一种四型胶原蛋白ɑ5的抗体、检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于免疫检测，具体地，涉及一种四型胶原蛋白ɑ5的抗体、检测试剂盒及其应用。

背景技术：

1、遗传性肾炎，即阿尔波特综合征(alport综合征，as)是一种主要表现为血尿、肾功能进行性减退、感音神经性耳聋和眼部异常的遗传性肾小球基底膜疾病，是由于编码肾小球基底膜的主要胶原成分-iv胶原基因突变而产生的疾病。基因突变的发生率约为1/10000～1/5000。根据遗传方式可分为：①x连锁显性遗传(x-linked dominant，xl，约占80％)，致病基因在x染色体上，遗传与性别有关。②常染色体隐性遗传(autosomal recessive，ar；约占15％)，致病基因在常染色体上。③常染色体显性遗传(autosomal dominant，ad；极少数)。三种遗传方式分别因编码iv型胶原不同ɑ链的基因col4a5、col4a6、col4a3和/或col4a4突变所致。

2、遗传性肾炎的发病原因为：iv型胶原6条ɑ链聚合成3条三股螺旋分子结构称为单体，单体聚合形成二聚体或四聚体，再相互绞连形成胶原网状结构。x连锁显性遗传alport综合征得基因突变主要发生在编码iv型胶原ɑ5链的基因(col4a5)。常染色体隐性遗传alport综合征的基因突变则发生在2号染色体上编码iv型胶原ɑ3链或者ɑ4链的基因(col4a3/col4a4)上，而iv型胶原ɑ1链或iv型胶原ɑ2链的基因还是正常表达，即不管是遗传性肾小球肾炎还是正常肾小球，iv型胶原ɑ1链或iv型胶原ɑ2链都会正常表达。

3、目前对于遗传性肾炎的检测方法有：1、光镜检测。遗传性肾炎病理改变不具特征性，在电镜技术应用前，曾认为alport综合征属于慢性间质性肾炎，并误将肾间质泡沫细胞作为诊断依据。(2)应用特异性的抗iv型胶原不同ɑ链的抗体在肾脏以及皮肤组织进行免疫荧光检测，可以诊断x连锁显性遗传型男性、女性以及常染色体隐性遗传型alport综合征。(3)电镜观察：电镜下可观察到alport综合征特征性的病理改变，gbm广泛增厚、或变薄以及致密层分裂为其典型病变。

4、目前现有技术中有2类试剂盒用于遗传性肾炎的鉴别诊断：一类是瑞典公司的wieslab alprot’s syndrome kit。其试剂盒组成包含抗小鼠col4a1、col4a3的单克隆抗体及其对应的fitc偶联的小鼠二抗；抗大鼠col4a5的单克隆抗体及其对应的fitc偶联的大鼠二抗，该体系适用于免疫荧光细胞化学染色。另外该试剂盒还可用于石蜡包埋的组织，用于免疫组织化学染色，但是该方法需要分别对三个四型胶原蛋白抗体进行单独的ihc染色，方法比较复杂。另一类是日本cosmo公司的荧光免疫化学染色试剂盒，该方法使用col4a2和col4a5分别标记红色荧光和绿色荧光，再按照一定的配比作为一抗与肾组织上的抗原进行结合反应。使用荧光显微镜进行结果观察。理论上col4a2在肾小球及肾小管上均有基底膜的定位，col4a5的表达谱比较窄，正常情况下一般只定位在肾小球上，肾小管基本不染色。若病理存在遗传性肾炎(即alport综合征)，那么col4a5在肾小球上缺失表达。

5、目前，现有技术中缺少col4a3和col4a5重组兔单克隆抗体，同时应用于alport综合征的col4a1重组兔单克隆抗体也明显不足。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明旨在提供3个四型胶原蛋白即四型胶原蛋白α1(col4a1)、四型胶原蛋白α3(col4a3)、四型胶原蛋白α5(col4a5)单克隆抗体及其可变区序列，并由此组成病理诊断试剂盒，及其在alport综合征辅助诊断中的应用。为了达到该目的，本发明采用的技术方案如下：

2、本发明第一方面提供一种col4a1单抗，所述col4a1单抗的重链可变区如seq idno:1所示，轻链可变区如seq id no:2所示；所述col4a1单抗的重链可变区cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3和轻链可变区cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列分别如seq id no:3～8所示。

3、本发明第二方面提供一种col4a3单抗，所述col4a3单抗能够特异性识别四型胶原蛋白α3如seq id no:9所示的蛋白片段。在本发明的一些实施方案中，所述col4a3单抗利用氨基酸序列如seq id no:9所示的人col4a3蛋白多肽片段交联klh后免疫兔得到。

