新型冠状病毒检测试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及生物，具体而言，涉及一种新型冠状病毒检测试剂盒及应用。

背景技术：

1、冠状病毒是一种囊膜的单股正链rna病毒。根据冠状病毒的遗传学进化、血清学和宿主特异性差异，冠状病毒分为四个属：α-冠状病毒属、β-冠状病毒属、γ-冠状病毒属、δ-冠状病毒属。β-冠状病毒属的病毒分为a、b、c、d四个组群。α和β冠状病毒主要感染包括人类、家畜、宠物在内的哺乳动物，γ和δ冠状病毒主要感染鸟类及哺乳动物。新型冠状病毒(sars-cov-2)属于β-冠状病毒属，从进化树位置上看，sars-cov-2与sars和类sars病毒的类群相邻，它们在进化上共同的外类群是寄生于果蝠的hku9-1冠状病毒。sars-cov-2有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径50-200nm。

2、sars-cov-2的核酸为不分节段的单股正链rna，其编码两个大的重叠开放阅读框(orf1a和orf1b)，4种结构蛋白(s、e、m和n蛋白)，以及9种辅助蛋白。其中，n蛋白(核衣壳蛋白)是病毒粒子的核心成分，其与病毒基因组rna结合，将rna包装成核糖核蛋白(rnp)复合体。n蛋白是一个磷酸化蛋白，磷酸化能够调节n蛋白的构象，增强与rna的亲和力。n蛋白相对更保守，不易发生突变；同时，n蛋白在新型冠状病毒中的表达丰度较高。因此，n蛋白常作为新型冠状病毒抗原检测试剂的靶蛋白。

3、在临床上，新型冠状病毒常用的体外诊断方法有新型冠状病毒核酸检测、新型冠状病毒抗体检测、新型冠状病毒抗原检测。其中，核酸检测具有高灵敏度，一直被作为新型冠状病毒检测的金标准，但由于核酸检测的耗时较长、检测环境苛刻、需要专业的设备与技术人员等限制了核酸检测的应用。抗原检测由于检测速度快、操作简便、准确率较高，可以成为核酸检测的补充检测手段或者替代检测手段。一般来说，抗原检测试剂检测的是样本中的新型冠状病毒n蛋白。开发新型冠状病毒抗原检测试剂盒，关键的原料是针对n蛋白的抗体。但现有技术中针对n蛋白的抗体应用于新型冠状病毒抗原检测试剂后，检测灵敏度不足、特异性不高，不能满足临床使用需求。因此需要针对新型冠状病毒抗原检测，开发出具有检测高灵敏度、高特异性的抗n蛋白抗体。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种新型冠状病毒检测试剂盒及应用，以解决现有技术中sars-cov-2抗原检测灵敏不足的问题。

2、为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种新型冠状病毒检测试剂盒，该新型冠状病毒检测试剂盒包括重组抗体，重组抗体包括第一重组抗体和/或第二重组抗体，第一重组抗体或第二重组抗体各自独立地包括fab片段和fc片段，fab片段来源于igg，fc片段来源于igm。

3、进一步地，fab片段包括sars-cov-2核衣壳蛋白抗体可变区域，sars-cov-2核衣壳蛋白抗体可变区域包括sars-cov-2核衣壳蛋白抗体轻链可变区和sars-cov-2核衣壳蛋白抗体重链可变区，第一重组抗体的sars-cov-2核衣壳蛋白抗体轻链可变区包括：seq idno：1：vl1-cdr1：sasqgirnyln；seq id no：2：vl1-cdr2：ytstihs；seq id no：3：vl1-cdr3：mqyfpskty；第一重组抗体的sars-cov-2核衣壳蛋白抗体重链可变区包括：seq id no：4：vh1-cdr1：dynmg；seq id no：5：vh1-cdr2：alipnnggtiynqkfkg；seq id no：6：vh1-cdr3：eayrdydvktwfay；第二重组抗体的sars-cov-2核衣壳蛋白抗体轻链可变区包括：seq idno：7：vl2-cdr1：qasesisnyls；seq id no：8：vl2-cdr2：gastles；seq id no：9：vl2-cdr3：qggyyssgatft；第二重组抗体的sars-cov-2核衣壳蛋白抗体重链可变区包括：seq id no：10：vh2-cdr1：syams；seq id no：11：vh2-cdr2：ilssdgntyyaswakg；seq id no：12：vh2-cdr3：ffyddyddldiiff。

4、进一步地，第一重组抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no：13所示：evllqqsgpelvnpgasvkipckasgytftdynmgwvkqshgkslewigalipnnggtiynqkfkgkatltvdessstaymelrsltsedtavyycareayrdydvktwfaywgqgtlvtvsa；第一重组抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：14所示：diqmtqttsslsaslgdrvtlscsasqgirnylnwyqqkpdgtvklliyytstihsgvpsrfsgsgsgtdysltisnlepediatyfcmqyfpsktyfgggtkleik；第二重组抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no：15所示：qsveesggrlvtpgtpltltctvsgfsissyamswvrqapgkgleyigilssdgntyyaswakgrftlsktsttvdlkitspttedtatyfcarffyddyddldiiffwgqgtlvtvss；第二重组抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：16所示：dpvmtqtpasvsgpvggtvtincqasesisnylswyqqkpgqppklliygastlesgvpsrfsgsgsgtdftltisgvqcddaatyycqggyyssgatftfgggtevvvk。

