SOD1作为生物标志物在制备用于提高头颈鳞癌对阿法替尼的敏感性的药物中的应用

sod1作为生物标志物在制备用于提高头颈鳞癌对阿法替尼的敏感性的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及sod1作为生物标志物在制备用于提高头颈鳞癌对阿法替尼的敏感性的药物中的应用。


背景技术：

2.头颈癌是世界第六大常见癌症类型，包括起源于鼻窦、鼻腔、口腔、咽、喉等部位的上皮性恶性肿瘤，全球每年的发病人数超过55万，死亡人数超过 30万，其中95％以上的头颈癌均为头颈鳞癌。目前，手术、放疗和化疗仍是头颈鳞癌的主要治疗手段，但在一定程度上也会造成头颈部器官及功能的损害，并导致患者的生活质量下降。近年来，随着测序技术及多组学分析技术的进展，靶向治疗特异性地作用于肿瘤发生、发展中起关键作用的靶分子及其调控的信号转导通路，显示出高效、低毒等特点，已成为多种癌症类型治疗的主流。然而头颈鳞癌的遗传学特征显示其以抑癌基因突变为主，正面临着靶向药物治疗策略极度匮乏的现状。
3.阿法替尼(afatinib)是表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor，egfr)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor2，her2)酪氨酸激酶的强效、不可逆的双重抑制剂。已有相关报道证明afatinib在铂类为基础的治疗失败后对复发或转移性hnscc仍然有效，并被用作复发或转移性头颈鳞癌患者的二线治疗。然而，在一项原发性未切除、局部晚期、中高危的头颈鳞癌患者辅助治疗的临床试验(lux-head&neck2)中，评估阿法替尼对比安慰剂，研究未能证明阿法替尼在无病生存期上相比安慰剂存在明显优越性，这可能是由于缺乏有效生物标志物所导致的。鉴于此，迫切需要精准的生物标志物来指导阿法替尼的临床应用。
4.阿法替尼是表皮生长因子受体egfr和人表皮生长因子受体2her2酪氨酸激酶的强效、不可逆的双重抑制剂。虽然2014年公布的iii期临床试验lux-head&neck1研究的数据表明，阿法替尼相较于化疗可显著延缓之前治疗方案失败的患者的肿瘤的生长，表现为患者的疾病进展风险降低20％。该临床研究旨在比较阿法替尼相较于甲氨蝶呤应用于复发性和/或转移性头颈部鳞癌患者的疗效和安全性进行评估，但是在总体生存时间方面，阿法替尼组和化疗组之间并未观察到显著差异，两组的中位生存时间分别为6.8个月和6.0个月。此外，2019年在jama oncology中发表的lux-head&neck2 临床研究旨在评估阿法替尼在明确的放化疗后是否改善头颈鳞癌患者的无病生存期。该研究共纳入617名患者，患者被随机分组(2：1)，以阿法替尼或安慰剂治疗，治疗持续了18个月，或直到疾病复发、不可接受的不良事件或患者退出。结果显示，在放化疗后用阿法替尼治疗并没有改善无病生存期，并且与安慰剂相比，在原发性、中高危中的头颈鳞癌患者中，其不良事件比安慰剂更多。该临床研究最终不建议在放化疗后使用阿法替尼治疗。鉴于此，虽然阿法替尼目前作为复发或转移性头颈磷癌患者的二线治疗，但是由于缺乏明确有效的生物标志物，从而导致临床治疗的药效不佳。
5.因此，亟需寻找一种有效的生物标志物，用于阿法替尼在头颈磷癌的临床用药中指导患者精准用药。


技术实现要素：

6.本发明的目的是解决目前阿法替尼在头颈磷癌的临床用药中缺乏有效的生物标志物，从而导致的临床药效不佳的缺陷。
7.为了达到上述目的，本发明提供了sod1作为生物标志物在制备用于提高头颈磷癌对阿法替尼的敏感性的药物中的应用。
8.本发明提供了sod1作为生物标志物在制备用于提高头颈鳞癌对阿法替尼的敏感性的药物中的应用。
9.较佳地，所述药物包含sod1抑制剂。
10.较佳地，所述sod1抑制剂包含与sod1mrna结合的sirna。