4、在本发明的一些实施方案中，所述col4a3单抗的重链可变区如seq id no:11所示，轻链可变区如seq id no:12所示；所述col4a3单抗的重链可变区cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3和轻链可变区cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列分别如seq id no:13～18所示。

5、本发明第三方面提供一种col4a5单抗，所述col4a5单抗能够特异性识别四型胶原蛋白α5如seq id no:19所示的蛋白片段。在本发明的一些实施方案中，所述col4a5单抗利用氨基酸序列如seq id no:19所示的人col4a5蛋白多肽片段经修饰并交联klh后免疫兔得到，优选地，所述修饰是指在多肽氨基酸序列氨基端添加一个半胱氨酸，以便于进行交联反应。

6、在本发明的一些实施方案中，所述col4a4单抗的重链可变区如seq id no:21所示，轻链可变区如seq id no:22所示；所述col4a5单抗的重链可变区cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3和轻链可变区cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列分别如seq id no:23～28所示。

7、本发明第四方面提供一种检测四型胶原蛋白的抗体组合，所述抗体组合包括本发明第一方面所述的col4a1单抗，还包括本发明第二方面所述的col4a3单抗和/或本发明第三方面所述的col4a5单抗。

8、在本发明的一些实施方案中，所述抗体组合包括本发明第一方面所述的col4a1单抗，还包括任意方法制备或获得的col4a3抗体和/或任意方法制备或获得的col4a5抗体，优选地，所述抗体为单抗。

9、在本发明的另一些实施方案中，所述抗体组合包括本发明第二方面所述的col4a3单抗，还包括任意方法制备或获得的col4a1抗体，优选地，还包括任意方法制备或获得的col4a5抗体，优选地，所述抗体为单抗。

10、在本发明的又一些实施方案中，所述抗体组合包括本发明第三方面所述的col4a5单抗，还包括任意方法制备或获得的col4a1抗体，优选地，还包括任意方法制备或获得的col4a3抗体，优选地，所述抗体为单抗。

11、本发明第五方面提供本发明第一方面所述的col4a1单抗、本发明第二方面所述的col4a3单抗、本发明第三方面所述的col4a5单抗或本发明第四方面所述的抗体组合在制备四型胶原蛋白免疫检测试剂盒中的应用。

12、在本发明的一些实施方案中，所述免疫检测选自包括免疫组织化学法、免疫荧光法、酶联免疫法、免疫印迹法的组中的至少一种。

13、本发明第六方面提供一种四型胶原蛋白免疫检测试剂盒，所述试剂盒第一方面所述的col4a1单抗、本发明第二方面所述的col4a3单抗、本发明第三方面所述的col4a5单抗或本发明第四方面所述的抗体组合。

14、在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒用于诊断alport综合征。

15、在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒包括本发明第二方面所述的col4a3单抗以及任意方法制备或获得的col4a1单抗，其中，所述col4a1单抗和所述col4a3单抗分别与不同荧光素偶联，或者所述col4a1单抗和所述col4a3单抗分别与不同酶标记物偶联。优选地，所述col4a1单抗为本发明第一方面所述的col4a1单抗。

16、在本发明的一些实施方案中，所述荧光素选自fitc、alexa fluor 488、gfp、fluo-3、pe、pi、pe-cy5、pe-cy5.5、percp、percp-cy5.5、texas red、7-aad、pe-cy7、pe-alexafluor 750、apc、cy5、alexa fluor 647、alexa fluor 660、alexa fluor 700、apc-cy7、apc-alexa fluor 750、hoechst33342-blue、dapi、hoechst33342-red、alexa fluor 405、pacific blue和pacific orange中的两种。在本发明的一些实施的实施方案中，所述col4a1单抗和所述col4a3单抗分别与texas red和fitc偶联。

17、在本发明的一些实施方案中，所述酶标记物选自辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶(ap)、β-半乳糖苷酶(β-gal)中的两种，在本发明的一些实施的实施方案中，所述col4a1单抗和所述col4a3单抗分别与hrp和ap偶联。

18、在本发明的另一些实施方案中，所述试剂盒包括本发明第三方面所述的col4a5单抗以及任意方法制备或获得的col4a1单抗，其中，所述col4a1单抗和所述col4a5单抗分别与不同荧光素偶联，或者所述col4a1单抗和所述col4a5单抗分别与不同酶标记物偶联。优选地，所述col4a1单抗为本发明第一方面所述的col4a1单抗。