5、进一步地，fab片段为鼠源；优选地，第一重组抗体的fab片段轻链部分的氨基酸序列如seq id no：17所示：diqmtqttsslsaslgdrvtlscsasqgirnylnwyqqkpdgtvklliyytstihsgvpsrfsgsgsgtdysltisnlepediatyfcmqyfpsktyfgggtkleikradaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswtdqdskdstysmsstltltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec；第一重组抗体的fab片段重链部分的氨基酸序列如seq id no：18所示：evllqqsgpelvnpgasvkipckasgytftdynmgwvkqshgkslewigalipnnggtiynqkfkgkatltvdessstaymelrsltsedtavyycareayrdydvktwfaywgqgtlvtvsaakttppsvyplapgsaaqtnsmvtlgclvkgyfpepvtvtwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvpsstwpsetvtcnvahpasstkvdkkivprdc；第二重组抗体的fab片段轻链部分的氨基酸序列如seq id no：19所示：dpvmtqtpasvsgpvggtvtincqasesisnylswyqqkpgqppklliygastlesgvpsrfsgsgsgtdftltisgvqcddaatyycqggyyssgatftfgggtevvvkrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec；第二重组抗体的fab片段重链部分的氨基酸序列如seq id no：20所示：qsveesggrlvtpgtpltltctvsgfsissyamswvrqapgkgleyigilssdgntyyaswakgrftlsktsttvdlkitspttedtatyfcarffyddyddldiiffwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepksc。

6、进一步地，第一重组抗体的fc片段中包括a1-ch2、a1-ch3和a1-ch4，a1-ch2的氨基酸序列如seq id no：21所示：avaemnpnvnvfvpprdgfsgpaprkskliceatnftpkpitvswlkdgklvesgfttdpvtienkgstpqtykvistltiseidwlnlnvytcrvdhrgltflknvsstcaa；a1-ch3的氨基酸序列如seq id no：22所示：spstdiltftippsfadiflsksanltclvsnlatyetlniswasqsgepletkikimeshpngtfsakgvasvcvedwnnrkefvctvthrdlpspqkkfiskpn；a1-ch4的氨基酸序列如seqid no：23所示：evhkhppavyllppareqlnlresatvtclvkgfspadisvqwlqrgqllpqekyvtsapmpepgapgfyfthsiltvteeewnsgetytcvvghealphlvtertvdkstgkptlynvslimsdtggtcy。

7、进一步地，第一重组抗体的fc片段的氨基酸序列如seq id no：24所示：avaemnpnvnvfvpprdgfsgpaprkskliceatnftpkpitvswlkdgklvesgfttdpvtienkgstpqtykvistltiseidwlnlnvytcrvdhrgltflknvsstcaaspstdiltftippsfadiflsksanltclvsnlatyetlniswasqsgepletkikimeshpngtfsakgvasvcvedwnnrkefvctvthrdlpspqkkfiskpnevhkhppavyllppareqlnlresatvtclvkgfspadisvqwlqrgqllpqekyvtsapmpepgapgfyfthsiltvteeewnsgetytcvvghealphlvtertvdkstgkptlynvslimsdtggtcy；优选地，第一重组抗体的轻链全长氨基酸序列如seq id no：25所示：metglrwlllvavlkgvqcdiqmtqttsslsaslgdrvtlscsasqgirnylnwyqqkpdgtvklliyytstihsgvpsrfsgsgsgtdysltisnlepediatyfcmqyfpsktyfgggtkleikradaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswtdqdskdstysmsstltltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec；优选地，第一重组抗体的重链全长氨基酸序列如seq idno：26所示：metglrwlllvavlkgvqcevllqqsgpelvnpgasvkipckasgytftdynmgwvkqshgkslewigalipnnggtiynqkfkgkatltvdessstaymelrsltsedtavyycareayrdydvktwfaywgqgtlvtvsaakttppsvyplapgsaaqtnsmvtlgclvkgyfpepvtvtwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvpsstwpsetvtcnvahpasstkvdkkivprdcpavaemnpnvnvfvpprdgfsgpaprkskliceatnftpkpitvswlkdgklvesgfttdpvtienkgstpqtykvistltiseidwlnlnvytcrvdhrgltflknvsstcaaspstdiltftippsfadiflsksanltclvsnlatyetlniswasqsgepletkikimeshpngtfsakgvasvcvedwnnrkefvctvthrdlpspqkkfiskpnevhkhppavyllppareqlnlresatvtclvkgfspadisvqwlqrgqllpqekyvtsapmpepgapgfyfthsiltvteeewnsgetytcvvghealphlvtertvdkstgkptlynvslimsdtggtcy。

