1.本发明属于基因诊断和生物制药领域，特别提供了肠易激综合征关键特征分子作为诊断标志物的用途。
背景技术：
：：2.肠易激综合征(irritablebowelsyndrome,ibs)是一种常见的慢性功能性胃肠道疾病，影响全世界各地区9％-23％的人口，ibs发病率呈上升趋势。ibs临床表现为多样症状的组合，包括腹痛、腹胀、便秘和腹泻等。大量研究表明，与普通人群或患有其他慢性疾病(如糖尿病和终末期肾病)的患者相比，ibs患者的生活质量更差。除腹痛等肠道症状外，超过60％的患者还可能伴有多种肠外症状，如睡眠障碍、偏头痛、纤维肌痛等躯体疼痛症状以及慢性疲劳综合症等。此外，约50％-90％的患者还会受到精神和心理问题的困扰。ibs不仅降低了患者的生活质量，还给社会医疗卫生系统造成了巨大的负担。在基层保健案例中，与ibs相关的医疗保健患者比例接近12％，是迄今为止胃肠病学临床案例中的最大患者群。3.ibs是一系列病症的组合，临床分型复杂，临床诊断ibs存在困难。目前临床诊断ibs依靠“罗马标准”。“罗马标准”最初是在1988年意大利罗马举行的肠胃病国际会议制定，最近一次修订于2016年，称为“罗马ⅳ标准”(romeⅳ)，是现今最受国际认可的诊断ibs的标准。在romeⅳ中，根据患者报告的排便时间比例和主要的肠道症状，ibs被分为四个亚型：便秘型ibs(constipation-predominantibs,ibs-c)、腹泻型ibs(diarrhea-predominantibs,ibs-d)、便秘和腹泻混合症状型ibs(mixed/alternatingibs,ibs-m)和未定型ibs(unsubtypedibs,ibs-u)。在四种亚型中，ibs-c与ibs-d是主要亚型，来自全世界多项独立研究的汇总分析数据显示，ibs-d患者占ibs患者总数的40.0％，ibs-c患者占ibs患者总数的24.3％。4.但ibs临床诊断过程复杂，确诊存在一定难度。罗马标准ibs的诊断不是排除性质的诊断，而是基于症状标准的诊断。在临床实践中常常需要大量其它的医学检查分析来排除患者患有各种器质性疾病的可能(例如，使用内镜检查，ct或超声成像，血液学检查，粪便检查等)，导致诊断过程往往耗时费钱，因为ibs患者经常出现并存的功能障碍，如功能性消化不良、纤维肌痛、慢性盆腔疼痛或间质性膀胱炎。一些患者可能会出现一些不典型的症状，这些症状会影响罗马标准的适用性，经常导致误诊。特别是ibs亚型确诊的难度更大，更具有挑战性。因此，客观有效的ibs生物标志物能够有效简化ibs的诊断流程并改善临床患者的同质性，从而指导有效的诊断和个性化治疗，并增加对潜在病理生理机制的了解。5.尽管ibs有关的健康问题已被广泛研究，但病因和发病机制尚不明确，临床发现外在环境因素或内在生理因素都可能诱导ibs发生，例如：胃肠道运动异常、肠道炎症反应或免疫系统激活异常、外界压力增大和心理疾病困扰、内脏高敏感、胆汁酸代谢异常、脑-肠轴紊乱、机体激素水平异常，肠道微环境的改变，等。此外，不同亚型ibs的疾病发生过程也截然不同，有关不同亚型ibs发病机制依然不甚明了。由于对肠易激综合征的确切发病机制缺乏了解，也直接影响了为临床不同亚型ibs诊断和提供合适的治疗方案。6.近来研究显示，ibs的发生发展受环境因素和遗传变异的共同影响，生物分子网络调控可能在ibs的发病机制中发挥核心作用，遗传因素与心理压力、饮食、肠胃炎症和肠道菌群改变等多触发因素产生复杂的相互作用，从而导致个体的基因特征。该理论基于一个与现有ibs病理症状有关的基因网络，ibs基因网络发病机制理论可以解释现有的各种ibs的病理现象(例如，胃肠道感觉运动功能的改变、神经元信号转导的改变、免疫反应受损和肠道屏障功能障碍，等)。但ibs基因网络调控的确切机制尚不完全清楚。ibs不同亚型的敏感基因谱是否不同仍然是一个悬而未决的问题。