一种分离株新布尼亚病毒M段的序列及其编码的Gn蛋白

本申请涉及分子生物学、细胞生物学领域。具体涉及一胶东地区分离株新布尼亚病毒(sftsv)ytsd的m段核苷酸序列及其糖蛋白gn包括ytsd的m段核苷酸序列获取，ytsd糖蛋白gn序列、gn与fc融合蛋白的表达载体构建、表达、纯化以及活性分析。

背景技术：

1、sfts，为发热伴血小板减少综合征的简称，其临床表现为发热、血小板减少和白细胞减少为主要特征的蜱媒传染病。新布尼亚病毒，又称发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,sftsv)，为sfts的病原体，于2009年由中国研究者李德新等发现，是一种由蜱媒传播的病毒。sftsv为包膜病毒，其基因组为分l、m和s三个节段的单股负链rna。包膜蛋白gn为病毒包膜上的刺突蛋白，负责与细胞上受体结合，亦为中和抗体识别的靶标。

2、sfts的发病地区主要集中在国内河南、湖北、山东、安徽、江苏、辽宁，在韩国、日本、越南也有报道，发病时间主要集中在4-10月份，据统计，山东胶东地区2021年4月到10月期间有131例患者感染sftsv，感染率和病死率呈上升趋势。

3、目前没有针对sfts商品化的疫苗及特效药物。亦没有商品化的sftsv的gn抗原。病毒性传染病的防治，疫苗和抗体药物均为可行的策略。本申请旨在提供一种用于检测疫苗、抗体药物有效性以及血清学诊断的gn抗原。

4、根据检索发现，中国专利文献号cn113061168 b，授权公告日2021.11.09，公开了一种截短的发热伴血小板减少综合征病毒gn蛋白及其应用。该gn蛋白通过截短公共数据库中的天然gn蛋白的24个氨基酸获得，用作抗病毒疫苗。

技术实现思路

1、本发明的目的基于胶东地区分离株新布尼亚病毒m段的序列及其编码的gn蛋白，解决上述背景技术中提出的问题。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种分离株新布尼亚病毒m段的序列及其编码的gn蛋白包括本发明是从胶东地区分离了一sftsv毒株ytsd，明确了其m段的核苷酸序列，并利用该m段糖蛋白gn的氨基酸序列，获得了有活性的重组蛋白gn-fc。

3、在本发明中，毒株ytsd的m段申请的genebank号为om162020。m段为6个片段拼接而成。该6个片段分别命名为m1，m2，m3，m4，m5和m6，通过pcr扩增得到，引物对应的m1-s，m1-f；m2-s，m2-f；m3-s，m3-f；m4-s，m4-f；m5-s，m5-f；m6-s，m6-f。

4、在本发明中，糖蛋白gn来自毒株ytsd的m段序列，糖蛋白gn的核苷酸序列以seq no5所示，其对应的氨基酸序列为seq no 6。gn蛋白包括m段氨基酸序列的n端缺失19个氨基酸，c端缺失621个氨基酸的核心序列。

5、糖蛋白融合蛋白gn-fc为在糖蛋白gn核心序列的基础上融合表达了人igg1抗体的fc段，核苷酸序列和蛋白序列分别融合了fc的核苷酸序列和氨基酸序列，为一种真核细胞稳定分泌表达的重组蛋白。

6、载体为phl-fc表达载体，为质粒作为载体，载体上含有扩增和表达原件，上有氨苄青霉素抗性标记。目的基因gn-fc在原核细胞中扩增，在真核细胞293t中表达，通过使用脂质体转染，使其分泌表达在293t细胞上清中。

7、表达所使用的真核细胞为293t细胞，或293f细胞，以便目的蛋白能够在该真核细胞中高效表达。

8、纯化采用载体上的标签进行，his或fc标签，镍柱纯化或亲和纯化。

9、活性分析使用酶联免疫吸附试验(elisa)检测，将gn-fc与从不同患者血清中的多克隆抗体共孵育，检测其结合活性及与不同抗体的交叉反应活性。

10、本发明提供了一种优化的gn抗原，将gn序列截短为433个氨基酸，既保留了gn蛋白的保守序列，又保证了gn蛋白分泌表达到细胞外，可以作为重组疫苗、抗体药物结合活性的检测，也可以用于sftsv患者的血清学诊断，为可商品化的gn抗原。