8、进一步地，第二重组抗体的fc片段中包括b1-ch2、b1-ch3和b1-ch4，b1-ch2的氨基酸序列如seq id no：27所示：viaelppkvsvfvpprdgffgnprksklicqatgfsprqiqvswlregkqvgsgvttdqvqaeakesgpttykvtstltikesdwlgqsmftcrvdhrgltfqqnassmcvp；b1-ch3的氨基酸序列如seq id no：28所示：dqdtairvfaippsfasifltkstklclvtdlttydsvtiswtrqngeavkthtniseshpnatfsavgeasiceddwnsgerftctvthtdlpsplkqtisrpk；b1-ch4的氨基酸序列如seqid no：29所示：gvalhrpdvyllppareqlnlresatitclvtgfspadvfvqwmqrgqplspekyvtsapmpepqapgryfahsiltvseeewntgetytcvvahealpnrvtertvdkstgkptlynvslvmsdtagtcy。

9、进一步地，第二重组抗体的fc片段的氨基酸序列如seq id no：30所示：viaelppkvsvfvpprdgffgnprksklicqatgfsprqiqvswlregkqvgsgvttdqvqaeakesgpttykvtstltikesdwlgqsmftcrvdhrgltfqqnassmcvpdqdtairvfaippsfasifltkstklclvtdlttydsvtiswtrqngeavkthtniseshpnatfsavgeasiceddwnsgerftctvthtdlpsplkqtisrpkgvalhrpdvyllppareqlnlresatitclvtgfspadvfvqwmqrgqplspekyvtsapmpepqapgryfahsiltvseeewntgetytcvvahealpnrvtertvdkstgkptlynvslvmsdtagtcy；优选地，第二重组抗体的轻链全长氨基酸序列如seq id no：31所示：metglrwlllvavlkgvqcdpvmtqtpasvsgpvggtvtincqasesisnylswyqqkpgqppklliygastlesgvpsrfsgsgsgtdftltisgvqcddaatyycqggyyssgatftfgggtevvvkrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec；优选地，第二重组抗体的重链全长氨基酸序列如seq idno：32所示：metglrwlllvavlkgvqcqsveesggrlvtpgtpltltctvsgfsissyamswvrqapgkgleyigilssdgntyyaswakgrftlsktsttvdlkitspttedtatyfcarffyddyddldiiffwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepksclpviaelppkvsvfvpprdgffgnprksklicqatgfsprqiqvswlregkqvgsgvttdqvqaeakesgpttykvtstltikesdwlgqsmftcrvdhrgltfqqnassmcvpdqdtairvfaippsfasifltkstklclvtdlttydsvtiswtrqngeavkthtniseshpnatfsavgeasiceddwnsgerftctvthtdlpsplkqtisrpkgvalhrpdvyllppareqlnlresatitclvtgfspadvfvqwmqrgqplspekyvtsapmpepqapgryfahsiltvseeewntgetytcvvahealpnrvtertvdkstgkptlynvslvmsdtagtcy。

10、为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种核衣壳蛋白重组抗体，该重组抗体包括上述新型冠状病毒检测试剂盒中的第一重组抗体或第二重组抗体。

11、为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种重组抗体对，该重组抗体对包括：上述新型冠状病毒检测试剂盒中的第一重组抗体或第二重组抗体，和不同于第一重组抗体或第二重组抗体且与sars-cov-2特异性结合的抗体；优选地，重组抗体对包括第一重组抗体和第二重组抗体。

12、为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种核酸分子，该核酸分子编码上述核衣壳蛋白重组抗体。

13、为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种核酸载体，该核酸载体含有上述核酸分子，核酸载体包括表达盒、重组载体、重组菌、或重组病毒。

14、为了实现上述目的，根据本发明的第六个方面，提供了一种新型冠状病毒检测试剂盒、或核衣壳蛋白重组抗体、或重组抗体对在制备sars-cov-2病毒抗原检测试剂或试剂盒中的应用。

15、为了实现上述目的，根据本发明的第七个方面，提供了一种体外检测新冠抗原的检测方法，该检测方法步骤为：获取受试者的生物样本，生物样本选自血液、血浆、血清、口腔、喉咙和鼻子冲洗液、支气管肺泡灌洗液、痰、唾液、粪便或组织等。将受试者的生物样本同时或分别与第一重组抗体和第二重组抗体反应，通过检测形成第一重组抗体-抗原-第二重组抗体三元复合物的信号，实现抗原定量/定性测定。

16、应用本发明的技术方案，利用第一重组抗体和/或b1制备的新型冠状病毒检测试剂盒，相较于利用现有技术中其他针对于sars-cov-2病毒的重组抗体，具有更好的灵敏度和特异性，能够更准确的对待测样本进行鉴定。