一种利用农作物秸秆固定化微生物菌种发酵生产丁二酸的方法与流程

本发明属于微生物发酵工程，具体涉及一种利用农作物秸秆固定化微生物菌种发酵生产丁二酸的方法。

背景技术：

1、丁二酸，又称琥珀酸，是一种重要的化工原料及中间体。作为一种优秀的c4平台化合物，在食品、化学、医药工业等领域有着广泛的应用，可以取代很多基于苯和石化中间产物的商品，如可用于合成聚丁二酸丁二醇酯(poly butylene succinate,pbs)、聚丁二酸己二醇酯(poly hexylene succinate,phs)等新型生物可降解原料，市场潜在需求量非常大，应用前景十分广阔。

2、目前，丁二酸的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法。化学合成法，由于环境污染大、生产成本高、操作条件复杂、石化资源日益枯竭等原因，化学合成的生产方法受到严重的限制；而利用微生物发酵法生产丁二酸，具有污染小、成本低、环境友好等优势，且在发酵过程中可以固定利用气体co2，在一定程度上可以减缓温室效应。因此，开发高效的微生物发酵生产丁二酸的方法具有十分重要的环境与经济效益。

3、微生物发酵法生产丁二酸，由于具有发酵产物抑制菌体生长、菌种耐高渗能力差、后分离工艺困难等因素，往往会限制微生物的发酵产酸水平。如何解决产物的反馈抑制、保持高产菌种的活性是当前的研究难题，细胞固定化是解决该问题的一种重要手段。

4、cn107164416a、cn103436561b、cn103642854b等公开了纺布、棉纤维等载体吸附菌液的固定化方法，固定化的菌种分别是产琥珀酸放线杆菌和谷氨酸棒杆菌，产酸和转化率均不是很高，可能由于菌体与载体之间吸附不牢固，容易出现脱落，而且长时间受到发酵液中较高丁二酸浓度渗透压的影响，菌体活力会不断下降。

5、然而，利用包埋或者吸附方法制备的固定化细胞经常存在固定化细胞活性弱、包埋细胞渗漏或者吸附菌体不牢固容易脱落、传质效果差等缺点，因此，开发一种较好的细胞固定化方法尤为关键，尤其对传质要求较高的丁二酸发酵应用具有必要的指导意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种利用农作物秸秆固定化微生物菌种发酵生产丁二酸的方法，可以保持较好的菌种活力、提升丁二酸发酵产量，解决产物抑制以及固定化菌体泄漏等问题。

2、为达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

3、一种利用农作物秸秆固定化微生物菌种发酵生产丁二酸的方法，包括如下步骤：

4、1)秸秆的预处理与变性：将农作物秸秆预处理后加入有机酸进行变性处理；

5、2)秸秆吸附菌体：在变性处理好的秸秆中加入生物黏合剂，然后加入培养好的微生物菌种菌悬液和无菌水，在摇床上培养，让菌体与秸秆充分吸附连接；

6、3)固定化菌种细胞微球的制备：先称取载体和致孔剂并溶解灭菌，冷却后加入步骤2)吸附菌液后的秸秆和引发剂，混匀后进行固定化，再滴加到盛有硫酸盐溶液的容器中，待交联成球后，将硫酸盐溶液滤干，优选最后再加入磷酸盐溶液继续搅拌1～10小时，以促进进一步交联，保证载体材料能够交联充分，固定化微球更牢固；优选地，所述载体选自聚乙烯醇(pva)、海藻酸钠、氯化钙、聚乙二醇、聚乙烯亚胺中的任一种，优选为聚乙烯醇；所述致孔剂选自聚二烯吡咯烷酮；所述引发剂选自聚二烯丙基甲基氯化铵、过硫酸铵、过硫酸钾、偶氮二异丁酸二甲酯中的任一种，优选为聚二烯丙基甲基氯化铵；

7、4)固定化微球的改性：将步骤3)中的固定化微球滤干后，用无菌水清洗，再加入助流剂、无水乙醇及表面活性剂，超声分散后过滤、干燥得到表面改性的固定化菌种细胞微球；