11、在具体的实施中，gn的序列进行了优化，便于在在真核细胞(293f或293t细胞)中表达并分泌到细胞上清中。

技术特征：

1.一种分离株新布尼亚病毒m段的序列及其编码的gn蛋白，包括分离株，其特征在于：分离株为胶东地区急性期患者血清中分离得到新布尼亚病毒sftsv，命名为ytsd毒株。该分离株m段序列经分段pcr后拼接而成。其核苷酸序列如seq no 1表示,其氨基酸序列如seqno 2表示。

2.根据权利要求1所述的一种分离株新布尼亚病毒m段的序列及其编码的gn蛋白，其特征在于：gn蛋白，来源于ytsd毒株m段经优化后的核苷酸序列编码而成。其中m段优化，是根据人细胞偏好优化的m段核苷酸序列，编号为seq no 3，其对应的优化后的m段氨基酸序列为seq no 4。

3.根据权利要求2所述的一种分离株新布尼亚病毒m段的序列及其编码的gn蛋白，其特征在于：gn蛋白包含gn核心氨基酸序列与fc氨基酸序列，为两者连接而成的融合蛋白gn-fc，该融合蛋白核苷酸序列为seq no 7，氨基酸序列为seq no 8。

4.根据权利要求3所述的一种分离株新布尼亚病毒m段的序列及其编码的gn蛋白，其特征在于：gn核心氨基酸序列，包含ytsd毒株m段天然表达的氨基酸序列n端截短19个氨基酸，c端截短621个氨基酸而得到433个氨基酸组成的序列，其核苷酸序列为seq no 5，氨基酸序列为seq no 6。

5.根据权利要求3所述的一种分离株新布尼亚病毒m段的序列及其编码的gn蛋白，其特征在于：gn-fc蛋白，为293t细胞或293f细胞表达分泌到细胞上清中经纯化得到，使用western blot检测表达情况。

6.根据权利要求3所述的一种分离株新布尼亚病毒m段的序列及其编码的gn蛋白，其特征在于：gn-fc蛋白，其中，fc为纯化标签，便于gn的稳定表达和亲和纯化，该标签序列存在于phl-fc载体上。

7.根据权利要求3所述的一种分离株新布尼亚病毒m段的序列及其编码的gn蛋白，其特征在于：phl-fc载体，为质粒载体，携带fc标签和his标签，该两个标签为纯化标签。

8.根据权利要求3所述的一种分离株新布尼亚病毒m段的序列及其编码的gn蛋白，其特征在于：gn-fc蛋白，使用elisa检测其与患者血清中多克隆抗体的交叉反应情况。

9.根据权利要求8中的gn-fc与不同多克隆抗体的交叉反应活性，gn-fc显示了明显的结合活性。该gn-fc应用于疫苗活性鉴定，抗体药物筛选以及用于临床诊断等方面。

10.根据权利要求9所述的一种分离株新布尼亚病毒m段的序列及其编码的gn蛋白，其特征在于：疫苗，包括灭活疫苗、减毒活疫苗和重组疫苗等；抗体药物，包括人源化抗体和人源抗体药物；临床诊断，包括用于sftsv患者的血清学诊断。

技术总结
本发明公开了一种分离株新布尼亚病毒M段的序列及其编码的Gn蛋白，M段核苷酸序列和编码的氨基酸序列，以及包括M段编码的Gn与Fc融合形成Gn‑Fc蛋白的表达、纯化和活性分析。此外，本申请还涉及融合蛋白与不同患者血清中多克隆抗体的交叉反应。

技术研发人员：乔媛媛,徐家馨,张凡
受保护的技术使用者：滨州医学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12