一种肿瘤抗原特异性TCR序列的筛选方法

本发明涉及生物检测，特别涉及一种肿瘤抗原特异性tcr序列的筛选方法。

背景技术：

1、近年来，阻断针对细胞毒性t淋巴细胞相关抗原-4(ctla-4)、程序性死亡-1(pd-1)和程序性死亡配体-1(pd-l1)的单克隆抗体可以恢复预先存在的抗癌免疫，并在各种类型的实体肿瘤中获得持久的临床反应。这些免疫检查点抑制剂的成功证明了恶性肿瘤患者存在抗癌免疫。另一方面肿瘤浸润t细胞（til）与预后相关性研究指出，cd8毒性til与cd4辅助til都显著提高了癌症的总生存率。这些研究指出了肿瘤的免疫治疗具有巨大的潜在价值。

2、然而，并非所有的肿瘤对检查点阻断治疗都能有好的响应效果，例如乳腺癌。与高免疫原性的癌症（如黑色素瘤和非小细胞肺癌）相比，乳腺癌的肿瘤突变负荷较低及其免疫原性较差。单纯的免疫检查点阻断治疗，并不能获得广泛的疗效。三阴性乳腺癌（tnbc），作为免疫源性最高的乳腺癌亚型，常作为免疫检查点阻断治疗的对象。多个临床研究表明，免疫检查点阻断转移性tnbc的客观缓解率（orr,objective response rate）均介于4.7%-24%，其orr高低取决于pd-l1的表达量、一线或者二线治疗以及淋巴细胞浸润程度。总体而言，其响应率都较低。对于一线治疗及pd-l1阳性的tnbc患者，免疫检查点阻断治疗才显得有效。故乳腺癌患者接受免疫检查点阻断治疗的受众非常局限。

3、免疫检查点阻断治疗从细胞学机制上讲，可扭转毒性cd8+t淋巴细胞耗竭，增强其效应功能，从而达到杀伤肿瘤的作用。但是同时也有研究指出，t细胞的耗竭可通过多个机制达成，单一阻断pd-1仍会激活其他机制，同样导致t细胞的耗竭。从另一方面讲，cd4+调节性t细胞（treg）的功能也有可能被上调。已有研究指出pd-1的阻断可增强treg的功能，从而限制cd8+t细胞的功能，导致肿瘤进展。临床研究中，还有观察到阻断pd-1可导致肿瘤超进展（tumor hyper-progression）的情况，尤其在年龄大于65岁的患者中出现的频率较高。故单纯的免疫检查点阻断，很多情况下可能无法达到很好的治疗效果。

4、近年来，t细胞受体基因修饰t细胞（tcr-t）的治疗方法被广泛关注。而tcr-t在实体瘤中展现了一些特有的优势，其中包括：1）通过mhc的提呈，tcr-t细胞可以识别胞内和细胞表面蛋白，尤其是突变后被mhc提呈的蛋白片段，而car-t细胞只能识别细胞表面蛋白，这使得tcr-t识别肿瘤细胞具有更高的特异性与灵敏度；2）因为它保留了所有tcr信号转导通路的辅助分子，当有少量抗原存在时，tcr-t细胞可完全激活，产生杀伤作用；3）tcr可以识别肿瘤细胞内部分子，而对tcr进行基因编辑可提高对肿瘤细胞的亲和力；4）结合近年来高速发展的高通量单细胞技术，可以实现多靶点识别，降低由于靶点单一而导致的肿瘤复发率；5）若利用患者自体tcr序列，如参与外周循环及淋巴循环的tcr，实施个性化tcr-t治疗，则可以避免对正常细胞的杀伤副作用。

5、目前，人们对肿瘤特异tcr的认识还非常不足。大多数临床tcr-t试验是人类白细胞抗原（hla-）a1和a2限制的，直接针对分化、癌胚或癌种系抗原。总的来说，这些试验已经证明转移性黑色素瘤、结直肠癌和滑膜肉瘤患者有显著的临床反应。这种tcr-t治疗一般先确定肿瘤抗原，或依靠癌细胞种系，或预测肿瘤新抗原，通过亲和力计算及体外试验确定tcr序列，以应对具有相似情况的多个患者。但实际上，患者多样化，肿瘤异质性高，而这种tcr-t并不具有以不变应万变的能力，所以适合该方法治疗的患者并不多。

6、近年来，随着对肿瘤微环境的不断探索，及单细胞多组学的发展，使得个性化定制肿瘤患者的tcr-t治疗成为了可能。其原理是从患者自身寻找肿瘤特异t细胞，人工合成其tcr序列，并插入该患者外周血杀伤性t细胞中，使得外周血t细胞具有杀伤肿瘤的能力，经过体外扩增后回输给患者以杀伤肿瘤。通过批量合成多条序列，还可以达到多靶点杀伤肿瘤的效果。