8、5)固定化发酵：将步骤4)表面改性的固定化菌种细胞微球输入到含有无菌液体发酵培养基的发酵罐中，进行固定化发酵，发酵过程通二氧化碳气体用中和剂控制ph为5～8，不断搅拌，间歇补糖，发酵得到丁二酸，发酵结束后去掉发酵液分离得到固定化微球循环回用。

9、在一个具体的实施方案中，步骤1)中所述的农作物秸秆选自玉米、黄瓜、芝麻、番茄、小麦、大豆的秸秆中的至少任一种，优选为黄瓜和/或小麦的秸秆，更优选为小麦秸秆；

10、优选地，所述有机酸选自丁二酸、柠檬酸、苹果酸、乙酸、甲酸中的任一种，优选为丁二酸；

11、优选地，步骤1)为：将农作物秸秆粉碎后过1～10mm筛，按质量比称取预处理后的秸秆1～10％，丁二酸0.1～10％和磷酸二氢钠0.1～1％置于容器中，加入余量的去离子水，超声震荡1～60min，50～130℃高压锅煮沸0.1～10小时，待充分溶解后，再放入到烘箱中105～180℃条件下加热1～10h，冷却后，用去离子水浸洗，抽滤并冲洗至中性，最后放入烘箱中30～100℃烘干，备用。

12、在一个具体的实施方案中，所述的固定化微生物菌种为大肠杆菌、产琥珀酸放线杆菌、谷氨酸棒杆菌、酵母菌中的任意一种或几种，优选为大肠杆菌；

13、优选地，大肠杆菌菌悬液采用如下方法制备：从平板培养基中挑取一个生长良好的大肠杆菌单菌落接种于20～100ml lb液体培养基中，在30℃～40℃、150～200rpm的恒温摇床中振荡培养6～18h，按体积分数0.1％-5％接种到种子培养基中，同样条件下培养15～20h，使菌种处于对数生长期后期，作为菌悬液备用；

14、更优选地，所述平板培养基为：酵母浸粉1～10g/l、蛋白胨5～20g/l、氯化钠1～20g/l、琼脂5～30g/l；

15、所述lb液体培养基为：酵母浸粉1～10g/l、蛋白胨5～20g/l、氯化钠1～20g/l；

16、所述种子培养基为：葡萄糖1～10g/l、氯化铵1～10g/l、酵母浸粉0.1～5g/l、磷酸氢二钾1～10g/l、七水硫酸镁0.1～10g/l、硫酸亚铁0.1～10g/l、硫酸锰0.1～5g/l、硫酸铜0.1～5g/l。

17、在一个具体的实施方案中，所述的生物黏合剂为可溶性淀粉和酪蛋白，两者的质量比为1：5～1：1，优选为1：1；

18、优选地，步骤2)中变性处理好的秸秆占整个秸秆吸附菌体体系的质量比例为1～10％，优选为1.5～2.5％，更优选为2.5％，生物黏合剂的质量占比为0.1～2％，更优选为0.4％，菌悬液的质量占比为80～90％，余量为无菌水；

19、更优选地，步骤2)为：称取步骤1)变性处理好的秸秆中加入可溶性淀粉、酪蛋白，30～80℃温度下加热溶解，待冷却后加入培养好的微生物菌种菌悬液，再加入适量的无菌水，在摇床上30～40℃、100～200rpm培养2～15h，让菌体与秸秆充分吸附连接。

20、在一个具体的实施方案中，步骤3)为：称取1～10％pva和0.01～10％聚二烯吡咯烷酮100～130℃溶解灭菌，冷却至15～50℃左右时再加入吸附菌液后的秸秆和0.01～10％聚二烯丙基甲基氯化铵，用无菌水补至100％混匀后进行固定化，采用蠕动泵，从10～30cm高处将其缓慢匀速滴加到磁力搅拌器上的盛有1～15％硫酸盐溶液的容器中，待交联成球1～10个小时后，将硫酸盐溶液滤干，优选最后加入1～10％磷酸盐溶液继续搅拌1～10小时以上，停止搅拌。

21、优选地，所述的硫酸盐选自硫酸钠、硫酸钾、硫酸锌、硫酸铵、硫酸镁中的任一种或几种，优选为硫酸钾；

22、优选地，所述的磷酸盐选自磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠中的任一种或几种，优选为磷酸二氢钾。