19、在本发明的一些实施方案中，所述荧光素选自fitc、alexa fluor 488、gfp、fluo-3、pe、pi、pe-cy5、pe-cy5.5、percp、percp-cy5.5、texas red、7-aad、pe-cy7、pe-alexafluor 750、apc、cy5、alexa fluor 647、alexa fluor 660、alexa fluor 700、apc-cy7、apc-alexa fluor 750、hoechst33342-blue、dapi、hoechst33342-red、alexa fluor 405、pacific blue和pacific orange中的两种。在本发明的一些实施的实施方案中，所述col4a1单抗和所述col4a5单抗分别与texas red和fitc偶联。。

20、在本发明的一些实施方案中，所述酶标记物选自hrp、ap、β-gal中的两种，在本发明的一些实施的实施方案中，所述col4a1单抗和所述col4a3单抗分别与hrp和ap偶联。

21、在本发明的又一些实施方案中，所述试剂盒包括：本发明第四方面所述的抗体组合，还包括：抗所述抗体组合的多抗，以及与所述抗体组合中单抗的数量和所述多抗的数量之和相等的荧光染料组合，所述荧光染料组合中的荧光染料的荧光颜色均不同。

22、在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒包括：本发明第一方面所述的col4a1单抗和本发明第二方面所述的col4a3单抗组成的抗体组合，还包括抗所述col4a1单抗和所述col4a3单抗的多抗，以及3种荧光染料组合，所述荧光染料组合中的荧光染料的荧光颜色均不同。

23、在本发明的另一些具体实施方案中，所述试剂盒包括：本发明第一方面所述的col4a1单抗和本发明第三方面所述的col4a5单抗组成的抗体组合，还包括抗所述col4a1单抗和所述col4a5单抗的多抗，以及3种荧光染料组合，所述荧光染料组合中的荧光染料的荧光颜色均不同。

24、在本发明的又一些具体实施方案中，所述试剂盒包括：本发明第一方面所述的col4a1单抗、本发明第二方面所述的col4a3单抗和本发明第三方面所述的col4a5单抗组成的抗体组合，还包括抗所述col4a1单抗、所述col4a3单抗、所述col4a5单抗的多抗，以及4种荧光染料组合，所述荧光染料组合中的荧光染料的荧光颜色均不同。

25、在本发明的一些实施方案中，所述荧光染料可以是本领域熟知的任何荧光染料，只要满足不同荧光颜色均不同即可满足本发明的要求。在本发明的一些实施方案中，当需要4种荧光染料时，所述荧光染料例如是520、570、690和dapi。

26、本发明的有益效果

27、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

28、通过对蛋白片段的特定序列选择以及后续免疫原的修饰设计，制备得到了灵敏度、特异性优良的兔单抗，适用于各种免疫检测，特别是免疫组化法和免疫荧光法。

29、免疫组织化学(immunohistochemistry，ihc)是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对病理组织种相应抗原进行定性、定位或定量测定的一项免疫学检测技术。免疫组织化学检测原理是：组织切片经抗原热修复处理后与一抗试剂进行孵育，在原位形成一抗与目标抗原的抗原-抗体复合物；抗原-抗体复合物中一抗分子再与酶标记的聚合物二抗通过孵育结合，在原位进一步形成抗原-抗体-二抗聚合物的复合物；最后通过酶催化的底物在抗原部位形成有颜色的沉积物。光学显微镜下通过观察棕色部位来确定是否有目标抗原及其表达情况。通过免疫组织化学染色可确定病理组织细胞类型和形态、辨认组织细胞产物的来源、确定组织细胞的分化程度；尤其在临床病理中的应用最为重要，如鉴定病变性质，发现微小病灶，探讨肿瘤起源或分化表型，确定肿瘤分期，指导治疗和预后；辅助疾病诊断和分类，寻找感染病因等。目前临床上对遗传性肾炎的特异性检测方法采用荧光法，荧光法需要标记荧光素，检测方法上需要配置荧光显微镜进行结果判断。若还可以开发出免疫组化检测试剂盒则不需要荧光显微镜对结果进行判断，普通光镜即可实现。

30、多标记免疫荧光染色试剂盒是在tsa基础上开发的一套多标记复染方案，允许在同一样本中使用相同种属来源的不同一抗，以顺次单染的方式将各色标记的酪胺共价结合到目标抗原上(抗原直标)，随后通过微波加热去除抗体(抗体没了但信号仍留在抗原上)。清除上一轮抗体后即可使用新的抗体继续染色，不需担心交叉反应。