11.较佳地，所述sirna选自si-sod1-1、si-sod1-2、si-sod1-3中的任意一种，且所述si-sod1-1、si-sod1-2、si-sod1-3的碱基序列如下：
12.si-sod1-1：
13.正义链：5
’‑
ccucacuuuaauccucuautt-3’；
14.反义链：5
’‑
auagaggauuaaagugaggtt-3’；
15.si-sod1-2：
16.正义链：5
’‑
cgaugugucuauugaagautt-3’；
17.反义链：5
’‑
aucuucaauagacacaucgtt-3’；
18.si-sod1-3：
19.正义链：5
’‑
gggcaaagguggaaaugaatt-3’；
20.反义链：5
’‑
uucauuuccaccuuugccctt-3’。
21.较佳地，所述头颈磷癌至少包含口腔鳞癌、鼻咽癌、喉癌中的任意一种。
22.本发明还提供了一种用于制备治疗头颈鳞癌的药物组合物，所述药物组合物包含sod1抑制剂和阿法替尼。
23.较佳地，所述sod1抑制剂为与sod1mrna结合的sirna。
24.本发明还提供了一种用于检测头颈鳞癌对阿法替尼治疗敏感性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包含与所述sod1特异性结合的抗体。
25.较佳地，所述试剂盒选自qpcr试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、elisa试剂盒中的任意一种。
26.本发明还提供了阿法替尼在制备治疗头颈磷癌药物中的应用，所述头颈磷癌中sod1低表达。
27.本发明的有益效果：
28.本发明通过药物基因组学分析，首次发现sod1可以作为阿法替尼在头颈磷癌治疗中的生物标志物，通过体内和体外实验验证了sod1低表达的头颈磷癌对阿法替尼具有更高的敏感性，sod1抑制剂与阿法替尼的联合使用，可用于提升头颈磷癌对阿法替尼的治疗敏感性，从而指导头颈磷癌的临床精准用药，在头颈磷癌治疗领域具有广泛的应用前景。
附图说明
29.图1为阿法替尼对9株头颈磷癌验证细胞集合的药效结果图。
30.图2为10个药效生物标志物在阿法替尼敏感性与耐药性两组细胞间进行的表达验证实验结果图。
31.图3为利用sirna敲减头颈磷癌患者来源的肿瘤原代细胞pdc_51和头颈磷癌商品化细胞系hn13中的sod1的表达后，westernblot检测细胞中sod1表达水平的实验结果图。
32.图4为在肿瘤原代细胞pdc_51和头颈磷癌商品化细胞系hn13中敲减 sod1的表达后，各组细胞在1μm浓度的阿法替尼作用72h后的相对细胞存活率示意图。
33.图5为在sod1低表达的头颈磷癌异种移植pdx_3中，阿法替尼药物或溶剂对照处理移植瘤后的生长状况；其中，图5的a表示移植瘤的生长大小示意图；图5的b表示根据移植瘤进行统计的生长时间与移植瘤体积大小的关系图。
34.图6为在sod1高表达的头颈磷癌异种移植pdx_9中，阿法替尼药物或溶剂对照处理移植瘤后的生长状况；其中，图6的a表示移植瘤的生长大小示意图；图5的b表示根据移植瘤进行统计的生长时间与移植瘤体积大小的关系图。
具体实施方式
35.以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和仪器为本领域常规试剂、方法和仪器。
36.本发明中头颈磷癌商品化细胞系hn13购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
37.本发明中用以构建pdx模型的小鼠为雌性balb/c-nu裸鼠，6-8周龄，购自上海市计划生育科学研究所实验动物经营部(动物许可证号：scxk(沪) 2018-0006)。小鼠饲养符合spf级条件下分笼饲养。保持室温18-25℃，相对湿度40％-60％，专用鼠笼、垫料，饲料及饮水经121℃，30min高压灭菌，每周至少1次更换垫料。
38.实施例1构建头颈磷癌患者来源的异种移植瘤模型