23、在一个具体的实施方案中，所述步骤4)中助流剂选自sio2颗粒、滑石粉、硬脂酸镁中的任一种，优选为sio2颗粒，更优选为微米级sio2颗粒；其中的二氧化硅颗粒等的作用是助流剂，便于固定化微球滚动，增大微球与表面活性剂的接触面积。表面活性剂选自聚二甲基硅氧烷、吐温80、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、月桂酰谷氨酸中的任一种，优选为聚二甲基硅氧烷。

24、优选地，步骤4)为：将步骤3)中的固定化微球滤干磷酸盐溶液，用无菌水清洗3～6次，取固定化微球改性体系质量占比20～50％的固定化微球，加入sio2颗粒0.1～10％，10～60％无水乙醇及聚二甲基硅氧烷1～50％添加至容器中，将该容器用超声波清洗器分散5～100min，将分散后的混合物倒入布氏漏斗中过滤10～100min，再放入30～100℃鼓风干燥箱中干燥0.1～2h，得到表面改性的固定化菌种细胞微球。

25、在一个具体的实施方案中，步骤5)为：将步骤4)改性好的固定化菌种细胞微球无菌输入到发酵罐中，发酵罐中含有10～30倍固定化微球体积的液体发酵培养基，控制罐内温度30～40℃，固定化发酵过程用中和剂碳酸盐控制ph为5～8，搅拌转速100～1000rpm，发酵期间通二氧化碳气体，0.2～1vvm，罐压维持在0.01～1mpa，初始葡萄糖10～100g/l，当残糖浓度耗至0～20g/l时，间歇补糖至5～100g/l，发酵40～100h，发酵结束后，去掉发酵液分离得到固定化微球循环回用。

26、在一个具体的实施方案中，所述的发酵培养基为：葡萄糖10～80g/l、玉米浆5～20g/l、氯化铵1～10g/l、磷酸氢二钾0.1～10g/l、磷酸二氢钾0.1～10g/l、七水硫酸镁0.1～5g/l、硫酸亚铁0.01～5g/l、硫酸锰0.01～1g/l、氯化锌0.1～1g/l、硫酸铜0.1～5g/l，溶剂为水，ph 6.8～7.2。

27、在一个具体的实施方案中，固定化发酵过程中所用的中和剂选自碳酸镁、碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸铵中的任一种或者几种，优选为碳酸铵。

28、在一个具体的实施方案中，发酵结束后，去掉发酵液，然后加入新鲜的无菌培养基，重复步骤5)的单批次固定化发酵生产丁二酸的步骤，如此循环，即可利用固定化菌种细胞微球实现丁二酸的多批次固定化发酵生产。

29、本发明利用农作物秸秆固定化微生物菌种发酵生产丁二酸的方法，与现有的技术相比，所取得的积极效果如下：

30、(1)菌体不易脱落，便于产物分离：改性好的秸秆吸附菌液能力强，且用无毒生物胶黏剂增强了菌液与秸秆的吸附连接效果，减少了固定化包埋过程中的菌体渗漏，便于后期的发酵产物分离。

31、(2)固定化效果好：固定化过程中所用pva-硫酸盐-聚二烯吡咯烷酮减少了交联剂对菌体活力的损伤，形成的共价结构更稳定，固定化微球结实，机械性强，传质性好，菌种活力维持时间长。

32、(3)提高丁二酸发酵产量：固定化微球变性后，通透性更好，便于丁二酸发酵中所需要的二氧化碳气体传送，解决了产物抑制现象，提高了丁二酸发酵产量，由游离细胞发酵的50g/l，提高至90g/l左右，产量提高了80％，丁二酸发酵生产强度由0.8g/l/h提高至1.5g/l/h。

33、(4)发酵工艺稳定性好：利用本发明的固定化大肠杆菌重复发酵生产丁二酸，丁二酸的批次发酵稳定，最优重复发酵20批次时仍能保持较高的丁二酸生产效率，平均每个批次丁二酸发酵产量90g/l左右。

34、(5)生产效率高：利用本发明的固定化大肠杆菌重复发酵生产丁二酸，只需要更换发酵培养基，进行厌氧发酵，节省了反复洗罐、灭菌、接种、好氧阶段菌体生长等操作，生产效率高。

35、(6)连续多批次发酵使用后的固定化载体可以继续回收利用，降低了生产成本。