一种珊瑚共附生古菌多样性的研究方法及检测试剂盒

：本发明属于微生物分子生态学检测领域，涉及一种珊瑚共附生古菌多样性的研究方法及检测试剂盒，用于环境古菌及复杂样本如珊瑚、海绵、海葵、海藻等生物共附生古菌多样性研究。

背景技术

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背景技术：

1、古菌作为最早的生命形式之一，广泛分布于各种环境或在生物体内共附生。古菌门类众多、多样性极其丰富，古菌在生物地球化学过程中至关重要，是地球上元素、物质和能量的重要驱动者。古菌是当前生物地球化学研究特点之一，其相关研究对阐明生命活动规律、揭示生命起源和物种进化、生物与生物或生境相互作用等具有重要意义。然而，由于古菌代谢机制和生长条件仍不完全清楚，迄今分离和纯培养的古菌种类并不多，相关研究受限制。纯培养古菌可以通过基因组、转录组、蛋白组、脂质组和代谢组等组学技术全面研究，对于非纯培养古菌dna相关研究主要集中在宏基因组、基因文库(高通量测序文库、克隆文库等)、指纹图谱技术如变性梯度凝胶电泳(dgge)、实时pcr(real-time pcr)、功能基因、原位研究和基于数据库的生物信息学分析等方面。虽然分子生物学技术的进步和大型数据库的建立为古菌研究提供了很多基础数据，但古菌研究仍存在诸多缺陷，如提取基因组dna的质量、设计引物的局限会漏掉某些关键门类(即使是通用引物也存在片面性)，探针的特异性，pcr产物长度和区域、克隆效率等问题。

2、珊瑚礁是地球上生物多样性和初级生产力最高的生态系统之一，造礁石珊瑚是珊瑚礁生态系统中的“框架”生物，对于维持珊瑚礁生态系统的健康稳定以及物质循环和能量流通具有决定性作用。古菌在珊瑚礁生态系统的碳、氮及硫等生物地球化学过程中具有重要生态功能(et al.2015；vanwonterghem and webster,2020；campos et al.,2022)。珊瑚共生体内，除了虫黄藻外的共附生微生物中古菌的含量因珊瑚种类而异，从1％到高达约50％(wegley et al.,2007；siboni et al.,2008；blackall et al.,2015)，是珊瑚共生体的重要功能群落。目前，由于古菌研究技术限制，导致珊瑚共附生古菌研究仅少量在古菌多样性方面(siboni et al.,2008；bourne et al.,2016)，如克隆文库、指纹图谱、探针原位研究等，由高通量测序检测到的古菌多样性比较单一且古菌占总获得序列的含量也不高(bourne et al.,2016；zhou et al.,2017；huggett and apprill,2019)。珊瑚除了珊瑚宿主外，作为共生体还包括虫黄藻、共附生微生物如细菌、古菌、真菌、微型真核生物、病毒等，组成成分复杂且难以绝对分离，因此珊瑚总dna包含占据主要含量的珊瑚和虫黄藻基因组dna、及其他共附生生物的基因组dna混合物，各类干扰较多，研究比较清晰主要是虫黄藻和细菌。

3、目前，古菌多样性研究主要在16s rdna高通量测序，已报道文库构建的引物虽多但是通用性不强，无法扩增目前大型数据库(如genbank、silva、greengene、rdp(ribosomalrna data base project)等)中所有门类古菌。古菌具有特殊的性质，古菌在遗传信息传递上与真核生物相似，在代谢过程如产能等方面则与原核生物相近。因此，在复杂样本中古菌多样性研究除了缺乏通用性强引物扩增大多数古菌外，还易受其他生物特别是真核生物基因组干扰；而常规可扩增细菌和古菌的通用引物研究珊瑚这种复杂样本最终古菌序列占比远低与细菌，无法获得真实的古菌信息。基于上述问题，需要一种特异性强且灵敏高效地检测珊瑚等复杂样本中古菌多样性的方法，以获得更高古菌覆盖率和更真实的古菌多样性信息。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明的目的是针对现有16s rdna高通量测序研究古菌多样性存在的问题，提供了一种引物通用性强且古菌信息覆盖率高的古菌多样性研究方法及快速检测试剂盒。

2、本发明提供了以下技术方案：

3、本发明的第一个目的是提供一种快速检测古菌多样性的引物组，所述引物组包括seq f1、seq f2,seq r1、seq r2，具体如下所示：

4、seq f1：5’-gcmctayggkgygcascagk-3’；如seq id no.1所示。

5、seq f2：5’-xxxxxxgymgccrcggkaahas-3’；

6、seq r1：5’-ttcggrscrtrcngacctrccg-3’；如seq id no.2所示。

7、seq r2：5’-xxxxxxnyrtactycccargyrg-3’。

8、其中，简并引物代码分别是n(a,t,c,g)，m(a,c)，y(c,t)，k(g,t)，s(g,c)，r(a,g)，w(a,t)，h(a,t,c)，b(g,t,c)。