临床上需要有效的诊断预测方法，对患病人群给予有效识别和干预，同时也需要更精准有效的治疗方案治愈疾病。7.现代研究表明，大约有25000个基因在rna水平的表达是高度可变的，可以影响机体的生理和病理变化。近年来随着基因芯片技术的发展，基因表达分析已经广泛应用于疾病的研究。医学领域的研究已经表明，基因表达对疾病具有显著的预测价值，基因表达分析可以为疾病近期风险预测提供新的生物标志物。因此，从分子水平探索ibs发病机制，寻找有效的分子标志物，并将特征性分子作为治疗靶点，以提高临床诊断的准确性和药物治疗的有效性，可为ibs的诊断和治疗开辟新途径。技术实现要素：8.发明目的：为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种肠易激综合征关键特征分子作为诊断标志物的用途。本发明通过对患者样本关键分子基因表达量差异或蛋白表达量差异的分析，发现肠易激综合征的关键特征分子，利用这些关键特征分子可以提高ibs的诊断准确率，从而减少误诊和简化诊断流程。9.技术方案：本发明提供了一种检测生物样本中关键特征分子水平的试剂在制备肠易激综合征诊断产品中的应用，所述关键特征分子包含drd3、agtr1、egfr、il1b中任意一种或几种。10.作为一种方案，检测生物样本中关键特征分子水平的试剂在制备肠易激综合征诊断产品中的应用，所述关键特征分子包含drd3、agtr1中任意一种或两种。11.作为一种方案，检测生物样本中关键特征分子水平的试剂在制备便秘型肠易激综合征或腹泻型肠易激综合征诊断产品中的应用，所述关键特征分子包含egfr、il1b中任意一种或两种。12.或者是，检测生物样本中关键特征分子水平的试剂在制备区分便秘型肠易激综合征和腹泻型肠易激综合征产品中的应用，所述关键特征分子包含egfr、il1b中任意一种或两种。13.作为一种方案，检测生物样本中关键特征分子水平的试剂在制备便秘型肠易激综合征或腹泻型肠易激综合征诊断产品中的应用，所述关键特征分子包含drd3、agtr1、egfr和il1b的组合。14.作为一种方案，检测生物样本中关键特征分子水平的试剂在制备便秘型肠易激综合征诊断产品中的应用，所述关键特征分子包含egfr、il1b、hla-dqb1和adora3的组合。15.作为一种方案，检测生物样本中关键特征分子水平的试剂在制备腹泻型肠易激综合征诊断产品中的应用，所述关键特征分子包含egfr、il1b和cldn1的组合。16.作为具体实施方案，所述关键特征分子水平包括关键特征分子的mrna水平或蛋白水平。在本发明中，“肠易激综合征诊断”既包括判断受试者是否已经患有ibs或判断受试者是否存在患有ibs的风险，也包括判断受试者患有ibs的亚型。在一些方案中，无ibs受试者应当理解为包括健康受试者和患非ibs的疾病受试者。17.作为具体实施方案，所述检测生物样本中关键特征分子水平的试剂包括引物、探针或抗体；所述肠易激综合征诊断产品包括基因芯片、试剂盒或试纸，或采用常规pcr相对定量技术、实时荧光定量pcr技术或高通量测序平台检测受试者的生物样本中特征性分子的表达水平，以诊断肠易激综合征的产品。18.作为具体实施方案，所述生物样本包括体液、组织或细胞。在一些方案中，体液包括血液、血清、血浆、尿液等。在一些方案中，组织包括肠道组织、神经组织、结缔组织等。在一些方案中，细胞包括循环细胞、免疫细胞(调节性t细胞、分泌il-17的t辅助细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞)、成纤维细胞等。19.本发明最后提供了所述的关键特征分子水平调节剂在制备治疗肠易激综合征药物中的用途。20.所述关键特征分子水平促进剂选自：能够全部或部分促进/抑制关键特征分子表达的物质，能够全部或部分促进/抑制关键特征分子蛋白发挥功效的物质。21.所述关键特征分子水平促进剂选自：蛋白质、寡核苷酸、寡核苷酸表达载体或小分子化合物等。