39.对于本发明构建异种移植瘤模型(patient-derived xenograft,pdx)的对应患者，记录其临床信息，包括基本资料(性别、年龄、烟酒史等)、临床病理诊断(肿瘤大小及位置、tnm分期、hpv感染情况)、既往治疗史(手术、放化疗情况)、复发和转移等预后信息等。收集患者的肿瘤、癌旁及血液样本。对肿瘤样本进行病理组织形态学鉴定和遗传学信息鉴定。
40.肿瘤组织经手术切除后，观察组织颜色、形态、质地，切除坏死组织，选择病灶中央部分进行取材。因头颈鳞癌一般生长于口腔、鼻腔黏膜等污染部位，因此样本接种移植到小鼠前需要用0.05％次氯酸钠除菌，1％青霉素
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链霉素双抗的pbs快速清洗30秒。轻轻刮除组织样本外周组织，将肿瘤切成1～2mm3大小的小块，在无菌条件下将患者组织移植到免疫缺陷小鼠血供、淋巴结较丰富的区域(如双侧腋窝)构建皮下pdx模型，或接种于动物双侧颌下间隙构建原位pdx模型。为提高接种成功率，可将matrigel胶与患者肿瘤组织混合后接种，每个患者组织接种到3-5只小鼠上。建模1-2周后开始追踪pdx模型生长轨迹，当肿瘤体积超过800mm3或肿瘤体积两周无明显增长时，对移植瘤进行序列传代，一般移植瘤传代至3代以上时认为该模型可以稳定传代。构建得到的pdx，模型用于后续体内实验开展相关验证
实验。
41.实施例2构建头颈磷癌患者来源的肿瘤原代细胞
42.头颈鳞癌肿瘤组织在4℃条件下运输回实验室后，消毒外包装，通过无菌传递仓进入细胞房，利用无菌显微剪、显微镊进行组织分离剪碎。配制组织消化液(1mg/ml四型胶原酶，200u/ml透明质酸酶，200u/ml dnase i型酶，1
×
无酚红胰蛋白酶)，组织消化液体积约为肿瘤体积的5-10倍。
43.将剪碎的组织进行1500rpm，离心3min后，用组织消化液重悬后，加入组织解离管，放置于美天旎组织处理器，按照组织韧度选择不同分离模式进行分离。碾碎组织后，放入37℃环境内摇床上消化30-60min，其间每10min 将组织解离管进行上下摇晃，混匀组织，避免组织成团，影响消化。待消化液浑浊，无明显组织剩余时，即可终止消化。利用含10％胎牛血清的培养基中和消化，并分别通过100μm和40μm的滤网后，收集未消化团块，收集细胞悬液。1500rpm，离心3min后，若发现较多红细胞污染，可以加入1ml 红细胞裂解液，静置3min后，加入10ml pbs稀释后，1500rpm，3min离心。
44.弃去上清，添加5ml完全培养基重悬，完全培养基配方为高糖dmem 培养基：dmem/f12培养基＝3:1、胰岛素5μg/ml、两性霉素b250ng/ml、庆大霉素10μg/ml、霍乱毒素0.1nm、egf0.125ng/ml、氢化可的松25ng/ml、 rock抑制剂y-2763210μm。利用0.22μm无菌过滤器对溶液进行消毒，并在4℃下保存2个月。细胞悬液置于37℃、5％co2加湿培养箱中持续培养。成功传代5次以上仍然保持较高细胞增殖活性的即为构建成功得到肿瘤原代细胞(patient-derived cell,pdc)。构建得到的pdc用于后续体外实验开展相关验证实验。
45.实施例3药物基因组学分析预测阿法替尼对sod1低表达的头颈鳞癌具有高敏感性
46.本发明对阿法替尼进行药物基因组学分析，结果鉴定出多个特征与阿法替尼药效相关，根据生物学功能从中挑选出10个有潜力的候选药效生物标志物，如表1所示。本发明随后选取未进行过药物筛选的独立的6株肿瘤原代细胞和3株商品化细胞系组成验证细胞集合进行阿法替尼药效测试。
47.表1阿法替尼潜在药效生物标志物
48.预测标志物药物名称p值cdc34阿法替尼8.24e-06parp8阿法替尼0.000102472mmp15阿法替尼0.000109508ifne阿法替尼0.000141838map2k2阿法替尼0.000229808sod1阿法替尼0.000379786slc35a5阿法替尼0.000404167uqcrfs1阿法替尼0.000476895exoc7阿法替尼0.001760195celf1阿法替尼0.020082807