7、但是，个性化tcr-t的治疗方法还存在一些问题，例如需首先获取肿瘤抗原，再获取肿瘤特异t细胞，技术步骤繁琐易出错，且无法获得表达该tcr的细胞属于何种状态、何种亚群以及表达何种效应因子，其肿瘤反应性也无法得知，故不利于对tcr序列应用于tcr-t的有效性的评估。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种肿瘤抗原特异性tcr序列的筛选方法，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。

2、本发明的一方面在于提供了一种肿瘤抗原特异性tcr序列的筛选方法。所述筛选方法包括以下步骤：

3、（1）获取同源的肿瘤组织和转移淋巴结组织；

4、（2）使用肿瘤组织制备单细胞悬液，进行转录组建库、vdj建库及测序，从测序结果中选取克隆频率>0.5%的cd8+t细胞的tcr序列作为第一备选tcr序列集合；

5、（3）使用转移淋巴结组织制备单细胞悬液，进行转录组建库、vdj建库及测序，从测序结果中选取克隆频率>0.5%的cd8+t细胞的tcr序列作为第二备选tcr序列集合；

6、（4）同时满足第一备选tcr序列集合和第二备选tcr序列集合的即为所述肿瘤抗原特异性tcr序列。

7、步骤（2）和（3）可以同时实施，也可以交换实施顺序。

8、基于单细胞测序获得肿瘤特异tcr的方法，由于肿瘤组织中存在非特异扩增的效应cd8+t细胞，很难从细胞转录组特征上区分肿瘤特异与旁观者（bystander）效应t细胞。单单利用肿瘤组织难以筛选出准确的靶向肿瘤的tcr序列，因此本筛选方法同时还以转移淋巴结组织进行测序。同源的肿瘤组织和转移淋巴结组织位点都出现了相同的抗原，才能导致具有相同的t细胞克隆增殖。那么靶向这种抗原的tcr序列，是可以同时靶向转移灶与原发灶的肿瘤细胞，可降低由于肿瘤异质性，尤其是易转移肿瘤细胞与原发灶肿瘤细胞异质性而导致的脱靶效应。

9、在一些实施方式中，所述转移淋巴结组织或肿瘤组织的获取步骤包括：

10、a)组织破碎成组织块；优选地，所述组织经过反复冲洗后剪碎成组织块；优选地，所述组织块的体积为1~2mm3；

11、b)使用组织消化液消化所述组织块；优选地，向组织块加入组织消化液，混匀，摇床消化；优选地，所述摇床消化是35~40℃摇床中消化1~2小时；

12、c)终止消化，将消化处理后的组织液以70μm的筛网过滤至新的离心管中，离心，弃去上清液；

13、d)用平衡盐溶液洗涤，弃上清，加入培养液重悬细胞；优选地，所述洗涤次数至少两次。

14、在一些实施方式中，步骤b)所述组织消化液包括i型胶原酶、dna酶和rpmi1640培养基；优选地，所述组织消化液包括10~50 mg i型胶原酶、10~50 μl浓度为10 mg/ml的dna酶、10~50 mlrpmi1640培养基；优选地，所述组织消化液包括20 mg i型胶原酶、10 μl浓度为10 mg/ml的dna酶、10 ml含l-谷氨酰胺的rpmi1640培养基。

15、在一些实施方式中，步骤c)所述离心的条件为1500~2300 rpm，持续5~10 min；优选地，所述离心的条件为1800 rpm，持续8 min，离心机离心上升速率设置为7，下降速率设置为4，常温。

16、在一些实施方式中，步骤d)所述培养液为添加了抗生素的完全rpmi1640培养基，所述抗生素包括青霉素和/或链霉素。

17、在一些实施方式中，制得的所述单细胞悬液先经过细胞分选磁珠去除死亡细胞。

18、在一些实施方式中，获取第一备选tcr序列集合或第二备选tcr序列集合的步骤包括：

19、a)测序后获得fastq文件，把fastq数据转换成细胞-基因的表达矩阵以及获得细胞对应的tcr序列；

20、b)利用seurat软件的sctransform方法标准化并整合各样本的数据；

21、c)利用seurat软件的细胞聚类方法进行细胞分群；

22、d)筛选克隆频率>0.5%的cd8+t细胞，获得其α链与β链的tcr序列，。

23、所述克隆频率的计算公式为：克隆频率=单一t细胞克隆数量/总t细胞克隆数量。

24、上述肿瘤抗原特异性tcr序列的筛选方法可应用于肿瘤抗原筛选、疫苗制备等场合。

25、本公开的有益效果是：提供了一种肿瘤抗原特异性tcr序列的筛选方法，所述方法针对每例患者，在其肿瘤抗原未知的情况下，筛选出其肿瘤抗原特异性tcr序列，通过人工合成该肿瘤抗原特异性tcr的片段并插入患者外周血杀伤性t细胞中，使得外周血t细胞具有杀伤肿瘤的能力，经过体外扩增后回输给患者以杀伤肿瘤。