22.本发明技术方案，详述如下：23.本发明以ibs-d、ibs-c以及健康人的临床样本数据，结合加权基因共表达网络分析,分别构建了以447个ibs-c差异表达基因和364个ibs-d差异表达基因为基础的ibs-c/ibs-d疾病分子网络，通过网络分析和系统生物学研究筛选发现各亚型差异基因网络的关键枢纽基因(hubdegs)。本发明发现这些关键分子是ibs疾病网络的重要节点和分子特征，这些关键分子富集了一批重要ibs信号通路和多个致病模块。例如，炎症反应模块(apelinsignalingpathway，chemokinesignalingpathway，neuroactiveligand-receptorinteractionpathway)、神经内分泌模块(serotonergicsynapse，dopaminergicsynapse)、痛觉过敏模块(inflammatorymediatorregulationoftrpchannels，neuroactiveligand-receptorinteractionpathway，)、胃肠道动力模块(cgmp-pkgsignalingpathway，relaxinsignalingpathway，vascularsmoothmusclecontraction，adherensjucion-tightjunction，)和互作模块(calciumsignalingpathway，apelinsignalingpathway)。致病模块之间或重要信号通路之间具有密切的互作关系，显著影响ibs疾病网络调控转化。在此基础上确定了一组差异基因分子，可以区分两种亚型ibs的分子标志物并体现ibs-c与ibs-d发病机制上的差异。24.drd3与agtr1同时出现在两种亚型的关键差异表达基因中，可以作为区分ibs与健康对照组的分子标志物。本发明实验研究结果表明,与健康对照样本相比，两种亚型(ibs-c和ibs-d)的样本drd3和agtr1均下调(p《0.01，p《0.05)。因此，drd3和agtr1下调可能是ibs的重要分子特征。多巴胺能突触是ibs致病网络中的神经内分泌模块的主要信号通路，drd3是其中的关键分子。多巴胺能突触是多巴胺(da)的信号转导途径，多巴胺(da)是在中枢神经系统和肠神经系统中具有明确生理作用的重要神经递质。da与机体中的多种复杂过程相关，如运动、认知、激素分泌、肾功能和肠道运动。多巴胺受体drd3在免疫细胞中表达并参与免疫调节过程。drd3作为由degs构成的ppi网络的中枢节点，调节多巴胺能突触，协同产生免疫和心理调节作用。因此，drd3在ibs患者的神经内分泌调节中发挥重要作用。25.趋化因子信号通路、神经活性配体-受体相互作用通路和apelin信号通路参与构成了炎症反应模块。agtr1激活血管紧张素ii1型受体(agtr1)作为关键分子能够介导不同类型的炎症反应并在该模块中发挥重要作用。此外，agtr1参与多条通路(apelinsignalingpathway，neuroactiveligand-receptorinteractionpathway，cgmp-pkgsignalingpathway，calciumsignalingpathway，vascularsmoothmusclecontraction)和多个模块，介导了神经内分泌调节、痛觉过敏、神经炎症和胃肠动力异常等生物过程。26.egfr与il1b同时出现在两种亚型的差异表达基因中，可以作为区分ibs-c与ibs-d的分子标志物。本发明实验研究结果表明,与健康对照样本相比，egfr在ibs-d样本中显著上调(p《0.01)，在ibs-c样本中显著下调(p《0.05)。与健康对照样本相比，il1b在ibs-d样本中显著上调(p《0.01)，在ibs-c样本中显著下调(p《0.05)。