9、优选，外围引物组包括上游引物seq f1或seq f2，下游引物seq r1；内围引物组包括上游引物seq f2和下游引物为seq r2。

10、进一步，所述引物是通过化学合成的核苷酸片段。index序列由6个碱基组成“xxxxxx”，用于识别各样本16s rdna序列；同时满足以下条件：每组引物组seq f2和seq r2的index序列不能相同、各组引物组index序列可存在一端相同、各组引物组不能出现2个index一致仅顺序不一致的情况。

11、本发明的第二个目的是提供一种珊瑚共附生古菌多样性的研究方法，提取样本基因组总dna，以上述引物组进行pcr反应，所述pcr反应包含2轮pcr反应的nested pcr(巢氏pcr)或semi-nested pcr(半巢氏pcr)。

12、优选，第一轮pcr时选取外围引物组为seq f1和seq r1，则第二轮nested pcr使用内围引物组为seq f2和seq r2；或第一轮pcr外围引物组为seq f2和seq r1时第二轮semi-nested pcr使用内围引物组为seq f2和seq r2；由于内围引物组相同，第二轮nest pcr和semi-nested pcr扩增产物一致。

13、优选，包括以下步骤：

14、步骤1，提取样本基因组总dna；

15、步骤2，以样本基因组dna为模板，第一轮pcr时选取外围引物组为seq f1和seqr1，第一轮pcr产物(稀释10～20倍)为模板进行第二轮pcr，第二轮nested pcr使用内围引物组为seq f2和seq r2；或以样本基因组dna为模板，第一轮pcr外围引物组为seq f2和seqr1，第一轮pcr产物(稀释10～20倍)为模板进行第二轮semi-nested pcr，使用内围引物组为seq f2和seq r2；

16、步骤3，第二轮pcr扩增产物切胶纯化、构建文库及测序；

17、步骤4，生物信息学及统计学分析。

18、进一步，所述步骤1提取样本基因组总dna采用常规ctab法或底泥dna提取试剂盒。

19、进一步，第二轮nested pcr或semi-nested pcr扩增产物经纯化后可直接用于文库构建及测序。

20、进一步，所述的第一轮pcr反应体系包括：1×ex taq buffer(mg2+plus)，100～200μm dntps(2.5mm each)，上、下游引物终浓度0.4～1.2μm，ex taq hs酶0.025～0.04u/μl,用ddh2o定量各成分至上述终浓度，加入样本基因组dna模板<10ng/μl。

21、进一步，所述的第一轮pcr程序为94℃-98℃5min；(94℃-98℃30s,65-68℃15-30s,72℃1min)×10-15cys；72℃5min。

22、进一步，所述的第二轮nested pcr或semi-nested pcr反应体系：1×ex taqbuffer(mg2+plus)，100～200μm dntps(2.5mm each)，上、下游引物终浓度0.4～1.0μm，extaq hs酶0.025～0.04u/μl,加ddh2o定量各成分至上述最终浓度，第一轮pcr结束后，取第二轮pcr反应体系，加入稀释10-15倍的第一轮pcr产物作模板。

23、进一步，所述第二轮nested pcr或semi-nested pcr反应程序：94℃-98℃5min；(94℃-98℃30s,59-64℃15-30s,72℃30s)×20-25cys；72℃5min。

24、当第一轮pcr循环次数在10-15，第二轮pcr循环次数20-25，获得更高、更真实的古菌信息覆盖率，便于测序结果的生物信息学及统计学分析，确定珊瑚共附生古菌的群落结构和丰度、alpha多样性和beta多样性。

25、本发明的第三个目的是提供一种珊瑚共附生古菌多样性研究的试剂盒，包括上述引物组seq f1、seq f2,seq r1、seq r2，上述2轮pcr反应体系(dna模板除外)及对应的程序。

26、本发明提供所述引物组和研究方法或试剂盒用于古菌多样性检测的用途，用于环境古菌及复杂样本如珊瑚、海绵、海葵、海藻等生物共附生古菌多样性研究。

27、与现有技术相比本发明具有以下优点：本发明既可同时检测到各门类古菌，又可有效屏蔽包括珊瑚、虫黄藻和各类真核生物、病毒和大部分细菌等影响，获得珊瑚共附生古菌门类显著增加；可用于底泥、水体等环境和各类生物样本，尤其适用于珊瑚、海绵、海葵、钙藻等生物共附生古菌研究。本发明能全面、准确、快速地研究古菌多样性，特异性强、灵敏度高、重复性好，且操作简单、样品保真性高、适用性广。