49.实验结果：如图1所示，进行阿法替尼药效测试后得到相对细胞生存曲线图，将细胞分成阿法替尼敏感组细胞(hsc3、pdc_55、pdc_54)与耐药组细胞(tu686、hn13、pdc_51、pdc_52、pdc_56、pdc_53)。
50.如图2所示，本发明随后检测在上述9株细胞中10个药效生物标志物的表达情况，10个药效生物标志物分别为slc35a5、celf1、exoc7、ifne、 papr8、sod1、uqcrfs1、cdc34、map2k2、mmp15，结果显示sod1 低表达与阿法替尼的敏感性存在显著相关性(p＜0.05)，而其他的9个药效生物标志物均不存在显著相关性，由此可见，sod1作为药效生物标志物在头颈磷癌中的应用潜力。
51.本技术中的阿法替尼购自selleck，其cas号：850140-72-6，分子式为 c
24h25
cifn5o3。
52.超氧化物歧化酶(sod)是一类酶，可催化超氧化物自由基向氧和过氧化氢的转化。sod活性取决于特定的催化金属离子，该离子可以是锰(mnsod)，铁(fesod)，镍(nisod)或铜(cu/znsod)。所有哺乳动物都具有三种亚型的超氧化物歧化酶。人类sod1是一种二聚体蛋白，32kda，其中每个单体由153个氨基酸(15.8kda)形成，其基因位于21号染色体上 (基因座21q22)。sod1负责调节由线粒体膜间空间，细胞质和过氧化物酶体引起的超氧化物水平。除了作为抗氧化剂酶外，文献报道了sod1蛋白的一些新功能，包括暴露于氧化应激后的核基因转录激活，调节rna代谢和调节葡萄糖传感途径的抑制呼吸。sod1的某些区域可能是本质上无序的，由于没有确定的有序结构，结构灵活性被认为是sod1的功能优势，它可能使该蛋白质与不同伴侣相互作用，例如其他蛋白质，膜和核酸，使sod1成为多功能蛋白。已知肿瘤细胞具有高水平的活性氧(reactive oxygen species， ros)，增加了对抗氧化剂的需求。sod1在多种癌症中过表达，其抑制作用导致乳腺癌中线粒体功能受损。sod1过表达可以激活线粒体展开的蛋白质反应(unfolded protein response，uprmt)，这是细胞保护反应的关键参与者，并保持适合肿瘤细胞的ros水平。此外，敲低或抑制sod1表达可抑制非小细胞肺癌和血液病肿瘤的生长，表明sod1过表达对于肿瘤的形成至关重要。值得注意的是，研究表明抑制sod1可诱导肿瘤细胞凋亡，这表明sod1是癌症治疗的潜在新靶标。在头颈鳞癌中，鲜少有研究揭示sod1在肿瘤发生发展及阿法替尼治疗耐药中的功能，有限的研究显示在鼻咽癌中破坏sod1 活性可抑制细胞生长并增加脂质积累。本技术验证sod1低表达在头颈磷癌中的相关性。
53.实施例4体外实验验证阿法替尼对sod1低表达头颈磷癌细胞具有更高敏感性
54.sirna设计和合成：sirna由吉玛基因生物公司合成出目的序列，具体 sirna序列见表2。
55.表2 sirna序列
56.sirnasense(5'-3')antisense(5'-3')si-sod1-1ccucacuuuaauccucuauttauagaggauuaaagugaggttsi-sod1-2cgaugugucuauugaagauttaucuucaauagacacaucgttsi-sod1-3gggcaaagguggaaaugaattuucauuuccaccuuugcccttsi-ncuucuccgaacgugucacguttacgugacacguucggagaatt
