一种3’mRNA测序文库的构建方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种3’mrna测序文库的构建方法。

背景技术：

1、随着mrna测序的快速发展，它逐渐成为了研究转录组学的标准方法。通过基于高通量的测序获取样品中的mrna的信息，科学家们可以分析给定不同时期样本中转录组的表达情况及其随时间的变化情况。随着技术的更新，构建mrna测序文库的价格与复杂程度在不断的降低，然而一般mrna文库的构建仍然需要较长的操作时间，复杂的操作步骤，大量的测序数据处理和分析。在此基础上，近年开发的quant-seq通过对mrna的3’端临近poly(a)尾附近的序列进行建库测序。大大减少了建库的步骤与耗时，且适用于分析转录本的可变多腺苷酸化(alternative polyadenylation,apa)。其方法主要是通过寡链dt引物结合mrna末端的poly(a)引导反转录，以及随机寡链引物引导的二链合成，为目标样本片段引入适配体(adaptors)，并通过后续扩增来富集目标文库进行二代测序。

2、现有的3’mrna测序技术主要问题在于繁琐的建库步骤。mrna的富集，mrna打断，一链二链cdna合成，适配体连接，文库扩增与纯化等步骤使用试剂较多，操作繁多且耗时。

技术实现思路

1、本发明的主要目的是提供一种3’mrna测序文库的构建方法，旨在提供一种快速建库且富集程度高的3’mrna测序文库的构建方法。

2、为实现上述目的，本发明提供一种3’mrna测序文库的构建方法，所述3’mrna测序文库的构建方法包括以下步骤：

3、提供目标rna；

4、构建逆转录体系，对所述目标rna进行逆转录，得到mrna-cdna杂合链，其中，所述逆转录体系包括逆转录酶和逆转录引物，所述逆转录引物包括接头1和逆转录序列；

5、往经过所述逆转录的所述逆转录体系中，加入转座酶，转座反应后，得到多个接头mrna-cdna杂合链片段，其中，所述转座酶具有接头2；

6、将多个所述接头mrna-cdna杂合链片段中的rna降解，得到多个cdna链；

7、采用扩增引物对多个所述cdna链进行扩增后，得到所述3’mrna测序文库，其中，所述扩增引物包括标记引物2和标记引物1，所述标记引物1包括依次连接的扩增序列1、标记序列1及接头1’，所述标记引物2包括依次连接的扩增序列2、标记序列2及接头2’，所述接头1’可与所述接头1形成双链，所述接头2’可与所述接头2形成双链，且所述标记序列1与所述标记序列2不同。

8、可选地，所述逆转录序列为(dt)n，其中n为16～30；和/或，

9、所述转座酶为由两个聚合单元构成，且每个所述聚合单元为连接有连接序列的t5转座酶，所述连接序列包括所述接头2。

10、可选地，所述逆转录体系包括逆转录缓冲液和dntps。

11、可选地，所述往经过所述逆转录的所述逆转录体系中，加入转座酶，转座反应后，得到多个接头mrna-cdna杂合链的步骤之前，还包括：

12、将t5转座酶与接头序列混合，加入缓冲液，进行偶联反应后，得到所述转座酶，其中，所述接头序列包括与所述接头2序列一致的粘性末端。

13、可选地，所述将t5转座酶与接头序列混合，加入缓冲液，进行偶联反应后，得到所述转座酶的步骤之前还包括：

14、将引物1与引物2混合后，进行退火反应后，得到接头序列，其中，所述引物1的序列如seq.id.no：2所示，且所述引物1的5’端连接有标记基团，3’端连接有氨基，所述引物2的序列如seq.id.no：1所示。

