min进入缓慢吸附阶段，大约在3小时左右接近吸附平衡状态。
48.(5)溶液初始浓度对吸附作用的影响：在最适吸附剂浓度、最佳ph、最适时间、最适温度的条件下，将吸附剂分别投入浓度为50mg/l、100mg/l、200mg/l、300mg/l、400mg/l、500mg/l的mb溶液中150rmp震荡反应，反应结束后离心取上清液于665nm处测量吸光度。结果如图：mb初始浓度从50mg/l增至500mg/l，游离微生物平均吸附率下降了52％，硅胶和树脂固定化菌株平均吸附率分别下降23％和45％，说明在不同初始浓度时，无机载体硅胶固定化吸附剂和有机载体大孔树脂固定化吸附剂的吸附作用要优于游离菌株，其中无机载体硅胶固定化吸附剂的吸附效果最佳。
49.4、无机盐对吸附作用的影响
50.配制13种含盐量为2mm和10mm的mb溶液，最适反应条件下分别加入三种吸附剂进行吸附反应。结果如图11：一价无机盐对大孔树脂固定化菌株的吸附作用有一定影响，对游离菌株与硅胶固定化菌株影响较小。相较于两种游离菌株和硅胶固定化菌株吸附剂，大孔树脂固定化菌株作用更不稳定，说明一价无机盐可能主要影响了缓慢吸附阶段。
51.上述具体实施例仅仅是本发明的几种优选的实施例，基于本发明的技术方案和上述实施例的相关启示，本领域技术人员可以对上述具体实施例做出多种替代性的改进和组合。