57.sirna转染：转染前一天，在孔板中每个孔内播种目的细胞，每孔放2.5ml不含抗生素的生长培养基。从细胞中去除生长培养基，加入1.5ml新鲜的不含血清的生长培养基。在250μl的无血清生长培养基中加入100pmol 小干扰rna，轻柔混匀。在250μl生长培养基中加入5μl的转染试剂进行稀释，室温下温育5min。混合前两步稀释好的小干扰rna和转染试剂，室温下温育20min。将混合物加入前一天播种的含有细胞的孔板中。在37℃培养箱中培养细
胞5-6h。更换含有血清的培养基并培养细胞24-48h，进行转染后的其它检测步骤。培养3-4天后检测蛋白表达量。
58.蛋白免疫印迹：在裂解细胞后，进行bca蛋白定量，随后加入sdsloading buffer，95℃加热10分钟变性，然后将10-50μg蛋白样品进行 sds-page电泳。电泳后将page胶上的蛋白通过转膜系统转移到pvdf膜上，分别进行一抗和二抗孵育。使用的抗体包括：anti-sod1和anti-gapdh，进而检测在头颈鳞癌中敲减sod1的敲减效率。
59.实验结果：如图3所示，相比对照组，sirna处理组的目的基因表达显著降低。
60.细胞增殖实验：将头颈鳞癌细胞以3000细胞/孔的密度接种到96孔板中，培养箱培养过夜。随后进行sirna转染，再用1μm阿法替尼进行药物处理， 72小时后用cell counting kit-8检测细胞增殖情况。
61.实验结果：如图4所示，相比于对照组细胞，在pdc_51和hn13中，阿法替尼显著抑制了sod1敲减组细胞增殖，表明sod1低表达头颈鳞癌细胞对阿法替尼更敏感。
62.实施例5体内移植瘤实验验证阿法替尼对sod1低表达的头颈鳞癌具有更高敏感性
63.选择两例头颈鳞癌pdx模型(pdx_3,pdx_9)用于评价阿法替尼对不同sod1表达水平头颈鳞癌的体内治疗效果。每个pdx模型构建16只子代模型，待肿瘤体积达到100-200mm3后选择10-16只小鼠进行分组，分别分到阿法替尼药物处理组和溶剂对照组。
64.给药方案如下：
65.①
阿法替尼药物处理组，口服，25mg/kg，溶剂为5％dmso+40％peg 300+5％tween80+50％ddh2o，每日给药。
66.②
溶剂对照组：口服，对应药物溶剂5％dmso+40％peg300+5％tween80+50％ddh2o，每日给药。
67.持续测量模型肿瘤体积及体重直到肿瘤体积达到1000-1500mm3。
68.实验结果：如图5所示，pdx_3为sod1低表达模型，表达水平为sod1 fkpm＝28.07，在pdx_3模型中阿法替尼药物处理组相比于溶剂对照组显著抑制了肿瘤生长，肿瘤明显变小。如图6所示，pdx_9为sod1高表达模型，表达水平为sod1fkpm＝170.37。在pdx_9模型中阿法替尼药物处理组相比于溶剂对照组对肿瘤生长无明显影响。说明sod1低表达的头颈磷癌异种移植瘤pdx_3对阿法替尼敏感，sod1高表达的头颈磷癌异种移植瘤pdx_9 对阿法替尼耐药。在pdx模型中，sod1fkpm低于28.07的定义为sod1 低表达。
69.一些实施例中，本发明还提供了一种用于判断头颈鳞癌患者对阿法替尼敏感性的试剂盒，该试剂盒至少包含与sod1特异性结合的抗体，可以通过检测头颈鳞癌组织中sod1的表达水平，来判断头颈磷癌对阿法替尼的敏感性。所述试剂盒选自qpcr试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、elisa试剂盒中的任意一种。
70.本发明提供了sod1作为生物标志物在制备用于提高头颈磷癌对阿法替尼的敏感性的药物中的应用，体内体外实验均证实了sod1低表达的头颈磷癌对阿法替尼具有更高的敏感性，针对sod1低表达使用sod1抑制剂与阿法替尼联合用药，可以提升头颈鳞癌对阿法替尼的治疗敏感性，在临床中可实现头颈磷癌的精准用药，从而提高阿法替尼对头颈鳞癌的治疗效果。
71.尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的
多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。