15、可选地，所述将多个所述接头mrna-cdna杂合链片段中的rna降解，得到多个cdna链的步骤包括：

16、将螯合剂加入多个所述接头mrna-cdna杂合链中，在60℃～60℃下反应，采用dna回收纯化柱子回收cdna，得到多个所述cdna链。

17、可选地，所述扩增序列1的序列如seq.id.no：3所示，所述标记序列1为任意序列，所述接头1’如seq.id.no：4所示；和/或，

18、所述扩增序列2的序列如seq.id.no：5所示，所述标记序列2为任意序列，所述接头2’如seq.id.no：6所示；

19、可选地，所述扩增引物还包括扩增短引物1和扩增短引物2，其中，扩增短引物1的序列与所述扩增序列1相同，所述扩增短引物2的序列与所述扩增序列2相同。

20、可选地，所述采用扩增引物对多个所述cdna链进行扩增后，得到所述3’mrna测序文库的步骤包括：

21、所述采用扩增引物对多个所述cdna链进行扩增，得到扩增产物；

22、将所述扩增产物采用磁珠法进行纯化和回收，得到所述3’mrna测序文库。

23、在本发明中，通过采用转座酶将杂合链快速碎片化并连接接头，用以后续标记序列的连接，操作便捷快速；同时，将转座酶与逆转录反应体系混合反应，利用没有失活的逆转录酶将碎片化的杂合链补平，省略了传统的补平步骤，以此在保证富集程度的同时进一步提高建库效率。

技术特征：

1.一种3’mrna测序文库的构建方法，其特征在于，所述3’mrna测序文库的构建方法包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种3’mrna测序文库的构建方法，其特征在于，所述逆转录序列为(dt)n，其中n为16～30；和/或，

3.如权利要求1所述的一种3’mrna测序文库的构建方法，其特征在于，所述逆转录体系还包括逆转录缓冲液和dntps。

4.如权利要求1所述的一种3’mrna测序文库的构建方法，其特征在于，所述往经过所述逆转录的所述逆转录体系中，加入转座酶，转座反应后，得到多个接头mrna-cdna杂合链片段的步骤之前，还包括：

5.如权利要求4所述的一种3’mrna测序文库的构建方法，其特征在于，所述将t5转座酶与接头序列混合，加入缓冲液，进行偶联反应后，得到所述转座酶的步骤之前还包括：

6.如权利要求1所述的一种3’mrna测序文库的构建方法，其特征在于，所述将多个所述接头mrna-cdna杂合链中的rna降解，得到多个cdna链的步骤包括：

7.如权利要求1所述的一种3’mrna测序文库的构建方法，其特征在于，所述扩增序列1的序列如seq.id.no：3所示，所述标记序列1为任意序列，所述接头1’如seq.id.no：4所示；和/或，

8.如权利要求1所述的一种3’mrna测序文库的构建方法，其特征在于，所述扩增引物还包括扩增短引物1和扩增短引物2，其中，所述扩增短引物1的序列与所述扩增序列1相同，所述扩增短引物2的序列与所述扩增序列2相同。

9.如权利要求1所述的一种3’mrna测序文库的构建方法，其特征在于，所述采用扩增引物对多个所述cdna链进行扩增后，得到所述3’mrna测序文库的步骤包括：

技术总结
本发明提供一种3’mRNA测序文库的构建方法，包括以下步骤：提供目标RNA；构建逆转录体系，对所述目标RNA进行逆转录，得到mRNA‑cDNA杂合链；往经过所述逆转录的所述逆转录体系中，加入转座酶，转座反应后，得到多个接头mRNA‑cDNA杂合链片段；将多个所述接头mRNA‑cDNA杂合链中的RNA降解，得到多个cDNA链；采用扩增引物对多个所述cDNA链进行扩增后，得到所述3’mRNA测序文库。在本发明中，通过采用转座酶将杂合链快速碎片化并连接接头，用以后续标记序列的连接，操作便捷快速；同时，将转座酶与逆转录反应体系混合反应，利用没有失活的逆转录酶将碎片化的杂合链补平，省略了传统的补平步骤，以此在保证富集程度的同时进一步提高建库效率。

技术研发人员：崔欢欢,陈炜,甘迪文
受保护的技术使用者：南方科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12