表皮生长因子受体(egfr)是人类表皮受体酪氨酸激酶受体家族的一部分，激活该分子能够诱导细胞生长，促进细胞分化，增殖和迁移。胃肠道中表皮生长因子(egf)的高表达在胃肠道功能的调节以及保护上皮细胞免受血浆中各种因子的损伤中起重要作用。此外，egf通过增加人肠上皮细胞中的sert转录来上调5-ht的再摄取。本研究认为egfr的表达水平在两种亚型中呈现不同的趋势与两种亚型ibs的5-ht代谢差异有关。27.il1b是一种重要的促炎细胞因子，通过诱导环氧合酶-2(ptgs2/cox2)诱导炎症超敏反应。有临床研究表明，ibs患者直肠粘膜基因il1b的表达水平高于健康志愿者。本研究认为，il1b在不同亚型患者的差异表达表明ibs-d中存在更为严重的粘膜炎症。28.cldn1出现在ibs-d的差异表达基因中，可以作为诊断ibs-d的分子标志物。本发明实验研究结果表明,相比于健康对照样本，cldn1在ibs-d样本中显著下调(p《0.01)，且在ibs-c样本中无显著变化。推测ibs-d患者体内cldn1下调与粘膜炎症存在密切关联。本研究认为，ibs-d患者体内cldn1下调与粘膜炎症存在密切关联。ibs-d患者的肠道屏障功能受损，与cldn1在ibs-d患者的肠粘膜上皮细胞中下调有关。跨膜蛋白claudin-1(cldn1)能够与肌动蛋白细胞骨架结合并调节肠屏障的细胞旁通透性，是维持肠道屏障功能的关键蛋白。肠道屏障受损使得有害物质更容易通过肠粘膜屏障进入肠内膜组织和血液循环，从而激活免疫系统并引发炎症反应。29.hla-dqb1出现在ibs-c的差异表达基因中，可以作为诊断ibs-c的分子标志物。本发明实验研究结果表明,与健康对照样本相比，hla-dqb1在ibs-c样本中高表达(p《0.05)，在ibs-d样本中无显著性差异。hla-dq是一种在抗原呈递细胞上发现的细胞表面受体型蛋白质，是主要组织相容性复合物ii类的异二聚体。hla-dqb1也参与了松弛素信号通路，本研究认为ibs-c胃肠动力异常可能与hla-dqb1的异常表达有关。30.adora3出现在ibs-c的差异表达基因中，可以作为诊断ibs-c的分子标志物。本发明实验研究结果表明,与健康对照样本相比，adora3在ibs-d样本中无明显变化，在ibs-c样本中下调(p《0.01)。本研究认为，adora3的差异表达表明ibs-c粘膜炎症反应的特点。腺苷(adenosine)是人体内的一种嘌呤核苷，可以通过激活腺苷受体来调节许多生物过程，包括炎症。腺苷受体在啮齿类动物和人类肠道中表达，腺苷受体的激活可以调节胃肠系统的炎症反应，激活adora3能减少炎症性肠病患者结肠粘膜中促炎性细胞因子的产生并抑制nf-κb信号的激活，从而起到抑制炎症的作用。31.综上所述，drd3和agtr1下调是ibs的重要分子特征，反映多模块和信号通路异常，可以作为区分ibs与健康对照组的分子标志物。其它差异表达基因(egfr、cldn1、hla-dqb1、adora3和il1b)在ibs-c与ibs-d中呈现出不同的表达趋势。其中，egfr的差异表达可能与两亚型在神经内分泌模块的代谢差异相关；cldn1、adora3和il1b的差异表达可能与ibs-d或ibs-c中的粘膜炎症相关；hla-dqb1的差异表达可能与ibs-c的胃肠功能异常相关，它们与所述的基因网络中ibs致病模块关系密切，是各个致病模块的代表性分子。32.本发明通过大量样本研究，综合考察这7个差异表达基因的表达水平能反应ibs两种亚型在发病机制上的差异，确定这组差异表达基因可以作为区分健康与ibs患者或两种亚型ibs患者的分子标志物。例如，drd3或agtr1可以作为ibs患者的诊断标志物，egfr或il1b可以用于区分ibs两种亚型(ibs-c/ibs-d)的诊断标志物，cldn1可以作为ibs-d患者的诊断标志物，hla-dqb1或adora3可以作为ibs-c患者的诊断标志物。33.有益效果：与现有技术相比，本发明发现了一组差异表达基因可以作为区分健康与ibs患者或两种亚型ibs患者的分子标志物，利用这些关键特征分子，能够有效简化ibs的诊断流程，从而指导有效的诊断和个性化治疗，并增加对潜在病理生理机制的了解，具有重要的临床应用意义和开发价值。具体实施方式34.下面对本发明作出进一步说明。35.表1主要缩写[0036][0037]本发明中的基因序列均已知且公开，本领域技术人员可在ncbi(nationalcenterforbiotechnologyinformation，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)查询相关序列。[0038]实施例1关键基因的mrna表达水平分析[0039]1、实验样本数据的收集与预处理[0040]病例样本数据的收集与预处理[0041]从geo数据库(hops://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载基因表达芯片gse146853的临床样本数据进行诊断标志物的mrna表达分析，该数据集共有68个肠道上皮组织临床样本，均来源于罗切斯特梅奥诊所(mayoclinicrochester)，包含21份健康正常样本(13位健康志愿者)、23份ibs-c样本(15位便秘型肠易激综合征患者)以及23份ibs-d样本(15位腹泻型肠易激综合征患者)。应用linux及r软件对rna-seq数据进行预处理，包括文库构建，质量控制，序列比对和表达定量等，从而构建样本的表达矩阵。[0042]关键基因的差异表达分析[0043]采用统计软件r(https://www.r-project.org/,4.0.2版本)进行对不同组的rna-seq数据进行差异表达分析，包括：“ibs-c患者样本与健康对照组样本(healthyversusibs-c,hvc)”、“ibs-d患者样本与健康对照组样本(healthyversusibs-d,hvd)”和“ibs-c患者样本与ibs-d患者样本(ibs-cversusibs-d,cvd)”之间的差异表达基因，其中以“|log2fc|》1,p《0.05”为差异基因的筛选条件，分析本技术方案中关键基因的差异表达结果。[0044]2、实验结果[0045]与健康对照样本相比，两种ibs亚型样本的drd3和agtr1均显著低表达(p《0.01)。与健康对照样本相比，在ibs-d样本中egfr显著高表达(p《0.01)，在ibs-c样本中显著低表达(p《0.01)。与健康对照样本相比，在ibs-d样本中il1b显著高表达(p《0.01)，在ibs-c样本中显著低表达(p《0.01)。相比于健康对照样本，在ibs-d样本中cldn1显著低表达(p《0.01)，在ibs-c样本中无显著差异。与健康对照样本相比，在ibs-c样本中hla-dqb1显著高表达(p《0.01)，在ibs-d样本中无显著性差异。与健康对照样本相比，在ibs-c样本中显著低表达(p《0.01)，在ibs-d样本中无显著性差异。[0046]3、结论[0047](1)在ibsc和ibsd样本中drd3和agtr1显著下调，可以用于ibs的分子诊断。[0048](2)il1b在ibs-d样本中显著上调，在ibs-c样本中显著下调。egfr在ibs-d样本中显著上调，在ibs-c样本中显著下调。egfr和il1b可以用于区分ibs-c或ibs-d的分子诊断。[0049](3)hla-dqb1在ibs-c样本中显著上调，adora3在ibs-c样本中显著下调，cldn1在ibs-d样本中显著下调。cldn1，hla-dqb1，adora3可以ibs-c或ibs-d的辅助分子诊断。[0050]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12当前第1页12